微生物学实验王振河.ppt

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1、微生物学实验王振河,微生物实验的意义、研究进展和实验内容,一、研究内容 研究微生物的形态、结构、生理生化 遗传变异、微生物与其他生物、与自然界之间的关系 1.机理研究：微生物适应环境的机制 鞭毛运动的机理等 是生化和分子生物学研究的重要内容,2.微生物与实际应用,微生物与发酵工程微生物与环境工程微生物与农业微生物与医学领域微生物与食品工业,二、微生物学研究进展,微生物基因组学研究（Microbial Genomics）不可培养微生物（Uncultured Microorganisms）DNA芯片（DNA Chip）三域学说（Bacteria,Archae,Eucaryote）,三、微生物学与N

2、obel奖,到目前为止，几十项Nobel生理学和医学奖，化学奖都与微生物学有关 参考：沈萍教授微生物学绪论部分 Nobel获奖者全书,四、如何进行微生物学实验,严肃认真 科学态度 分析问题 搞清原理,五、微生物实验安排与考核,基础实验：80%，12次，一次考试自主设计实验：20%设计实验方案 实验操作 总结 汇报,微生物实验课注意事项,课程简介：必修课，24学时、1个学分考试成绩按以下公式计算：,平时（10）操作考试（20）笔试（70）,课堂纪律,严格遵守实验室规章制度严肃课堂纪律 不允许无故旷课、早退（1次）迟到（3次）工作服,实验室安全和卫生,安全实验室严禁吸烟。注意用水、防电和防火正确使

3、用化学试剂和仪器,卫生每次实验需留下6位同学值日，协助保持实验室清洁,实验一 细菌的单染色及油镜的使用,实验目的实验原理实验材料实验步骤实验结果问题与讨论,一、实验目的,学习并掌握普通光学显微镜的构造和油镜的使用技术及维护的基本知识学习微生物涂片、单染色的基本技术初步认识细菌的形态特征，学习简单的无菌操作技术,二、实验原理1,显微镜的构造 1.光学部分:目镜、物镜、照明装置(聚光镜、虹彩光圈、反光镜等)。它使检视物放大,生成物象。,2.机械部分:镜座、镜臂、镜筒、物镜转换器、载物台、载物台转移器、粗调节器、细调节器等部件.它起着支持 调节 固定等作用.,图1-1-2 光学显微镜的成像原理,显微

4、镜的放大倍数和分辨率 1.放大倍数：物镜放大倍数目镜放大倍数 2.显微镜的分辨率:是表示显微镜辨析两点之间距离的能力。可用公式表示为：D=/2nsin(/2)式中D：物镜分辨出物体两点间的最短距离。：可见光的波长（平均0.55m)n:物镜和被检标本间介质的折射率。：镜口角（即入射角）。,D值越小，分辨率越高，看到的物象越清晰,油镜使用的原理 油镜，即油浸接物镜。当光线由反光镜通过玻片与镜头之间的空气时，由于空气与玻片的密度不同，使光线受到曲折，发生散射，降低了视野的照明度。若中间的介质是一层油（其折射率与玻片的相近），则几乎不发生折射，增加了视野的进光量，从而使物象更加清晰。,根据公式D=/2

5、nsin(/2)，增大分母，使得D值减小，分辨率增大。,1.不准擅自拆卸显微镜的任何部件,以免损坏。2.镜面只能用擦镜纸擦，不能用手指或粗布，以保证光洁度3.观察标本时，必须依次用低、中、高倍镜，最后用油镜。当目视接目镜时，特别在使用油镜时，切不可使用粗调节器，以免压碎玻片或损伤镜面。4.拿显微镜时，一定要右手拿镜臂，左手托镜座，不可单手拿，更不可倾斜拿。5.显微镜应存放在阴凉干燥处，以免镜片滋生霉菌而腐蚀镜片。,显微镜保养和使用中的注意事项,油镜的使用,待后边演示,二、实验原理2,细菌的单染色细菌细胞微小，透明，不易观察，需染上颜色。利用单一染料对细菌进行染色，使经染色后的菌体与背景形成明显

