微生物的生长及其控制用.ppt

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1、微 生 物 的 生长 及 其 控 制,第 六 章,教学时数：6学时教学目的与要求：要求学生了解食品中微生物控制的原理，理解常见化学杀菌剂和抑菌剂的作用机理与使用特点，掌握微生物的生长规律，影响食品中微生物生长的主要因素；食品中微生物控制的基本策略，灭菌、消毒、防腐等的异同。本章重点和难点：微生物的生长规律，影响食品中微生物生长的主要因素，食品中微生物控制的基本策略，灭菌、消毒、防腐等的异同。,本章主要参考文献,1江汉湖主编：食品微生物学，中国农业出版社，2005年8月第2版。2M.T.马迪根，J.M.马丁可，J.帕克著美.杨文博译.微生物学.北京：科学出版社，2001.3周德庆.微生物学教程.

2、北京:高等教育出版社，1993.,生物个体由小到大的增长，即表现为细胞组分与结构在量方面的增加,生长,指生物个体数目的增加,繁殖,在单细胞微生物中，生长繁殖的速度很快，而且两者始终交替进行，个体生长与繁殖的界限难以划清，因此实际上用群体生长作为衡量微生物生长的指标。,群体生长的实质是包含着个体细胞生长与繁殖交替进行的过程,测定微生物生长繁殖的方法微生物培养法概论微生物的生长规律影响微生物生长的主要环境因素有害微生物的控制,内容提要,测生长量,计繁殖数,测定生长繁殖的方法,微生物的纯培养,纯培养的分离方法,稀释倒平板法,平板划线法,选择培养基分离法,单细胞挑取法,稀释倒平板法,平板划线分离法,用

3、接种环以菌操作沾取少许待分离的材料，在无菌平板表面进行平行划线、扇形划线或其他形式的连续划线，如果划线适宜的话，微生物能一一分散，经培养后，可在平板表面得到单菌落。,3.单孢子或单细胞分离法,采取显微分离法从混杂群体中直接分离单个细胞或单个个体进行培养以获得纯培养。,在显微镜下使用单孢子分离器进行机械操作，挑取单孢子或单细胞进行培养。也可以采用特制的毛细管在载玻片的琼脂涂层上选取单孢子并切割下来，然后移到合适的培养基进行培养。,选择培养基分离法,1.dilute sample,1 ml,9 ml,10 100 1000 104 105 106 107,各种微生物对不同的化学试剂、染料、抗生素等

4、具有不同的抵抗能力，利用这些特性可配制合适某种微生物而限制其它微生物生长的选择培养基，用它来培养微生物以获得纯培养。,微生物纯培养分离方法的比较,其他生理指标,含N量法,DNA/RNA法,菌体内重要组成测定法,称重量法,N6.25=Pr,比 浊 法,重量法,通过样品中蛋白质、核酸含量的测定间接推算微生物群体的生物量；,测定多细胞及丝状真菌生长情况的有效方法,以干重、湿重直接衡量微生物群体的生物量；,比 浊 法,测生长量(间接法),计繁殖数,直接计数法,平板菌落计数法,滤膜培养法,直接计数法,a.直接法,利用血球计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。,缺点：不能区分死菌与活菌；不适

5、于对运动细菌的计数；需要相对高的细菌浓度；个体小的细菌在显微镜下难以观察；,b.简接法,原理是每个活细菌在适宜的培养基和良好的生长条件下可以通过生长形成菌落。,微生物的连续培养,微生物的生长规律,微生物的个体生长和同步生长,单细胞微生物的典型生长曲线,微生物的高密度培养,1.概念,同步培养(synchronous culture)：是一种培养方法，它能使群体中不同步的细胞转变成能同时进行生长或分裂的群体细胞。,同步生长：以同步培养方法使群体细胞能处于同一生长阶段，并同时进行分裂的生长方式,同步培养物常被用来研究在单个细胞上难以研究的生理与遗传特性和作为工业发酵的种子，它是一种理想的材料。,同步

6、培养(synchronous culture),同步培养方法,选择法,诱导法,离心方法,过滤分离法,硝酸纤维素滤膜法,温度,培养基成份控制,光照和黑暗交替培养,硝酸纤维素滤膜法,离心法,一、细菌群体生长规律,在不补充营养物质或移去培养物，保持整个培养液体积不变条件下，以时间为横坐标，以菌数为纵坐标，根据不同培养时间时细菌数量的变化，可以作出一条反映细菌在整个培养期间菌数变化规律的曲线。,生长曲线,生长曲线(growth curve)描述细菌生长规律,活菌数,培养时间,.指数期,.稳定期,.衰亡期,.延滞期,细菌数目（个/ml）对数,缩短延滞期的意义和方法,延滞期(lag phase),出现原因

