微生物生理第4章酶与营养.ppt

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1、1,第四章 微生物的生理,4.1 微生物的酶4.2 微生物的营养4.3 微生物的能量代谢,2,4.1 微生物的酶,简而言之，全酶=蛋白质+辅助因子,一、酶的组成,1 酶的组成分两类,单成分酶：只含蛋白质,全酶：蛋白质+不含氮的小分子有机物,蛋白质+不含氮的小分子有机物+金属离子,蛋白质+金属离子,3,激活剂：其主要作用是使酶蛋白或基质保持一定的构型，有利于化学反应的完成，但并不直接参加化学反应,根据辅助因子与酶蛋白结合的牢固程度将其分为三类：,辅酶：与蛋白质结合较松弛，易透析除去的,辅基：辅助因子以共价键与酶蛋白质牢固的结合在一起，不易透析除去的,4,二、酶蛋白的结构与功能,1 结构,由20种

2、氨基酸组成，分一级结构、二级结构、三级结构和四级结构,5,蛋白质由L-氨基酸组成,COOH R CH NH2,6,蛋白质由氨基酸组成,两种符号一般所写前3个字母例：glycine 简写Gly 或 G丙氨酸 Ala A甘氨酸 Gly G亮氨酸 Leu L.,7,肽键,COOH NH R CH CH R HNH HOOC,-H2O,HN-C,O,CH-R,NH,CH,R,COOH,8,肽键-一级结构,一级结构：氨基酸排列顺序（二硫桥),9,二级结构,-螺旋/折叠CO的氧和 NH的氢都结合成氢键,10,三级结构,三级结构,一级结构,二级结构,11,溶菌酶三级结构,12,溶菌酶三级结构立体模型,13,

3、四级结构例子大肠杆菌天冬氨酸转氨甲酰酶,a俯视,b 侧视,C 俯视肽链,粉色：催化亚基 c,蓝色：调节亚基 r,14,2 酶蛋白的结构与功能的关系,结构决定功能，其催化活性和专一性 就在于分子结构的特殊性,酶活性中心：指酶蛋白分子中能与底物结合，并起催化作用的空间结构部位。有结合部位和催化部位,小部分氨基酸微区,15,酶的作用机制,酶与底物结合示意图,16,酵母己糖激酶与底物葡萄糖立体模型,葡萄糖,17,三、酶的命名与分类,1 命 名,习惯命名法：按作用的底物；据催化反应的类型系统命名法：国际系统命名原则。以所催化的反应为基础,18,2 分类：按催化的化学反应类型划分6类,（1）水解酶：催化大

4、分子有机物水解成小分子,AB+H2O AOH+BH,（2）氧化还原酶：催化氧化还原反应 又分为氧化酶和脱氢酶,脱氢酶：催化底物脱氢，氢由中间受体接受,CH3CH2OH+NAD CH3CHO+NADH2,氧化酶：催化底物脱氢,氢由辅助因子传递给活化的氧,或催化底物脱氢,活化的氧与氢结合生成水,19,（3）转移酶：催化底物上的基团转移到 另一有机物上，即催化基团在分子间转移,AR+B A+BR,2 分类：按催化的化学反应类型划分6类,天冬氨酸 氨甲酰磷酸转移酶天冬氨酸+氨甲酰磷酸氨甲酰天冬氨酸+磷酸,20,（4）异构酶：催化同分异构分子内的基团重新排列,A A/,2 分类：按催化的化学反应类型划分

5、6类,催化异构化反应如：葡萄糖异构酶 葡萄糖 果糖,（5）裂解酶：催化有机物裂解为小分子有机物,AB A+B,21,2 分类：按催化的化学反应类型划分6类,（6）合成酶：催化底物的合成反应(ATP提供能量),A+B+ATP AB+ADP+Pi,谷氨酰胺合成酶谷氨酸+NH3+ATP 谷氨酰胺+ADP+Pi,22,四、酶的催化特性,催化剂：加快反应速度，在反应前后数量和性质不变,对底物高度专一性（专一性的几种假说）,酶催化反应条件温和,催化效率极高，比无机催化剂的催化效率高几千倍至几万倍,易失活，对环境条件极为敏感,23,不改变反应平衡常数,降低活化能,酶反应,催化能力巨大 CO2+H2O-H2C