6、的色差，从而能更清楚地观察到其形态和结构。染色前必须固定细菌，其目的是：一是杀死细菌并使菌体粘附于玻片上。二是增加其对染料的亲和力。常用的有加热和化学固定两种方法。固定时尽量维持细胞原有的形态。,三、实验材料,奥林巴斯双筒普通光学显微镜沙黄染色液。培养24h的大肠杆菌（E.coli)载玻片、接种环、酒精灯、香柏油、二甲苯、擦镜纸、吸水纸等。,四、实验步骤,一、制作大肠杆菌观察片,现场演示,二、显微操作,现场演示,1.低倍镜观察：粗调、细调。依次再进行中倍、高倍观察2.油镜观察：高倍镜下找到清晰的物象后，提升聚光镜，在标本中央滴一滴香柏油，使油镜镜头浸入香柏油中，细调至看清物象为止。3.换片：另

7、换新片，必须从第三条开始操作。4.用后复原：观察完毕，上悬镜筒，先用擦镜纸擦去镜头上的油，然后再用擦镜纸沾取少量二甲苯擦去残留的油，最后用擦镜纸擦去残留的二甲苯，后将镜体全部复原。注意：油镜使用完毕后一定要用二甲苯擦拭镜头,五、实验结果,用油镜观察大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和口腔微生物的染色标本，并绘图。,六、问题与讨论,1.涂片为何要固定？固定加热时间过长会怎样？2.使用油镜时，为什么必须用香柏油？3.镜检标本时，为什么先用低倍镜观察，而不是直接用高倍镜或油镜观察？,内容回顾,一、原理显微成像原理油镜使用原理单染色原理,二、技术和方法无菌操作技术制片和单染色方法显微镜使用方法,本次实验课结束请

8、确保油镜头擦拭干净！请第一排同学留下值日下周再见！,用于生物染色的染料主要有碱性染料、酸性染料和中性染料三大类。碱性染料的离子带正电荷，能和带负电荷的物质结合。因细菌蛋电质等电点较低，当它生长于中性、碱性或弱酸性的溶液中时常带负电荷，所以通常采用碱性染料(如美蓝、结晶紫、碱性复红或孔雀绿等)使其着色。酸性染料的离子带负电荷，能与带正电荷的物质结合。当细菌分解糖类产酸使培养基pH值下降时，细菌所带正电荷增加，因此易被伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料着色。中性染料是前两者的结合物又称复合染料如伊红美蓝、伊红天青等。,实验二 细菌染色法及微生物的观察,简单染色法是只用一种染料使细菌着色以显示其形态的

9、方法难于辨别细菌细胞的构造。,革兰氏染色法法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌(G)和革兰氏阴性菌(G)两大类，是细菌学上是常用的鉴别染色法。该染色法所以能将细菌分为G菌和G菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。G菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经番红复染后就成红色。G菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色。,细菌荚膜染色的原理是因为荚膜和染料间的亲和

10、力弱，不易着色，通常采用负染色法染荚膜，即设法使菌体和背景着色而荚膜不着色，从而使荚膜在菌体周围呈一透明圈。由于荚 膜的含水量在90以上，固染色时一般不加热固定，以免荚膜皱缩变形。细菌的芽胞具有厚而致密的壁，透性低，不易着色，若用一般染色法只能使菌体着色而芽胞不着色(芽胞呈无色透明状)。芽胞染色法就是根据芽胞既难以染色而一旦染上色后又难以脱色这一特点而设计的。所有的芽胞染色法都基于同一个原则：除了用着色力强的染料外，还需要加热，以促进芽胞着色。当染芽胞时，菌体也会着色，然后水洗，芽胞染上的颜色难以渗出，而菌体会脱色。然后用对比度强的染料对菌体复染，使菌体和芽胞呈现出不同的颜色，因而能更明显地衬

11、托出芽胞，便于观察。,细菌的鞭毛极细，直径一般为1020nm，只有用电子显微镜才能观察到。但是，如采用特殊的染色法，则在普通光学显微镜下也能看到它。鞭毛染色的方法很多但其基本原理相同，即在染色前充用媒染剂处理，让它沉积在鞭毛上使鞭毛直径加粗。然后再进行染色。,一、实验目的和内容目的：巩固无菌操作技求，掌握细菌及其结构的染色技术。内容：1、学习细菌单染色操作技术。2、学习革兰氏染色技术。3、学习细菌的荚膜、芽孢及鞭毛染色方法。,二、实验材料和用具 1、单染色法：（1）大肠杆菌(E.coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的斜面菌种。（2）吕氏美蓝染色液、石炭酸复红