7、,本期特点,影响本期限长短因素,延滞期出现原因,把细菌接种到新鲜的培养基中培养时，并不立即进行分裂繁殖，细菌增殖数为，这时需要合成多种酶，辅酶和某些中间代谢产物，要经过一个调整和适应过程。,延滞期特点,生长速率常数等于零,菌体粗大,代谢活力强,对不良条件抵抗能力降低,含量增加,影响延滞期限长短因素,接种龄,接种量,培养基成分,缩短延滞期的意义和方法,可以缩短生产周期，提高设备利用率。,接种对数生长期的菌种，采用最适菌龄,加大接种量,用与培养菌种相同组成分的培养基,指数期(对数期)(exponential phase),特点,该期的细菌生产中多被用做种子和科学试验材料,活菌数和总菌数接近,酶系活

8、跃，代谢旺盛。,生长速率最大，generation time最短。,细胞的化学组成及形态，生理特性比较一致,x2,x1,t2,t1,培养时间,Lg 细胞数/ml,指数期生长的数学模型,繁殖代数 n=3.322(lgx2-lgx1),影响指数期的因素,菌种,营养成分,营养物浓度,培养温度,稳定期(stationary phase),出现原因,营养的消耗,有害代谢产物积累,PH值EH值等理化条件不适,出现原因,营养物比例失调,稳定期特点,活菌数保持相对稳定，总菌数达最高水平。,细菌代谢物积累达到最高峰。,芽孢杆菌这时开始形成芽孢。,这是生产收获时期。,衰亡期(decline phase/death

9、 phase),特点,细菌死亡数大于增殖数,活菌数明显减少,群体衰落,细胞出现多形态,大小不等的 畸形,变成衰退型,细胞死亡,出现自溶现象。,三、连续培养,连续培养(continous culture of microorganisms)是在微生物的整个培养期间，通过一定的方式使微生物能以恒定的比生长速率生长并能持续生长下去的一种培养方法。,连续培养的基本原则：微生物培养过程中不断的补充营养物质和以同样的速率移出培养物,连续培养类型,恒浊连续培养,恒化连续培养,(一)恒化连续培养,在整个培养过程中通过控制培养基中某种营养物质的浓度基本恒定的方式，保持细菌的比生长速率恒定，使生长“不断”进行。,

10、生长速率的控制因子：一般是氨基酸、氨和铵盐等氮源，或是葡萄糖、麦芽糖等碳源或者是无机盐，生长因子等物质,恒化器连续培养通常用于微生物学的研究，筛选不同的变种。,(二)恒浊连续培养,通过连续培养装置中的光电系统控制培养液中菌体浓度恒定、使细菌生长连续进行的一种培养方式。,用于菌体以及与菌体生长平行的代谢产物生产的发酵工业,(三)连续发酵与单批发酵相比,优点：缩短发酵周期，提高设备利用率；便于自动控制；降低动力消耗及体力劳动强度；产品质量较稳定；,缺点：杂菌污染和菌种退化,连续培养(continuous culture)(open culture),将微生物置于一定容积的培养基中培养，最后一次收获

11、，叫分批培养，将微生物放在恒定的容积的流动系统中培养称为连续培养。,优点：缩短发酵周期；便于自动控制；产物质 要 量均一,缺点：菌种易退化；易染杂菌,微生物的高密度培养（high cell-density culture,HCDC）,指微生物在液体培养基中细胞群体密度超过常规培养10倍以上时的生长状态或培养技术。现代高密度培养技术主要是用于基因工程菌生产多肽类药物。,选取最佳培养基成分和各成分含量,补料,提高溶解氧的浓度,防止有害代谢产物的生成,影响微生物生长的主要环境因素,氧化还原电位,水分,氧气,温度,辐射,PH,物理因素对微生物生长的影响,化学因素对微生物生长的影响,重金属及其化合物,卤

12、素,有机化合物,染料,温度,嗜冷微生物（低温微生物）,中温微生物,嗜热微生物（高温微生物）,低温对微生物的影响,嗜冷微生物（低温微生物）,系在低温下仍能起催化作用,细胞膜含较多的不饱合脂肪酸在低温下仍具有通透性。上下班,嗜冷机制：,嗜热微生物的嗜热机制,细胞内的具强抗热性,产生的多胺，热亚胺和高温精胺物质对蛋白质等组织结构具有保护作用。一一一一一口口口,核酸也具有热稳定性的保护结构。,细胞膜含有较多的饱和脂肪酸和直链脂肪酸，使膜具有稳定性。上,低温对微生物的影响,代谢降低,生长繁殖停滞,仍然存活,常在低温下对菌种和食品保藏。,PH,影响细胞膜透性与稳定性,影响物质溶解度,影响细胞表面电荷分布,

