微生物学实验-吕爱军.ppt

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1、徐州师范大学生命科学学院微生物学实验吕爱军,一、实验内容,实验一 实验室环境和人体表面微生物的检查（3学时）实验二 器皿的清洗包装及干热灭菌（3学时）实验三 培养基的制备及高压蒸汽灭菌（3学时）实验四 细菌的单染色及接种技术（6学时）实验五 放线菌的形态观察（3学时）实验六 细菌的革兰氏染色及芽孢染色（3学时）实验七 细菌大小的测定（3学时）实验八 酵母菌形态观察、死活细胞鉴别和数量测定（3学时）实验九 温度对微生物生长的影响（3学时）实验十 平板菌落计数法及比浊法（6学时）实验十一 综合设计性实验（9学时）,二、微生物实验安排与考核,课程简介：必修课，45学时、1个学分基础实验：80%，10

2、次自主设计实验：20%，设计方案、实验操作、总结、汇报,考试成绩按以下公式计算：,平时（10）操作考试（20）笔试（70）,三、课堂纪律,严格遵守实验室规章制度严肃课堂纪律 不允许无故旷课、早退（1次）迟到（2次）工作服,四、实验室安全和卫生,安全实验室严禁吸烟。注意用水、防电和防火正确使用化学试剂和仪器,卫生每次实验需留下6位同学值日，协助保持实验室清洁,实验一 实验室环境和人体 表面微生物的检查,一、实验目的1.证明实验室环境与体表存在微生物。2.比较来自不同场所与不同条件下细菌的数量和类型。3.观察不同类群微生物的菌落形态特征。4.体会无菌操作的重要性。,二、实验原理 平板培养基含有细菌

3、生长所需要的营养成分，当取自不同来源的样品接种于培养基上，在合宜温度下培养，1-2天内每一菌体即能通过很多次细胞分裂而进行繁殖，形成一个可见的细胞群体的集落，称为菌落。每一种细菌所形成的菌落都有它自己的特点，例如菌落的大小，表面干燥或湿润、隆起或扁平、粗糙或光滑，边缘整齐或不整齐，菌落透明或半透明或不透明，颜色以及质地疏松或紧密等。因此，可通过平板培养来检查环境中细菌的数量和类型。,三、实验材料 棉签、平皿（1/1人）、酒精灯、废物缸等四、操作步骤1、写标签：在皿底上2、制培养基3、倒平板4、静置5、接种环境或体表微生物手指（洗前后）、头发、咳嗽、抹布、空气中等6、培养37 培养24h-48h

4、,五、实验报告 观察并记录结果，观察环境中细菌菌落形态与类型。,1.认识微生物学实验基本材料及其清洗方法；2.了解消毒和灭菌的原理，掌握干热灭菌方法的操作步骤；3.为后续实验做准备。,一、实验目的,实验二 器皿的清洗包 装及干热灭菌,二、实验内容,（一）器皿的种类1试管（test tube）：制作琼脂斜面、成液体培养基用、制作无菌水用。2吸管（又称移液管，pipette）：转移液体菌落 3培养皿（petridish）：由正反两平面板互扣而成，专为防治空气中微生物的污染而设计的。在培养皿内倒入适量固体培养基制成平板，用于分离、纯化、鉴定菌种、微生物计数以及抗生素、噬菌体效价等。4三角烧瓶（Erl

5、enmeyerflask）与烧杯（beaker）：三角烧瓶常用的有100、250、500、1000ml等不同的大小，常用来成无菌水、培养基和摇瓶发酵等。烧杯用来配制培养基和药品。6载玻片（slide）与盖玻片（cover slip）：用于微生物涂片、染色，作形态观察用。7接种工具：接种环、针、铲、钩。8.玻璃涂布器。,1新玻璃器皿的洗涤方法：新购置的玻璃器皿含游离碱较多，因在酸溶液内先浸泡数小时。酸溶液一般用2%的盐酸或洗液。浸泡后用自来水冲洗干净。2使用过的玻璃器皿的洗涤方法:(1)试管、培养皿、三角烧瓶、烧杯等可用瓶刷或海绵沾上肥皂或洗衣粉或去污粉等洗涤剂刷洗，然后用自来水充分冲洗干净。(