12、染色液、黑色素液或碳素墨水、香柏油、二甲苯、无菌水（3）显微镜、擦镜纸、接种环、酒精灯、载玻片、吸水纸、无菌牙签。,2、革兰氏染色：（1）黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大肠杆菌（E.coli）菌液，待测菌菌液l2种；（2）革兰氏染色液(结晶紫染液、卢戈氏碘液、95乙醇、石炭酸复红液等)、（3）香柏油、二甲苯；显微镜、擦镜纸、接种环、载玻片、吸水纸、试管、小滴管、酒精灯。,3、荚膜染色：(l)在阿须贝(Ashby)无氮培养基上培养35天的团褐固氮菌(Azotobacter chroococcum)或者培养23天的硅酸盐细菌(Bacillus mucilaginosu

13、s subsp silicus)(2)李夫森氏染色液、硼酸钠美兰染色液、石炭酸复红染色液、黑色液。(3)载玻片、接种环、洗瓶。(4)显微镜。,4、鞭毛染色：(1)在牛内膏蛋白胨斜面上培养1924小时的假单孢菌(Pseudomonas.sp)，此培养体在取用前经过每日移植代，连续移植57代。(2)新配制的费氏及康氏鞭毛染色液A和B。(3)无菌水、无菌空试管、凹玻片。盖玻片、洁净载玻片、接种环、洗瓶。(4)显微镜,5、芽孢染色：(1)在牛肉膏蛋白胨斜面上培养2436小时的枯草杆菌或者苏云金杆菌。(2)载玻片、接种环、酒精灯、洗瓶、镊子。(3)显微镜。(4)香柏油、二甲苯、擦镜纸(5)孔雀绿染色液、

14、蕃红染色液。,三、操作步骤 1、单染色法（1）涂片 在洁净无脂的载玻片中央滴一小滴无菌水（图410a），用无菌操作方法从菌种斜面挑取少量菌体与水滴充分混匀，涂成薄膜，涂布面积约11.5cm2（图410b）。（2）干燥 将涂片于室温中自然干燥。（3）固定 手执载片端，使涂菌的一面向上，将载片通过微火23次。在火上固定时，用手摸涂片反面，以不烫手为宜。不能将载片在火上烤，否则细菌形态毁坏(图410c)。,（4）染色 将涂片置于水平位置，滴加染色液覆盖于涂菌处，染色约2min(图410d)。（5）水洗 倾去染色液，斜置载片，用自来水的细水流由载片上端流下，不得直接冲在涂菌处，直洗至从载片上流下的水中

15、无染色液的颜色为止(图410e)。（6）干燥 自然晾干或用吸水纸轻轻地吸干，注意不要擦掉菌体(图410f)。（7）待标本完全干燥后，先用低倍镜和高倍镜观察，将典型部位移至视野中央，再用油镜观察。,图410 单染色方法,（二）革兰氏染色法 1、制片（1）涂菌 用无菌操作方法从试管中沾取菌液一环，用接种环在洁净无脂的载玻片上做一薄而均匀、直径约1cm的菌膜。涂菌后将接种环火焰灭菌。（2）干燥 于空气中自然干燥。亦可把玻片置于火焰上部略加温加速干燥(温度不宜过高)。（3）固定 目的是杀死细菌并使细菌粘附在玻片上，便于染料着色，常用加热法，即将细菌涂片面向上，通过火焰3次，以热而不烫为宜，防止菌体烧焦

16、、变形。此制片可用于染色。,2、染色（1）初染：于制片上滴加结晶紫染液，染1min后，用水洗去剩余染料。（2）滴加卢戈氏碘液，1min后水洗：（3）滴加95乙醇脱色，摇动玻片至紫色不再为乙醇脱退为止(根据涂片之厚薄需时30s至1min)。（4）复染 滴加石炭酸复红液复染1min，水洗。（5）用滤纸吸干，油镜镜检。,3、结果革兰氏阳性菌染成篮紫色，革兰氏阴性菌染成淡红色。4、检测未知菌用以上方法对未知面进行革兰氏染色，并绘图、记录染色结果。,（三）荚膜染色法1石炭酸复红染色(1)取培养了72h的褐球固氮菌制成涂片，自然干燥(荚膜是多糖类物质，不可用火焰烘干)。(2)滴入12滴95乙醇固定(不可加