13、因此影响微生物生长、繁殖，发育。,各类微生物能够生长的PH值较宽，但细胞内部PH值却接近中性。,微生物的活动也能改变环境中的PH值,嗜酸性微生物,嗜碱性微生物,耐酸及耐碱微生物,根据氢离子浓度对微生物分类,氧气,专性好氧菌（obligate or strict aerobes）,兼性厌氧菌（facultative anaerobes）,耐氧菌（aerotolerant anaerobes）,厌氧菌（anaerobes）,微好氧菌（microaerophilic bacteria）,超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（Catalase）,超氧化物歧化酶（SOD）,功能：使好氧菌免受超氧化物阴离

14、子自由基的毒害,2H2O2 _Catalase_ 2H2O+O2,过氧化氢酶（Catalase）,厌氧菌（anaerobes）,能量来源于发酵无氧呼吸环式光合磷酸化或甲烷发酵,微生物培养法,Brewer 皿,高层琼脂柱,亨盖特技术,厌氧罐anaerobic jar,Anaerobic Glove Box,厌氧菌的培养,Different culture methods,Liquid Culture,Batch culture,Batch&Continuous culture,10 ml,20 ml-1 L,1 L-1000L,Fermentor,挂曲,小曲,红曲,fermenter,ferme

15、nter,有害微生物的控制,几个基本概念,物理灭菌因素的代表高温,化学杀菌剂、消毒剂和治疗剂,消毒(disinfection)：杀死或消除物体上的病原微生 物的方法,灭菌（sterilition）：杀死物体上全部微生物的方法,防腐(antisepsis)：用理化方法防止抑制微生物生长 的方法,几个基本概念,化疗(chemotherapy)：利用对病源菌具有高度毒力而 对宿主基本无毒的化学物质来抑制 宿主体内病源微生物的生长繁殖,高温灭菌,辐射作用,高渗作用,干燥,超声波,控制微生物的物理因素,高温灭菌,多数细菌，酵母菌和霉菌的营养细胞和病毒在50-65 10 min可以致死。F,一般噬菌体65

16、80 致死，,放线菌霉菌的孢子比营养细胞抗热性强，7680 10min可以杀死 B,细菌芽孢，在100 下20min才能致死，,嗜热脂肪芽孢杆菌可在80 条件下生活，在120，12min才能杀死，BBBBBBBBBBB,同种微生物老龄菌比幼菌耐热。,高温灭菌,干热灭菌(dry heat sterilization),湿热灭菌(mosist heat sterilization),焚烧灭菌法：常用与废弃物动物尸体等处理。,烘烤灭菌法；实验室用干燥箱烘烤接种工具。,湿热灭菌(mosist heat sterilization),煮沸灭菌法（煮沸消毒法）,高压蒸汽灭菌法,间歇灭菌法,巴斯德消毒法：（

17、巴氏消毒法）,该法比干热灭菌效果好，因为蛋白质在有水的情况下容易凝固，如含水50，蛋白质凝固温度为56；含水蛋白质凝固温度为160-170,煮沸灭菌法（煮沸消毒法）,物品在水中煮沸 15min，可杀死所有营养细胞和一部分芽孢。在水中加入的 a2CO3或的碳酸效果更好。此法适合注射器和解剖用具的消毒。,高压蒸汽灭菌(normal autoclving),是湿热灭中最好方法，通常在1.05kg/cm2,的压力下面（此时温度121）处理1530min。,要排冷，否则会形成假压，虽然压力达到要求，温度却达不到相应高度，而影响灭菌效果。,间歇灭菌法(fractional sterilization),是

18、用常压蒸汽反复几次进行灭菌的方法。,主要用于不宜高压灭菌的培养基，不耐热的药物和营养物等,方法是将待灭菌物品置于蒸锅内加热到沸腾维持15-30min杀死营养细胞，取出冷却后在37恒温培养24小时，使芽孢萌发，再用此法灭菌，反复三次，即可达到灭菌目的。,巴氏消毒法(pasteurization),是食品（牛奶）酿造（啤酒）工业中常用的方法。,具体做法是61.762.8处理30min或71.6度处理15min，,这样即可杀死病原微生物。又不致损坏营养，可保留食品饮料原有用味。,根据结核杆菌在62下15min被致死。,低温维持法;,高温瞬时灭菌,辐射,可见光,紫外线（非电离辐射）,X射线与r射线,紫