6、2)玻璃吸管吸过血液、血清、糖溶液或染料溶液等的玻璃吸管（包括毛细吸管），使用后应立即投入盛有自来水的量筒或标本瓶内，免得干燥后难以冲洗干净。,（二）玻璃器皿的清洗方法,(3)载玻片与盖玻片用过的载玻片与盖玻片如滴有香柏油，要先用皱纹纸擦去或浸在二甲苯内摇晃几次，使油垢溶解，再在洗衣粉水中煮沸510分钟。检查过活菌的载玻片和盖玻片，吸过活菌的吸管应先投入盛有2%的来苏水或0.25%的新洁尔灭消毒液中浸泡24h后，按上述方法洗涤。带病原菌的培养物应先行高压蒸汽灭菌，然后将培养物倒去，再进行洗涤。玻璃器皿经洗涤后，若内壁的水均匀分布呈一薄层，表示污垢完全洗净，若挂有水珠，则还需要用洗液浸泡数小时，

7、然后再用自来水充分冲洗。在洁净的载玻片上滴上水滴后应均匀散开。若成水珠状，还应进行充分洗涤。,（三）培养皿的包扎,培养皿：以旧报纸密密包紧，一般以6套做一包，待灭菌。吸管：在距其粗头顶端约0.5cm处，塞一小段1.5cm长的棉花。棉花要塞得松紧恰当（过紧，吹吸液体太费劲；过松，吹气时棉花会下滑），然后分别将每支吸管尖端斜放在旧报纸条的的近左端，与报纸约呈60角，并将右端多余的报纸打一小结。,试管的捆扎,（四）干热灭菌法1、原理 利用高温使微生物细胞内的蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。所需温度(160-170)，时间长(1-2h)。2、实验步骤,恒温,降温,开箱取物,升温,装入待灭菌物品,（五）

8、紫外线灭菌法（示范）1、原理 紫外线杀菌机理主要是因为它诱导了胸腺嘧啶二聚体的形成和DNA 链的交联，从而抑制了DNA 的复制。另一方面，由于辐射能使空气中的氧电离成O，再使O2 氧化生成臭氧或使水氧化生成H2O2。O3 和H2O2 均有杀菌作用。适用于无菌室，接种箱，手术室内的空气及物体表面的灭菌。,1.清洗玻璃器皿，易碎，请注意规范操作，安全。2.干热灭菌法：（1）物品摆得不要太挤，以防空气流通，物品不要接触内壁，以防烤焦起火。（2）电热干燥箱观察窗的玻璃温度很高，避免直接接触导致烫伤。（3）干热灭菌温度不能超过180，否则，包器皿的纸或棉塞就会烧焦，甚至引起燃烧。3.紫外线可以灼伤皮肤和

9、眼睛,注意戴手套和防护镜操作。三、实验报告,注 意 事 项,（一）实验目的,1、明确培养基的配制原则；2、掌握配制培养基的一般方法和步骤；3、了解高压蒸汽灭菌的基本原理及应用范围；4、掌握高压蒸汽灭菌技术，了解几种常用灭菌方法。,实验三 培养基的制备及 高压蒸汽灭菌,（二）实验原理,培养基是按照微生物生长繁殖或积累代谢产物所需的各种营养物质，用人工方法配制而成的一种基质。它包括碳源、氮源、能源、生长因子、无机盐和水六类营养要素。由于不同微生物细胞组成不同，因而所需营养基质不同，为了分离、培养和鉴定不同的微生物，必须根据其需要，配制合适的培养基。培养基的种类繁多，根据培养基的成分、物理性状不同，

10、可分为天然培养基、合成培养基、半合成培养基、固体培养基、半固体培养基和液体培养基。,常用加热灭菌法：1、干热灭菌：用火焰烧灼或电热干燥箱内高温热空气灭菌2、湿热灭菌 高压蒸汽灭菌法 间歇灭菌法 煮沸消毒法,灭菌是指应用物理或化学的方法，杀灭物体表面和内部一切微生物营养体、芽孢和孢子。灭菌方法很多，可分为加热、过滤、照射和化学药品法等。,培养基配方：,四、实验内容,高氏1号培养基：固体培养基牛肉膏蛋白胨培养基：液体培养基牛肉膏蛋白胨固体培养基：由液体培养基加1.5-2琼脂,（一）、培养基的配制：同学们先将试管贴好标签。注明培养基名称，组别，日期。标签粘贴位置在离管口1/3管身处。注意：标签用铅笔

11、书写，以防高温灭菌时蒸汽模糊字迹。操作图示：,1.称量 按照培养基配方，准确称量各成份放于烧杯中。对于不是粉状（如肉膏），应用称量纸或烧杯称量。,培养基的制备过程称量-溶解-调节pH值-过滤-分装及包扎-灭菌-灭菌后试管摆放斜面,2.配调 向烧杯中加入适量的水，搅拌，使其溶解（可加热助溶）。如是配制固体培养基，在琼脂的熔化时，需不断搅拌，并控制火力不要使培养基溢出或烧焦。待完全熔化后，补足所失水分。如果配方中含有淀粉，先将淀粉用少量冷水调成糊状并在火上加热搅拌，然后加足水分及其他药品，待完全熔化后补足所失水分。,3.调节pH值 培养基溶解均匀并冷却至室温时用pH试纸测pH，然后根据要求加酸或碱