6、O3 反应速度是为普通催化反应的107 倍,24,五、影响酶活力的因素,由中间反应产物学说，提出了著名的米门公式,由米门公式可得出各种因素对酶促反应速度的影响,1、米-门公式（Michaelis-Menten公式）,=,VmaxS,Km+S,Km米门常数,表示反应速度为 最大速度一半时的底物浓度,25,酶反应速度随底物浓度升高而增大,2、酶促反应的因素,26,pH、温度对酶反应速度的影响,钟形曲线,27,酶的抑制（酶的活性被减弱、抑制甚至破坏）,微生物能被许多化学物质毒害，许多最有效的毒物的抑制剂。例：琥珀酸脱氢酶 丙二酸竞争抑制(见下图)磺胺药物抑制叶酸合成，达到抑菌目的,分为:不可逆的抑制

7、作用与可逆的抑制作用,28,琥珀酸脱氢酶竞争性抑制,29,酶的激活（激活剂）:凡能激活酶的物质,无机阴离子 无机阳离子有机化合物，如维生素、半胱氨酸和肠激酶等,按化学组成分:,许多酶促反应只有当某一种适当的激活剂存在时,酶才表现出催化活性或强化其催化活性.,30,4.2 微生物的营养,营 养：微生物获得和利用营养物质的过程,营养物：指能满足微生物机体生长、繁殖以及生理活动所需物质,微生物营养的确定主要依据其细胞的化学成分,微生物存在的物质基础,31,一、微生物的营养需求,1 微生物细胞的化学组成,微生物细胞的化学成分以有机物和无机物两种状态存在。有机物包含各种大分子，它们是蛋白质、核酸、类脂和

8、糖类，占细胞干重的90%以上。无机成分包括小分子无机物和各种离子，低于细胞干重的10%。,32,主要元素：C、H、O、N、S、P、K、Ca、Mg、Fe微量元素：Zn、Mn、Na、Cl、Mo、Se、Cu、Ni、B,1 微生物细胞的化学组成,组成微生物细胞的各类化学元素的比例常 因微生物种类的不同而各异,微生物细胞的化学元素组成也常随菌龄及培养条件的不同而在一定范围内变化,33,微生物细胞的化学元素与其营养物质 微生物生长所需的营养物质应该包含有组成细胞的各种化学元素，即构成细胞物质的碳素来源的碳源物质，构成细胞物质的氮素来源的氮源物质和一些含有K、Na、Mg、Ca、Fe、Mn、Cu、Co、Zn、

9、Mo元素的无机盐。,34,微生物生长所需要的营养物质主要是以有机物和无机物的形式提供的，小部分由气体物质供给。微生物的营养物质按其在机体中的生理作用可区分为：碳源、氮源、无机盐、生长因子和水五大类。,2 微生物的营养物质及其生理功能,35,在微生物生长过程中为微生物提供碳素来源的物质称为碳源。从简单的无机含碳化合物如CO2和碳酸盐到各种各样的天然有机化合物都可以作为微生物的碳源，但不同的微生物利用含碳物质具有选择性，利用能力有差异。(见表3.1),碳 源(source of carbon),36,碳源物质通过复杂的化学变化来构成微生物自身的细胞物质和代谢产物；同时多数碳源物质在细胞内生化反应过