17、热固定)。(3)加石炭酸复红染液染色12min，水洗，自然干燥。(4)在载玻片一端加一滴墨汁，另取一块边缘光滑的载玻片与墨汁接触，在以匀速推向另一端，涂成均匀的一薄层，自然干燥。(5)干燥后用油镜观察。菌体红色，荚膜无色，背景黑色。,2背景染色(1)先加1滴墨水于洁净的玻片上，并挑少量褐球固氮菌与之充分混合均匀。(2)放一清洁盖玻片于混合液上，然后在盖玻片上放一张滤纸，向下轻压，吸收多余的菌液。(3)干燥后用油镜观察。背景灰色，菌体较暗在其周围呈现一明亮的透明圈即荚膜。,3李夫森氏硼酸钠美兰染色（1）取在阿须贝氏无氮培养基上培养3天的硅酸盐细菌少许，制成干燥涂片(不要加热固定)。（2）加李夫森

18、氏染色液染色l0min，倾之染液(勿用水洗)。（3）加硼酸钠美兰染色液染色5min，水洗，晾干。（4）油镜视察可见荚膜被染成红色，菌体处成蓝色。,（四）鞭毛染色法 1方法一：（1）用接种环由培养1820h的斜面上取假单胞菌菌体少许，用菌滴制片法检查细菌的运动性。如果菌体的运动性很强，则可作鞭毛染色。（2）用34mL无菌水，将培养体洗下，移入另一无菌试管中，适温培养10min，再检查运动性。,（3）用无菌吸管由悬液上部取一小滴，置于一清洁载玻片的一端，将玻片倾斜。使菌液由一端流向另外一端。于是在玻片上做成23条菌液带。待水膜自然干燥（切勿用火焰烘）。（4）用刚刚过滤的鞭毛染色液A染色5min(不

19、要加热)。（5）倾去A液，加鞭毛染色液B染色10min。用蒸馏水轻轻冲洗，晾干。（6）用齐氏石炭酸复红染色23min。轻轻冲洗，晾干(不能用吸水纸吸干)。（7）先用低倍镜，再用高倍镜，最后用油镜检查。,2方法二：（1）制涂片：先加少量无菌蒸馏水于凹载玻片的凹窝中再从培养10h左右的斜面菌苔上取菌一环，轻放在凹窝水面上(不要搅动)，放30度温箱静置510min取出，从凹窝水面上轻轻取菌液一环，轻放在干净的载玻片上(不要涂抹)，放回温箱，让其自然干燥(不要加热固定)。（2）染色：在自然干燥的涂片上，滴加含石炭酸的鞭毛染色液一滴，染色5min，用水轻轻冲洗，让其自然干燥。（3）镜检：用油镜观察。,五

20、）芽孢染色法1方法一：(1)取37培养1824h的枯草芽孢杆菌作涂片，并干燥，固定。(2)于载片上滴人35滴5孔雀绿水溶液。(3)用试管夹夹住载玻片在火焰上用微火加热，自载玻片上出现蒸汽时，开始计算时间约45min。加热过程中切勿使染料蒸干，必要时可添加少许染料。(4)倾去染液，待玻片冷却后，用自来水冲洗至孔雀绿不再褪色为止。(5)用0.5沙黄水溶液(或0.05碱性复红)复染1min，水洗。(6)制片干燥后用油镜观察。芽孢呈绿色，菌体红色。,2方法二：(1)加12滴自来水于小试管中，用接种环从斜面上挑取23环培养1824h的枯草芽孢杆菌菌苔于试管中，并充分均匀打散，制成浓稠的菌液。(2)加5孔

21、雀绿水溶液23滴于小试管中用接种环搅拌使染料与菌液充分混合。(3)将此试管浸干沸水浴(烧杯)中，加热1520min。(4)用接种环从试管底部挑数环菌于洁净的载玻片上，并涂成薄膜，将涂片经过微火3次固定。(5)水洗，至流出的水中无孔雀绿颜色为止。(6)加沙黄水溶液，染23min后，倾去染液，不用水洗。(7)干燥后用油镜观察。芽孢绿色，菌体红色。,四、注意事项1载玻片要洁净无脂，否则菌液涂不开。涂片时，滴水不要过多，挑菌量宜少，菌膜宜薄，切忌过厚。2在染色过程中，不可使染液干涸。3在革兰氏染色过程中脱色时间十分重要，过长，则脱色过度，会使阳性菌被染成阴性菌，另外，老龄菌因体内核酸减少，会使阳性菌被