12、（一般用1molHcl和1molNaOH），要缓慢少量且多加搅拌。培养基配方为自然pH时，不用调节。4.过滤 用滤纸或多层纱布过滤，一般无特殊要求可省去。,5.分装 将制好的培养基分装入试管内或三角瓶内，管（瓶）口塞上棉塞。固体培养基要趁热装。分装时要避免培养基粘染管（瓶）口，引起污染。分装量可分为下面几方面：（1）斜面：装量为管长的1/4-1/5。（2）液体培养基、高层培养基、半固体培养基：装载量不超过管长的1/3。（3）三角瓶：装量不超过容积1/2。,（二）高压蒸汽灭菌 1、原理 利用加热一个密闭的加压灭菌锅，使灭菌锅隔套间的水沸腾而产生蒸气。由于蒸气不能溢出，而增加了灭菌锅内的压力，从而

13、使沸点增高，得到高于100的温度。导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。一般培养基用0.1Mpa，121.5,1530min 2、步骤,加水,装待灭菌物品,加盖,加热,灭菌时间到后断电源,压力降为零开箱取物,6.灭菌 塞棉塞，包扎，灭菌。高压蒸汽灭菌法：是在密闭的加压容器内进行，加热使器内的水产生蒸汽，由于密闭，增加了器内的压力，使水的沸点升高，从而获得高于100的蒸汽温度。在同一温度下，湿热杀菌效力比干热大，因为在湿热情况下，菌体吸收水分，使蛋白质易于凝固，同时湿热穿透力强，而且当蒸汽与被灭菌物体接触凝成水分时，又可放出热量，使温度迅速增高，从而增加灭菌效力。,高压蒸汽灭菌，1210C灭菌

14、20分钟。,试管的分装,灭菌后试管摆放斜面,摆斜面,试管的捆扎,棉塞制作（示范）,注 意 事 项,1、称取药品时严防药品混杂，一把牛角匙称一种药品；2、蛋白胨极易吸湿，称取时动作要迅速；2、配制固体培养基时，先将其他药品加热溶解到快沸时，再将称好的琼脂加入，继续加热至琼脂完全熔化，此过程要不断搅拌，以免琼脂糊底，并控制火力，防止沸腾外溢；4、分装量根据试管大小和实际需要而定，固体培养基装量约为管高的1/5，液体培养基的装量约为管高的1/4，三角瓶的装量不超过瓶体的1/2；5、分装过程中注意不要将培养基沾在管（瓶）口上，以免沾污棉塞而引起污染。,四、实验报告记录本实验配制培养基的名称、数量，并图

15、解说明其配制过程，指明要点。五、作业题l配制培养基有哪几个步骤?在操作过程中应注意些什么问题?为什么?2培养基配制完成后，为什么必须立即灭菌?若不能及时灭菌应如何处理?已灭菌的培养基如何进行无菌检查?3.为什么湿热灭菌比干热灭菌法更有效？,实验四 细菌的单染色及 接种技术,一、实验目的,学习并掌握普通光学显微镜的构造和油镜的使用技术及维护的基本知识学习微生物涂片、单染色的基本技术初步认识细菌的形态特征，学习无菌操作技术，掌握各种微生物接种的基本操作技术。,二、实验原理,细菌的单染色细菌细胞微小，透明，不易观察，需染上颜色。利用单一染料对细菌进行染色，使经染色后的菌体与背景形成明显的色差，从而能

16、更清楚地观察到其形态和结构。染色前必须固定细菌，其目的是：一是杀死细菌并使菌体粘附于玻片上。二是增加其对染料的亲和力。常用的有加热和化学固定两种方法。固定时尽量维持细胞原有的形态。,三、实验材料,普通光学显微镜美兰、结晶紫、复红染色液。培养24h的大肠杆菌（E.coli)、枯草芽孢杆菌载玻片、接种环、酒精灯、香柏油、二甲苯、擦镜纸、吸水纸等。,四、实验步骤,（一）、制作细菌观察片,现场演示,单染色方法,将有菌的材料或纯粹的菌种转移到另一无菌的培养基上，这个过程就称为接种。常用的几种方法如下：斜面接种液体接种平板接种,（二）、微生物接种技术,1.斜面接种：从已长好微生物的菌种管移接到另一斜面管的