10、程中还能为机体提供维持生命活动的能量;但有些又以CO2为唯一或主要碳源的微生物生长所需的能源则不是来自CO2。,碳源的生理作用,37,微生物对碳源利用的选择性：迟效碳源和速效碳源,工业发酵用的碳源:单糖、饴糖、糖蜜、淀粉、纤维素等,微生物利用的碳源物质主要有：糖类、有机酸、醇、脂类、烃、二氧化碳及碳酸盐等,碳源的利用,38,表3.1微生物利用的碳源物质,39,氮 源(source of nitrogen),凡是可以被微生物用来构成细胞物质的或代谢产物中氮素来源的营养物质通称为氮源物质。能被微生物所利用的氮源物质有蛋白质及其各类降解产物、铵盐、硝酸盐、亚硝酸盐、分子态氮、嘌呤、嘧啶、脲、酰胺、氰

11、化物(见表3.2)。,40,氮源物质常被微生物用来合成细胞中含氮物质，少数情况下可作能源物质，如某些厌氧微生物在厌氧条件下可利用某些氨基酸作为能源。微生物对氮源的利用具有选择性，如玉米浆相对于豆饼粉，NH4+相对于NO3-为速效氮源。铵盐作为氮源时会导致培养基pH值下降，称为生理酸性盐，而以硝酸盐作为氮源时培养基pH值会升高，称为生理碱性盐实验室用：胨、牛肉膏、酵母膏工业发酵用：常用无机氮盐，即铵盐、硝酸盐和尿素等,41,表3.2 微生物利用的氮源物质,42,无机盐是微生物生长必不可少的一类营养物质，它们在机体中的生理功能主要是作为酶活性中心的组成部分维持生物大分子和细胞结构的稳定性调节并维持

12、细胞的渗透压平衡控制细胞的氧化还原电位和作为某些微生物生长的能源物质等(表3.3)。,无 机 盐(inorganic salt),43,无 机 盐,生长所必需的无机盐一般有：磷酸盐、硫酸盐、氯化物及含有Na、K、Ca、Mg、Fe等金属元素的化合物以及微量元素,44,表3.3 无机盐及其生理功能,45,微量元素是指那些在微生物生长过程中起重要作用，而机体对这些元素的需要量极其微小的元素，通常需要量在10-6-10-8mol/L(培养基中含量)。微量元素如Zn、Mo、Mn、Se、Co、Cu、W、Ni等，一般参与酶的组成或使酶活化(表3.4)。,微生物可利用无机盐类型,46,表3.4 微量元素与生理

13、功能,47,微量元素,微生物在生长过程中缺乏，会导致细胞生理活性降低甚至停止生长。由于不同微生物对营养物的需求不同，微量元素这个概念是相对的。微量元素通常混杂在天然有机营养物、无机化学试剂、自来水、蒸馏水、普通玻璃器皿中，如果没有特殊原因，在配制培养基时没有必要另外加入微量元素。,48,生 长 因 子,微生物生长所必需且需要量很少，但微生物自身不能合成或合成量不足以满足机体生长需要的有机化合物,三大类：维生素、氨基酸、嘌呤嘧啶,各种微生物需求的生长因子的种类和数量是不同的,生长因子自养型微生物：不需要提供生长因子的微生物如：E.coli,49,维生素在机体中所起的作用主要是作为酶的辅基或辅酶参

14、与新陈代谢；有些微生物自身缺乏合成某些氨基酸的能力，因此必须在培养基中补充这些氨基酸或含有这些氨基酸的小肽类物质，微生物才能正常生长；嘌呤与嘧啶作为生长因子在微生物机体内的作用主要是作为酶的辅酶或辅基，以及用来合成核苷、核苷酸和核酸。,生 长 因 子,50,生长因子的来源：某些细胞或组织的提取液中常含有丰富的生长因子,微生物的分类（根据生长因子的需求性）,生长因子自养型微生物,生长因子异养型微生物,生 长 因 子,51,维生素的生理功能,52,细菌所需要的维生素,53,细胞中的水,自 由 水,结 合 水,水的生理功能,溶剂作用：所有物质须先溶于水，才能 参与各种化学反应,参与生化反应：脱水、加