22、染成阴性菌，故不能选用。3 荚膜染色涂片不要用加热固定，以免荚膜皱缩变形。4 鞭毛染色液最好当日配置，次日使用则鞭毛染色浅，观察效果差。染色时一定要充分洗净A液后再加B液，否则背景不清晰。5供芽孢染色用的菌种应控制菌龄，使大部分芽孢仍保留在菌体上为宜。,五、实验报告(一)绘图1单染色后观察到的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的形态图。2大肠杆菌革兰氏染色视野图。3金黄色葡萄球菌革兰氏染色视野图。4褐球固氮菌菌体及荚膜的形态。4绘出你所观察到的细菌的形态及鞭毛着生情况。6枯草芽孢杆菌及巨大芽孢杆菌的菌体及芽孢形态，芽孢的着生位置。(二)单染色法操作要点。(三)记录革兰氏染色法法步骤，并进行结果分析。,六

23、、问题和思考1涂片在染色前为什么要先进行固定?固定时应注意什么问题?2制备染色装片时应注意哪些事项，为什么?制片为什么要完全干燥后才能用油镜观察？3什么是革兰氏染色法?染色过程应注意什么?4试分析革兰氏染色法在细菌分类中的意义。5组成荚膜的成分是什么?涂片一般用什么固定方法，为什么?6鞭毛染色的菌种为什么要先连续传几代，并且要采用幼龄菌种?7根据你的实验体会，哪些因素影响鞭毛染色的效果?如何控制?,一、实验目标与基本要求 学习并掌握酵母菌和子囊孢子的观察方法。二、实验内容 1观察酵母菌菌落形态 2制作酵母菌常规涂片，染色并用油镜观察菌体和子囊孢子。,实验三 酵母菌的形态观察,三、实验步骤：1、

24、菌落特征和菌苔特征的观察：取啤酒酵母，面包酵母用划线的方法接种在平板培养基上，28-30培养3天，观察菌落表面干燥或湿润、隆起形状、边缘整齐度、大小、颜色等，并用接种环挑菌，注意与培养机结合是否紧密。取斜面培养的啤酒酵母、面包酵母、假丝热带酵母观察菌苔特征。,啤酒酵母的菌落,红酵母的菌落,各种酵母菌的菌落,酵母菌的细胞形态,酵母菌的细胞形态,大多数酵母菌的菌落特征与细菌相似，但比细菌菌落大而厚，菌落表面光滑、湿润、粘稠，容易挑起，菌落质地均匀，正反面和边缘、中央部位的颜色都很均一，菌落多为乳白色，少数为红色，个别为黑色。,2、个体形态与出芽生殖 用水浸片法观察，根据酵母菌是否染上兰色可以区别细

25、胞的死活（这里的利用美蓝是一种弱的氧化剂，还原后变为无色的特性，活细胞具有还原力，故将其还原 变为无色）。,酵母菌的芽殖过程 1泡；2小管；3核；4液泡,3、裂殖酵母的观察：用水浸片法观察。,酵母菌子囊孢子的形成过程 1、2、3、4：两个细胞结合；5：接合子；6、7、8、9：核分裂；10、11：核形成孢子,酵母菌假菌丝的形成 图中1、2、3、4 是出芽的顺序,a、培养 一划线法将假菌丝酵母接种在麦芽汁平板上，在划线部分加盖玻片，培养2-3天。b、制片与观察 取下盖玻片，盖在加有一0.1%美蓝的载玻片上（即水浸片法），即可观察菌体呈树枝壮分支。或直接将培养皿放在低倍镜下观察。,4、假丝酵母的观察

26、：水浸片法观察,5、子囊孢子的观察 将面包酵母接种于麦芽汁或豆芽汁液体培养基中，28-30度培养24h，如此连续传代3-4次，使其生长良好，然后转到醋酸钠斜面培养基上25-28度培养3天。用水浸片法制片或用芽孢染色，观察子囊孢子形状，并注意每个子囊内的子囊孢子数目。,四、实验报告绘图1数个酵母菌细胞，示观察到的结构。2数个子囊及子囊孢子形态图。六、问题和思考 酵母菌的假菌丝是怎样形成的?与霉菌的真菌丝有何区别?,一、实验目与基本要求：学习并掌握观察霉菌形态的基本方法，了解常见霉菌的基本特征。二、实验内容：1观察霉菌菌落形态。2用显微镜观察霉菌装片。3制作霉菌装片并观察其形态。,实验四 霉菌的形