17、方法。此法用于好气性微生物的接种。左手持菌种管和斜面管，使斜面向上，并尽量放平。用右手先将棉塞拧转松动，再拿接种环，用右手的小指、无名指和手掌拨下棉塞并夹紧，同时将管口在火焰上燃烧一圈，接种环灼烧灭菌后插入管内，冷却、挑菌，立即转入斜面管底部，沿斜面划曲线或直线。,斜面接种示意图,2.液体接种（示范）由斜面菌接种到液体培养基（如试管或三角瓶等）中的方法。操作与上法基本一致，只是在将接种环送入液体培养基中时使环在液体与管壁接触的地方轻轻磨擦，使菌体分散，然后塞上棉塞，再轻轻摇动均匀，即可培养。如果菌种是培养在液体培养基中时，一般用移液管或滴管接种。,3.穿刺接种（示范）用接种针挑取菌种后，插入深

18、层固体培养基内，（不要刺到底部），再沿原路拔出，此法用于厌气性细菌接种、检查细菌的运动能力。4.平板接种：将菌种接至培养皿的方法，平板接种的目的是观察菌落形态、分离纯化菌种，活菌计数以及在平板上进行各种试验时采用的一种接种方法，可分为下面几种：,a.平板划线法b.平板点种法：一般用于观察霉菌和酵母细胞，轻轻点在平板的表面（根霉点一点，曲霉、酵母可点3-4点）即可。,交叉划线法 连续划线法,1.倒平板 将菌液分离样品摇匀，用无菌移液管取1 ml的菌液移至无菌培养皿中，然后将融化，凉至50左右的培养基，在每个培养皿内各倒入约15 ml，摇匀，凝固，制成平板。,2.平板划线分离法：将菌液分离样品摇匀

19、，以无菌操作用接种环直接取试管中待分离纯化的菌液，将接种环通过稍打开皿盖的缝隙（约30）伸入平板，将菌液点种在平板边缘一处，取出接种环，烧去多余的菌种，在平板边缘空白处接触一下使接种环冷却,然后从接种有菌的部位在平板上自左向右轻轻划线，划线时平板面与接种环面成30-40，以手腕力量在平板表面轻巧滑动划线,接种环不要嵌入培养基内划破培养基,线条要平行密集，充分利用平板表面积，注意勿使前后两条线重叠，划线完毕，关上皿盖.灼烧接种环，待冷却后放置接种架上。,平板划线菌落分离效果图,1.不准擅自拆卸显微镜的任何部件,以免损坏。2.镜面只能用擦镜纸擦，不能用手指或粗布，以保证光洁度3.观察标本时，必须依

20、次用低、中、高倍镜，最后用油镜。当目视接目镜时，特别在使用油镜时，切不可使用粗调节器，以免压碎玻片或损伤镜面。4.拿显微镜时，一定要右手拿镜臂，左手托镜座，不可单手拿，更不可倾斜拿。,显微镜保养和使用中的注意事项,二、显微操作,现场演示,1.低倍镜观察：粗调、细调。依次再进行中倍、高倍观察2.油镜观察：高倍镜下找到清晰的物象后，提升聚光镜，在标本中央滴一滴香柏油，使油镜镜头浸入香柏油中，细调至看清物象为止。3.换片：另换新片，必须从第一条开始操作。4.用后复原：观察完毕，上悬镜筒，先用擦镜纸擦去镜头上的油，然后再用擦镜纸沾取少量二甲苯擦去残留的油，最后用擦镜纸擦去残留的二甲苯，后将镜体全部复原

21、。注意：油镜使用完毕后一定要用二甲苯擦拭镜头,五、问题与讨论,1.涂片为何要固定？固定加热时间过长会怎样？2.使用油镜时，为什么必须用香柏油？3.镜检标本时，为什么先用低倍镜观察，而不是直接用高倍镜或油镜观察？4.接种时，为何要尽量使试管平放？,六、实验报告,本次实验课结束请确保油镜头擦拭干净！请第一组同学留下值日下周再见！,（一）实验目的,1、学习并掌握观察放线菌形态的基本方法；2、初步了解放线菌带形态特征。,实验五 放线菌的形态观察,二、实验内容：观察放线菌菌落及菌丝、分生孢子形态。三、材料：1、菌种：链霉菌 2、0.1%美蓝染液、载片和盖片。,四、实验步骤1、菌落形态及菌苔特征：以无菌操