15、水反应等。,运载物质的载体,维持和调节一定的温度,维持蛋白质、核酸等生物大分子稳定的天然构象,水,54,几点注意：,不同的细菌，营养要求不同。,不同的生长条件，同一细菌的营养要求也会不同。,细菌的代谢能力强，可利用的化合物种类很广。,自然界中所有物质几乎都可以被这种或那种细菌所利用。甚至一些有毒有害的有机物。e.g.H2S、酚、HCN、Cr6+等。,2 微生物的营养物质及其生理功能,55,有些微生物（细菌）往往先利用现成的、易被吸收利用的化合物。如果这些物质的量已满足了他们的要求，就不利用其他物质了。,有些微生物在利用易被吸收利用物质的同时，能利用难降解的化合物。,注意：易处理污水与难降解污水

16、的混合生物处理。,微生物的驯化、共代谢等。,各种营养元素之间往往有一定的比例关系。,e.g.土壤中许多微生物要求 C：N=25：1 废水生物处理中要求 好氧处理 BOD:N:P=100:5:1 厌氧处理 BOD:N:P=100:6:1,2 微生物的营养物质及其生理功能,56,按能源分,化能营养（chemotroph）,光能营养（phototroph）,按碳源分,自养型（autotroph）,异养型（heterotroph）：需要有机物才能 生长的微生物,C源：CO2、HCO3,N源：NO2、NH4+,H源：H2S,3 微生物的营养类型,57,微 生 物 营 养 类 型 的 分 类,58,根据能

17、源和碳源的不同，细菌的营养类型可分为四大类,根据营养类型，细菌（微生物）亦可为四大类,3 微生物的营养类型,59,1）光能自养菌（微生物）：,含有光合色素、能进行光合作用。利用CO2合成细胞所需的有机物。进行光合作用时从H2S（或H2O）获氢。,e.g.绿色细菌、紫硫细菌、绿硫细菌、蓝细菌,注意：蓝细菌从水的光解中获得氢，用于还原CO2。,60,2）光能异养菌（微生物）,能进行光合作用（不产生氧气）不能以CO2作为唯一或主要碳源（利用简单的有机物作碳源）,能利用有机物作为氢供体，利用光能 把CO2还原成细胞物质。,这些菌一般都需要生长因子。,此类菌很少，如红螺菌中的一些细菌：紫色无硫细菌等,6

18、1,3）化能自养菌（微生物）,能氧化特定的还原态无机物（如 S、Fe2+、NH4+、H2S、H2），利用其中的化学能还原CO2合成有机化合物。,e.g.硝化菌、硫化菌、铁细菌、氢细菌、硫磺细菌,化能自养菌的专一性很强，一种细菌往往只能氧化某一种特定的无机物（硝酸盐、铁细菌等）比光能自养菌分布广，在自然界中N、P、Fe的物质转化过程中起重要作用。,62,4）化能异养菌（微生物）,利用有机物作为碳源和能源。,大部分细菌都属于这种类型。（真菌均属于此类）,腐生细菌：从死的有机残体中获得营养而生活。（占大多数）,在自然界的物质转化中起着决定性的作用,寄生细菌：生活在活的生物体中。,63,微生物营养类型

19、,总之，以“？”为能源，决定光能或化能；以“？”为碳源，决定自养或异养；以“？”为供氢体，决定是无机营养型还是有机营养型。,无论哪种分类方式，不同营养类型之间的 界限并非绝对的,有些微生物在不同生长条件下，其营养类型会发生改变,64,微生物的营养类型（小结）,*NH4+、NO2-、S、H2S、H2、Fe2+等。,65,营养缺陷型：某些菌株发生突变后，失去合成某种（或某些）对该菌生长必不可少的物质（通常是生长因子）的能力，必须从外界环境获得该物质才能生长繁殖，这种突变型菌株称为营养缺陷型，相应的野生型菌株称为原养型,66,二、培养基（medium,culture medium）,人工配制的适合微