19、外线（非电离辐射）,杀菌机制：,诱导核酸形成胸腺嘧啶二聚体，从而干扰GGGGGGGG了核酸的复制H,各种微生物对紫外线抗性,干细胞强于湿细胞,芽孢，孢子强于营养细胞,多倍体 二倍体 单倍体,X射线与r射线,直接学说,间接学说,r射线是放射性元素Co60发射出的高能射线，F 具强穿透能力，500干伦琴剂量用于诱变育种，10万伦琴以上具杀菌作用。G,高渗作用,等渗溶液对微生物生长有利,细菌处于低渗液中会吸水膨胀乃至破裂,细胞处于高渗液中会脱水引起质壁分离导致死亡。J,控制微生物的化学物质(因素),表面消毒剂,抗代谢物,抗生素,化学治疗剂,溶液状态,气体状态,生物药物素,酸和碱,重金属极其盐类,有机

20、化合物,氧化剂,卤素,染色剂,表面活性剂,表面消毒剂(surface disinfactant),酸和碱,前面讲过微生物细胞中的DNA，RNA，Pr，E只有在中性条件下才能体现活性，因此强酸碱具杀菌作用。医院病房常用乙酸消毒。,重金属极其盐类,是杀菌剂和防腐剂，作用最强的是Hg,Ag,Cu,作用机理：使蛋白质变性，使酶失活。（与E的SH结合。）,00202Hgcl2（升汞）溶液对大多数细菌有致死作用。,CuSO4对真菌、藻类有强杀伤力，波尔多（CuSO4碳）防植物病害。,另外还有砷，铋、锑的化合物是治疗梅毒的特效药。,011 AgNO3 可消毒皮肤，1浓度新生儿点眼预防眼炎,有机化合物,醇、醛

21、、酚是常用的杀菌剂。,杀菌机制,损伤细胞膜,使蛋白质变性（细胞膜，E失活）,抑制脱氢酶，氧化酶活性。,有机化合物,甲醛：纯甲醛为气体，3740水液为福尔马林。,醇是脱水剂蛋白质变性剂,70乙醇杀菌效果最好。,酚：35的石碳酸溶液几分钟即可致死细菌甲酚杀菌力最强，煤酚皂液（来苏尔）为甲酚和肥皂的混合液。,氧化剂,K2MnO4使菌体蛋白质氧化，使酶失活。77777 013浓度可用于皮肤，果品、餐具、消毒。H2O2清洗伤口。,卤素,碘杀菌力强，37碘溶于7083的乙醇中成碘酒。,氯及氯化物常用于水及食品消毒与水结合放出原子氧（O）用于消毒。上下,氯，碘是常用的消毒剂,染色剂,干扰菌体氧化还原电位,阻

22、碍芽孢的形成。,表面活性剂,具有降低表面张力效应的物质叫表面活性剂。常用的有新吉尔灭等，去污剂，肥皂等。一落表面张力降低可抑菌或杀菌。五彩缤纷,抗代谢物(antimetabolite),有些化合物在结构上与生物体所必需的代谢物很相似，以至可以和特定的酶结合，从而阻碍了酶的功 能。干扰代谢的正常代谢。这些物质称为抗代谢物。,磺胺药(sulphonamides,sulfa drugs)抑菌机理,TMP:三甲基苄二氨嘧啶(磺胺增效剂),选择素力,是由微生物在代谢过程中产生（有的可人工合成）具 有一定浓度下抑制或杀死其他微生物的有机化合物。F,每种抗生素都有一定的杀菌范围，称为抗菌谱。G,抗生素(an

23、tibiotic),抗生素的诞生,1928年A.Fleming发现青霉素,1940弗罗里提纯出青霉素,各种抗生素被相继发现并应用,人工合成半合成抗生素被相继开发出来,青霉素（penicillin）,英国科学家A.Fleming爵士,与弗莱明共同获得1945年诺贝尔生理学和医学奖.,1940提纯出青霉素,澳大利亚病理学家霍华德.弗罗里,人工合成半合成抗生素被相继开发出来,6-氨基青霉烷酸,神奇 的抗生素,抑制细胞壁的形成,影响细胞膜的功能,干扰蛋白质合成,抑制核酸复制,和固醇结合影响细胞膜透性,作用于呼吸链影响能量利用,氨苄青霉素（ampicillin）,白点是强度各异的抗生素，最底下的青霉素完全没有黑环，显示它对链球菌已毫无作用,抗药性(antibiotic resistance),菌体内产生了钝化 或分解药物的酶F,改变细胞膜的透性而导致抗药性,细胞内被药物作用的部位发生了改变，目前典型的例子是核糖体发生了改变。J 抗生素 核糖体结合 蛋白质不能合成,救护途径,泵出机制,可怕的抗药性(antibiotic resistance),生物药物素(biopharmaceutin),具有多种生理活性的比抗生素疗效更为广泛的微生物次生代谢产物,