22、作分别取链霉菌制成菌悬液在平板培养基上用划线法接种，25-28培育5-7天，观察菌落的表面形状、大小、颜色和边缘等；并注意放线菌在基质上着生紧密情况。区别基内菌丝，气生菌丝及孢子丝的着生部位，取斜面培养链霉菌观察菌苔特征，注意孢子颜色，营养菌丝颜色和色素分泌情况等。,A：卡特利链霉菌；B：弗氏链霉菌；C：吸水链霉菌金泪亚种；D：卡那霉素链霉菌；E：除虫链霉菌；F：生磺酸链霉菌,2、个体形态特征的观察 取一个平板，选择菌丝和孢子生长较薄的部位，直接置于低倍镜和高倍镜下观察。或用接种铲连同菌苔一薄层培养基取下一小块，平置于载玻片上进行观察，注意放线菌菌丝直径大小，孢子丝的形状。,链霉菌形态观察,放

23、线菌的孢子丝描绘图,插片法 将放线菌接种在琼脂平板上，插上灭菌盖玻片后培养，使放线菌丝沿着培养基表面与盖玻片的交接处生长而附着在盖玻上，观察时，轻轻取出盖玻片，置于载玻片上直接镜检。这种方法可以观察到放线菌自然生长状态下的特征，而且便于不同生长期的形态。,印片法 将要观察带放线菌带菌落或菌苔，先印在载玻片上，经染色后观察。这种方法主要用于观察孢子丝带形态、孢子带排列及其形状等。该方法简便、但形态特征可能有所改变。,3、印片法步骤：取一盖片，轻轻放在菌落表面按压一下，使孢子贴附在盖片上，然后在载片上加一小滴0.1%美蓝染液（或加一滴水），将盖片带有孢子的面向下，盖在染液上，用吸水纸吸去多余的染液

24、，在高倍镜或油镜下观察孢子形状以及断裂方式。,印片微热固定 0.1%美蓝染液染色1min水洗晾干镜检,1、铲菌苔时注意不要将琼脂铲得太厚，以免影响压片；2、玻片不要太热，以免琼脂融化，干扰放线菌的附着；3、制片过程中切不可涂片，以免破坏菌丝形态；4、印片完毕后注意将印有放线菌的一面朝上进行固定，印片不要用力过大压坏琼脂培养基，也不要挪动，以免改变放线菌的自然形态；5、观察时宜采用略暗的光线。,注 意 事 项,四、实验报告绘图观察的放线菌形态。五、作业1在高倍镜或油镜下如何区分放线菌的基内菌丝和气生菌丝?2用插片法和印片法如何制备放线菌标本，其主要优点是什么?可否用此法观察其他微生物?为什么?,

25、实验六 细菌的革兰氏染色 及芽孢染色,1、学习微生物涂片、染色的操作技术；2、掌握细菌的革兰氏染色的方法；3、初步掌握无菌操作技术；4、掌握革兰氏染色反应原理、操作步骤和意义。,一、实验目的,二、实验原理,革兰氏染色法法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌(G)和革兰氏阴性菌(G)两大类，是细菌学上是常用的鉴别染色法。该染色法所以能将细菌分为G菌和G菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。G菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经番红复染后就成红

26、色。G菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色。,细菌的芽胞具有厚而致密的壁，透性低，不易着色，若用一般染色法只能使菌体着色而芽胞不着色(芽胞呈无色透明状)。芽胞染色法就是根据芽胞既难以染色而一旦染上色后又难以脱色这一特点而设计的。所有的芽胞染色法都基于同一个原则：除了用着色力强的染料外，还需要加热，以促进芽胞着色。当染芽胞时，菌体也会着色，然后水洗，芽胞染上的颜色难以渗出，而菌体会脱色。然后用对比度强的染料对菌体复染，使菌体和芽胞呈现出不同的颜色，因而能更明显地衬托出芽胞，便于观察。,1、革兰氏染色：（1）黄

27、色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大肠杆菌（E.coli）、枯草杆菌，待测菌菌液l2种；（2）革兰氏染色液(结晶紫染液、卢戈氏碘液、95乙醇、石炭酸复红液等)、（3）香柏油、二甲苯；显微镜、擦镜纸、接种环、载玻片、吸水纸、试管、小滴管、酒精灯。,三、实验材料,四、操作步骤（一）革兰氏染色法 1、制片（1）涂菌 用无菌操作方法从试管中沾取菌液一环，用接种环在洁净无脂的载玻片上做一薄而均匀、直径约1cm的菌膜。涂菌后将接种环火焰灭菌。（2）干燥 于空气中自然干燥。亦可把玻片置于火焰上部略加温加速干燥(温度不宜过高)。（3）固定 目的是杀死细菌并使细菌粘附在玻片上，便于染料着