20、生物生长繁殖 或产生代谢产物的营养物质。,无论是以微生物为材料的研究，还是利用微生物生产生物制品，都必须进行培养基的配制，它是微生物学研究和微生物发酵生产的基础。,1、定义：,67,培养基中应含满足微生物生长发育的营养要素：水分、碳源、氮源、生长因子以及基本的离子，磷、硫、钠、钙、镁、钾和铁及各种微量元素。此外，培养基还应具有适宜的酸碱度(pH值)和一定缓冲能力及一定的氧化还原电位和合适的渗透压。,二、培养基（medium,culture medium）,68,二、培养基（medium,culture medium）,培养基的配制原则：,选择适宜的营养物质营养物质浓度及配比合适控制pH条件控制

21、氧化还原电位(redoxpotential)原料选择灭菌处理消泡,培养基的配置是培养好微生物的基础和前提,主要是碳氮比合适,69,二、培养基（medium,culture medium）,配置培养基的注意事项：,含微生物所需要的六大营养要素。,明确目的，不同细菌、不同目的 需要配制不同的培养基。,营养协调，注意各种营养物的浓度和配比：,在水处理中一般应注意进水中BOD5：N：P的比值为100：5：1，C:N=200：110：1,厌氧处理：BOD5：N：P的比值为100：6：1。,70,氧化硫硫杆菌培养基,71,在大多数化能异养菌的培养基中，各要素间在量上的比例大体符合以下10倍递减规律：,单位

22、：mol/L,二、培养基（medium,culture medium）,72,一旦配成须全部进行灭菌，否则会引起杂菌污染，并破坏固有的组成和性质。,培养基的配制方法：,生态模拟：肉汤、米饭、肥土,查阅文献。,实验研究（各项因素的比较、反复的实验）。,73,2、培养基的分类,按物理状态分,固体培养基（solid medium）：用于菌的分离、鉴别、选种、计数等，如2%琼脂，滤膜,半固体培养基（semi-solid medium）,液体培养基（liquid medium）：主要用于生理及代谢研究、获得大量菌体等，在生产实践上绝大多数都采用此类培养基。,水处理中的废水也可看作是一种广义的液体培养基,

23、根据培养基中凝固剂的有无及含量的多少分：,74,理想的凝固剂应具备以下条件：不被所培养的微生物分解利用；在微生物生长的温度范围内保持固体状态，在培养嗜热细菌时，由于高温容易引起培养基液化，通常在培养基中适当增加凝固剂来解决这一问题；凝固剂凝固点温度不能太低，否则将不利于微生物的生长；凝固剂对所培养的微生物无毒害作用；凝固剂在灭菌过程中不会被破坏；透明度好，粘着力强；配制方便且价格低廉。,75,常用的凝固剂有琼脂(agar)、明胶(gelatain)和硅胶(silica gel)。表3.9列出琼脂和明胶的一些主要特征。,表3.9 琼脂与明胶主要特征比较,76,按培养基组成分,天然培养基（comp

24、lex medium;undefined medium）,天然有机物配制而成的培养基化学成分不明确且不稳定；取材方便、营养丰富、种类多、配制容易,合成培养基/组合培养基（synthetic medium/defined medium）,用已知的化合物配制而成的成分精确，重复性好，但价格较贵，制作繁琐,半合成培养基,2、培养基的分类,77,配置天然培养基用的几种原材料的特性,78,酵母膏中的维生素和氨基酸含量,79,氧化硫硫杆菌培养基（合成或组合培养基）,80,2、培养基的分类,按培养基用途划分基础培养基(minimum medium)基础培养基是含有一般微生物生长繁殖所需的基本营养物质的培养基