28、色，常用加热法，即将细菌涂片面向上，通过火焰3次，以热而不烫为宜，防止菌体烧焦、变形。此制片可用于染色。,2、染色（1）初染：于制片上滴加结晶紫染液，染1min后，用水洗去剩余染料。（2）滴加卢戈氏碘液，1min后水洗：（3）滴加95乙醇脱色，摇动玻片至紫色不再为乙醇脱退为止(根据涂片之厚薄需时30s至1min)。（4）复染 滴加石炭酸复红液复染1min，水洗。（5）用滤纸吸干，油镜镜检。,制片初染（结晶紫1min）水洗媒染（碘液1min）水洗脱色（乙醇20-30s）水洗复染（番红2min）水洗干燥观察,3、结果革兰氏阳性菌染成篮紫色，革兰氏阴性菌染成淡红色。,革兰氏阴性杆菌,革兰氏阳性杆菌,

29、（二）、芽孢染色法(1)取37培养1824h的枯草芽孢杆菌作涂片，并干燥，固定。(2)于载片上滴入35滴5孔雀绿水溶液。(3)用试管夹夹住载玻片在火焰上用微火加热，自载玻片上出现蒸汽时，开始计算时间约45min。加热过程中切勿使染料蒸干，必要时可添加少许染料。(4)倾去染液，待玻片冷却后，用自来水冲洗至孔雀绿不再褪色为止。(5)用0.5沙黄水溶液(或0.05碱性复红)复染1min，水洗。(6)制片干燥后用油镜观察。芽孢呈绿色，菌体红色。,制片染色（孔雀绿5min）水洗复染（蕃红花红2-3min）水洗干燥镜检,芽孢染色,切勿煮干,芽孢染色结果（芽孢呈绿色，营养体及芽孢囊呈红色）,1载玻片要洁净无

30、脂，否则菌液涂不开。涂片时，滴水不要过多，挑菌量宜少，菌膜宜薄，切忌过厚。2在染色过程中，不可使染液干涸。3在革兰氏染色过程中脱色时间十分重要，过长，则脱色过度，会使阳性菌被染成阴性菌，另外，老龄菌因体内核酸减少，会使阳性菌被染成阴性菌，故不能选用。4供芽孢染色用的菌种应控制菌龄，使大部分芽孢仍保留在菌体上为宜。,注 意 事 项,五、实验报告(一)绘图1绘出你所观察到的细菌的形态。2枯草芽孢杆菌菌体及芽孢形态，芽孢的着生位置。(二)记录革兰氏染色法法步骤，并进行结果分析。六、作业1涂片在染色前为什么要先进行固定?固定时应注意什么问题?2制备染色装片时应注意哪些事项，为什么?制片为什么要完全干燥

31、后才能用油镜观察？3什么是革兰氏染色法?染色过程应注意什么?,一、实验目的 了解目镜测微尺和镜台测微尺的构造和使用原理，掌握微生物细胞大小的测定方法。二、实验原理 微生物细胞的大小是微生物重要的形态特征之一，由于菌体很小，只能在显微镜下来测量。用于测量微生物细胞大小的工具有目镜测微尺和镜台测微尺。,实验七 细菌大小的测定,n1,n2,测微尺的校正（标定）：两重合线间镜台测微尺格数10目镜测微尺每格长度(m)=两重合线间目镜测微尺格数,三、实验内容,注意事项：观察时光线不宜过强,否则难以找到镜台测微尺的刻度;换高倍镜和油镜校正时,务必十分小心,防止接物镜压坏镜台测微尺和损坏镜头。细菌大小的测定：

32、利用制好的血球器浸片，用高倍镜、油镜测出宽和长各占目镜测微尺的格数，再将测到的格数乘以目镜测微尺（用高倍镜时标定的）每格所代表的长度，即为细菌的实际大小。,结果计算长m平均格数校正值宽m平均格数校正值大小表示：宽m长m,四、实验器材活材料：枯草杆菌(Baccillus subtilis)染色标本片。器材：显微镜、目镜测微尺、镜台测微尺、盖玻片、载玻片、滴管、双层瓶、擦镜纸。五、实验方法镜测微尺的校正：在低倍镜和高倍镜、油镜下分别进行校正。细菌大小的测定移去镜台测微尺，换上细菌单染色片，先在低倍镜下找到目的物，然后在高倍镜、油镜下用目镜测微尺来测量菌体的长，宽各占几格（不足一格的部分估计到小数点

33、后一位数）。测出的格数乘上目镜测微尺每格的校正值，即等于该菌的长和宽。一般测量菌体的大小要在同一个标本片上测定1020个菌体，求出平均值，才能代表该菌的大小。而且一般是用对数生长期的菌体进行测定。,六、实验结果及讨论,表1 目镜测微尺校正结果,表2细菌大小测定记录（格）,实验八 酵母菌形态观察、死活细胞鉴别和数量测定,（一）实验目的,1、观察酵母菌的细胞形态及出芽生殖方式；2、学习掌握区分酵母菌死、活细胞的染色方法；3、掌握酵母菌的一般形态特征及其与细菌的区别。4、了解显微镜计数的原理；5、学习并掌握使用血球计数板进行微生物直接计数的方法。,（二）实验原理,酵母菌是多形的、不运动的单细胞真核微

34、生物。无性繁殖主要是出芽生殖。,本实验通过用美蓝染色浸片来观察生活的酵母形态和出芽生殖方式。,美蓝（氧化型）蓝色,美蓝（还原型）无色,还原剂,氧化剂,美蓝是一种无毒性染料，它的氧化型是蓝色的，而还原型是无色的，用它来对酵母的活细胞进行染色。,死活细胞鉴别原理,美蓝（氧化型）蓝色,美蓝（还原型）无色,酵母活细胞,新陈代谢,还原能力,（三）实验器材,1.菌种 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）菌悬液2、染色液和试剂：0.05和0.1%吕氏碱性美蓝染液3、器材：废液缸、载玻片、盖玻片、酒精灯、擦镜纸、显微镜等。显微镜、血球计数板、酒精灯、接种环、无菌水、吸管、盖玻片、计数器

35、。,在载玻片中央加一滴0.1吕氏碱性美蓝染色液，用接种环挑取少量酵母菌苔放入上述液滴里，混合均匀；,用镊子取一块盖玻片，先将一边与菌液接触，然后慢慢将盖玻片放下使其盖在菌液上；,(四）实验方法（美蓝浸片）,染液不宜过多或过少,盖玻片不宜平着放下,将制片放置约3min，先低倍镜后高倍镜观察酵母形态和出芽情况，并根据颜色区别死活细胞。,染色30min后再次观察，注意死活细胞数量的变化；,用0.05的吕氏碱性美蓝染色液重复上述操作。,1、加染液不宜过多或过少，否则，在盖上盖玻片时，菌液会溢出或出现大量气泡而影响观察；2、盖玻片不宜平着放下，以免产生气泡影响观察。,注 意 事 项,（二）血球计数板直接

36、计数,利用血球计数板在显微镜下直接计数，是微生物实验中一种十分重要的常用微生物计数方法。此法的优点是直观、快速，不论微生物的生理状况如何，都可以在显微镜下一一计数。由于此法得到的是活菌和死菌的总和，故又称为总菌计数法。,血球计数板是一块特制的载玻片，其上四条纵槽构成了三个平台，中间的平台又被一短横槽隔成两半，每一边的平台上各刻有一个方格网，每个方格网共分成9个大方格，中央的大方格为计数室。计数室边长1mm，共有400个小方格，加盖玻片于突起部分上时，即形成一个体积为0.1mm3的计数室。计数室的规格有两种：一种是25个中方格16个小格，另一种是16个中方格25个小格，所以小方格的总数是相同的，

37、都为400个。,16小格 25大格计数室,25小格 16大格计数室,计数室的两种刻度形式,Thoma血球计数板 A.正面图 B.纵切面图 1.血球计数板 2.盖玻片 3.计数室,在计数时，通常数五个中方格的总菌数，然后求得每个中方格的平均值，再乘上16或25，就得出一个大方格中的总菌数，然后再换算成1ml菌液中的总菌数。如果设五个中方格的总菌数为A，菌液稀释倍数为B，那么，一个大方格中的总菌数即（0.1mm3中的总菌数）为 A5 16(或25)B。所以1ml菌液中的总菌数=A516（或25）101000B。,（四）实验方法,1.稀释 将酵母菌悬液进行适当稀释，菌液如不浓，可不必稀释。2.镜检计

38、数室 在加样前，先对计数板的计数室进行镜检。若有污物，则需清洗后才能进行计数。3加样品 将清洁干燥的血球计数板盖上盖玻片，再用无菌的细口滴管将稀释的酵母菌液由盖玻片边缘滴一小滴（不宜过多）让菌液沿缝隙靠毛细渗透作用自行进入计数室，一般计数室均能充满菌液。注意不可有气泡产生。,4.显微镜计数 静置几分钟，将计数板放在显微镜下，先用低倍镜找到计数室，再换成高倍镜进行计数；每个计数室选右上右下、左上左下和中间的五个中方格中的菌体进行计数，每个样品重复计数两次5.清洗血球计数板 计数完毕，将计数板在水龙头下冲洗干净后自行晾干或用吹风机吹干，镜检观察每小格内无残留物为止。,1、加样时先摇匀菌液，计数室中