25、。加富培养基(enrichment medium)也称营养培养基，即在基础培养基中加入某些特殊营养物质制成的一类营养丰富的培养基，这些特殊营养物质包括血液、血清、酵母浸膏、动植物组织液等。主要用于细菌的富集培养。e.g.苯、甲苯降解菌的培养等。,81,鉴别培养基(differential medium)是用于鉴别不同类型微生物的培养基。在培养基中加入某种特殊化学物质，某种微生物在培养基中生长后能产生某种代谢产物，而这种代谢产物可以与培养基中的特殊化学物质发生特定的化学反应，产生明显的特征性变化，根据这种特征性变化，可将该种微生物与其他微生物区分开来。,2、培养基的分类,按培养基用途划分,82,

26、选择性培养基（selected medium）,根据微生物的特殊营养要求或对各种化学物质敏感程度的差异而设计、培制的 是用来将某种或某类微生物从混杂的微生物群体中分离出来。按某细菌的特殊营养要求设计的培养基，可使该细菌得到选择性的生长和分离，抑制其他细菌的生长，从而提高细菌的分离效果。,2、培养基的分类,按培养基用途划分,83,一种是选择培养基是依据某些微生物的特殊营养需求设计的。即加入所需的营养物质。常用于微生物的筛选 另一种选择培养基是在培养基中加入某种化学物质，这种化学物质没有营养作用，对所需分离的微生物无害，但可以抑制或杀死其他微生物，即加入其他微生物的抑制物质。常用于微生物的计数。,

27、方法有二：,84,用于选择性培养基的若干抑制剂,85,续 上 表,86,三、营养物质的吸收与运输,1、营养物质需进入细胞内才能被利用，代谢物也需要及时地排除，营养物质是怎样通过细胞壁和细胞膜进入细胞的呢？,2、据目前所知，细胞壁在营养物质运输上不起多大作用，仅简单的排阻分子量过大的溶质进入。一般是分子量大于600道尔顿。,3、细胞膜是控制营养物进入和代谢物排出的主要屏障。,一般认为细胞膜以四种方式控制物质运输：,单纯扩散、促进扩散、主动运输和基团转位,87,1、单纯扩散（single diffusion）被动扩散（passive diffusion）,物理扩散,高浓度向低浓度方向扩散、不耗能量

28、,主要是水分和一些小分子（O2、CO2、CH3OH、甘油、某些氨基酸）,不能将稀薄溶液中的溶质进行逆浓度梯度的运输,没有特异性，扩散速度慢,88,促 进 扩 散 模 式 图,2、促进扩散（facilitated diffusion）,89,2、促进扩散（facilitated diffusion）,1)由高浓度向低浓度方向扩散，不耗能量，与单纯扩散相似,2)借助细胞膜上的一种蛋白为载体进行（特异载体蛋白）须有能与之结合的蛋白，因此有选择性。,e.g.SO42、PO43、糖等非脂溶性物质,不能进行逆浓度梯度的运输。,运送速度比单纯扩散快（多见于真核微生物）。,此蛋白称载体蛋白，又因为与酶极相似，

29、又称为渗透酶,90,主动运送模式图,3、主动运输（active transport）,91,3、主动运输（active transport）,借助特异性载体蛋白运输、需要能量。,与促进扩散类似，但它需要能量,是吸收营养物质的主要机制，Na、K、糖类等。,可逆浓度梯度进行运送。,溶质的分子结构不发生变化。,92,Enz2,HPr,4、基团移位（group translocation）,93,4、基团移位（group translocation）,与主动运输相似，需特异性载体蛋白，耗能。但运输前后溶质分子发生变化（蛋白与溶质发生反应）,主要运输、葡萄糖、果糖、甘露糖、嘌呤、脂肪酸等,主要依靠磷酸转移酶系统。,厌氧菌、兼性厌氧菌、光合菌一般用基团移位方式吸收糖、糖醇等严格的好氧菌不存在这种方式。,94,参与基团移位的化合物：,酶：非特异性酶，一种可溶性的细胞质蛋白。,酶：结合在细胞膜上的一类酶，对底物有特异性选择作用,高能磷酸的载体热稳定蛋白（Heat-stable carrier protein；HPr）。一种低分子量的可溶性蛋白质。,95,四种运送营养物质方式的比较,