39、不可有气泡产生；2、计数时，格线上的菌体只数上方和右边线上的；3、如遇酵母出芽，芽体大小达到母细胞的一半时，作为两个菌体计算；4、清洗计数板时切勿用手或硬物刷洗。,注 意 事 项,（六）实验作业,绘图说明你所观察到的酵母菌的细胞结构及出芽生殖方式。,1、吕氏碱性美蓝染液浓度和作用时间的不同，对酵母菌死细胞数量有何影响？试分析其原因。2、在显微镜下，酵母菌有哪些突出的特征区别于一般细菌？,（一）实验目的（二）实验原理（三）实验器材（四）实验方法（五）实验作业,实验九 环境条件对微生物 生长的影响,（一）实验目的,1、了解温度、化学药品对微生物生长的 影响；2、区别微生物的最适生长温度、pH与最

40、适代谢温度、pH。,（二）实验原理,微生物生长繁殖要有一定的温度条件，不同的微生物要求不同的生长温度范围。如温度超过最高或最低温度时，微生物均不能生长，或处于休眠状态，甚至死亡。微生物的生长繁殖，需要一定的pH值范围，即环境中的氢离子浓度对微生物的生长繁殖有直接的影响，当环境的pH值超过其适于生长的范围时，微生物的生长则受到明显的阻抑或不能生长。,（三）实验器材,1.菌种 枯草杆菌、大肠杆菌 2.培养基 牛肉膏蛋白胨琼脂斜面 准确分装为3ml的牛肉膏蛋白胨培养液3支3.器具 0.2 M K2HPO4、0.1M柠檬酸、0.2M硼酸、0.2MNaOH 酒精灯、lml无菌吸管、接种环、冰箱、恒温箱,

41、（四）实验方法,温度对酶活的影响1接菌按无菌操作方法进行。（1）在3支牛肉膏琼脂斜面培养基上都接种上枯草杆菌，接种时划曲线或直线。（2）在另3支牛肉膏琼脂斜面上都接种上大肠杆菌，接种时划直线或曲线。2培养与观察（1）培养 将上述接好的菌种，分别放入4、37、50五种温度下培养。（2）观察 24小时后观察，记录实验结果。,pH对酶活的影响1调pH值 取足量分装为3ml的牛肉膏蛋白胨培养液3支，分别加入各种溶液，调成不同pH值的培养液;2按无菌操作方法，分别于各管中各接种大肠杆菌0.2ml，分别标明试管序号;3将上述接种好的培养物置于37下培养。24小时后观察记载实验结果。,五、作业,注：生长情况

42、记载可采用：不生长（）；生长一般（）；生长良好（）。2高温和低温对微生物生长各有何影响？为什么？,1记载实验结果，填入下表。,3记载结果，填入下表：,注：根据混浊程度，确定生长情况：不生长（-）；稍生长（）；生长一般（）；生长良好（）4氢离子浓度对微生物生长有何影响？,实验十 平板菌落计数法 及比浊法,一、实验目的 1、了解稀释平板计数的原理2、掌握涂抹平板培养法3、认识细菌的菌落特征4、了解细菌比浊法的原理与操作,三、实验器材活材料：大肠杆菌菌悬液培养基：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基器材：90ml无菌水、9ml无菌水、无菌平皿、lml无菌吸管、天平、称样瓶、记号笔、玻璃刮铲等，721型分光光度计。

43、,二、基本原理 平板菌落计数法是将待测样品经适当稀释之后，其中的微生物充分分散成单个细胞，取一定量的稀释样液接种到平板上，经过培养，由每个单细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落。为了清楚地阐述平板菌落计数的结果，现在已倾向使用菌落形成单位(colony-forming units,cfu)而不以绝对菌落数来表示样品的活菌含量。在一定范围内，微生物细胞浓度与透光度成反比，与光密度成正比，而光密度（OD）可由721型分光光度计测定。,操作步骤,9ml,4.5ml,1ml,0.5ml,0.1ml,10-1,倒培养基、贴标签,0.5ml,0.5ml,0.5ml,4.5ml,4.5ml,4.5ml,4.5ml,4.5ml,10-2,10-3,10-4,10-5,10-6,梯度稀释,取样,涂布,37倒置培养,计数,梯度稀释：菌悬液必须摇匀移液枪的使用：调刻度、取样、去除枪头涂布操作测OD值先摇匀再放入比色皿中测定,注 意 事 项,四、实验报告与讨论,