27、态观察,三、实验步骤（一）菌落特征的观察 用肉眼观察生长在琼脂平板上的各种霉菌菌落，并根据下列要求对每种霉菌的菌落特征加以描述。1.菌落的大小：局限生长或蔓延生长，菌落的直径和高度。2.菌落的颜色：正面和背面的颜色，培养基的颜色变化。3.菌落的形态：棉絮状、网状、疏松或紧密、同心轮纹、放线状的皱褶等。,霉菌菌落,各种曲霉的菌落,各种病原真菌的菌落,青霉的菌落,青霉的菌落,霉菌菌丝 A、无隔菌丝 B有隔菌丝,隔膜,（二）个体形态特征的观察1.乳酸石炭酸制片法观察（1）制片：在干净的载玻片上加一滴乳酸石炭酸，用接种针从菌落边缘处取小量带有孢子的菌丝置于液体中，再小心地把菌丝放开，然后用盖玻片盖上，

28、注意不要产生气泡。,（2）镜检：1）毛霉和黑根霉的孢子的形状、颜色、大小、孢子囊、中轴体的形状，有无假根和葡萄菌丝。2）黑曲霉的分生孢子的形状、颜色、大小、顶囊的形状、小梗排列隔膜。3）青霉的分生孢子的形状、颜色、大小、小梗的排列方式，菌丝的隔膜。,（3）将观察结果绘图，并注意各部分名称。,霉菌的静孢子左：毛霉的孢子囊；中：孢子囊壁破裂，露出静孢子；右：囊轴,曲霉的分生孢子梗和顶囊上的分生孢子,青霉的帚状分生孢子梗和分生孢子,曲霉的分生孢子头彩图,霉菌的厚垣孢子,2.插片培养观察：（1）插片培养：将已灭菌的盖玻片斜插入培养基平板上，一半露在外面，然后沿盖玻片与培养基交接处接种霉菌孢子悬液。24

29、到26度恒温培养2到4天。（2）制片、镜检：以无菌操作取下盖玻片，有菌面朝下，放在滴有一滴棉兰染液的载玻片上。,四、实验报告绘制镜检形态图 1毛霉和根霉形态图，示各部。2青霉和曲霉形态图，示各部五、问题和思考 1什么叫载玻片湿室培养?它适用于观察怎样的微生物，有何优点?2湿室培养时为何用20%甘油作保湿剂?,一、实验教学目标基本与要求 1、明确培养基的配制原理。2、掌握配制培养基的一般方法和步骤。二、实验内容 1、介绍培养基的配制原理和方法步骤 2、动手称量试剂、配制牛肉蛋白胨培养基等。,实验五 培养基的制备,三、实验材料,每组同学需要准备以下材料（2人/组）：小试管：12支（15*150mm

30、）培养皿：12套（9cm）吸管：3支（1ml）三角玻扒：2支 烧杯：1套（50ml，100ml，250ml，500ml）量筒：1个（100ml）玻棒：1支 分液漏斗：1套 药匙：2把 剪刀：1把 铁丝：数支 标签贴纸：1张 铅笔：1支 10ML玻璃吸管：1支,培养基配方：,四、实验内容,肉汤培养基：营养肉汁1g 自来水50ml PH7.2麦芽汁培养基：麦芽汁5g 自来水50ml 自然PH固体培养基：由液体培养基加2琼脂,四、实验内容,（一）、培养基的配制：同学们先将试管贴好标签。注明培养基名称，组别，日期。标签粘贴位置在离管口1/3管身处。注意：标签用铅笔书写，以防高温灭菌时蒸汽模糊字迹。操作

31、图示：,称量-配置-调节pH值-过滤-分装-灭菌1.称量 按照培养基配方，准确称量各成份放于烧杯中。对于不是粉状（如肉膏），应用烧杯称量。,2.配调 向烧杯中加入适量的水，搅拌，使其溶解（可加热助溶）。如是配制固体培养基，在琼脂的熔化时，需不断搅拌，并控制火力不要使培养基溢出或烧焦。待完全熔化后，补足所失水分。如果配方中含有淀粉，先将淀粉用少量冷水调成糊状并在火上加热搅拌，然后加足水分及其他药品，待完全熔化后补足所失水分。,3.调节pH值 培养基溶解均匀并冷却至室温时用pH试纸测pH，然后根据要求加酸或碱（一般用1molHcl和1molNaOH），要缓慢少量且多加搅拌。培养基配方为自然pH时，

32、不用调节。4.过滤 用滤纸或多层纱布过滤，一般无特殊要求可省去。,5.分装 将制好的培养基分装入试管内或三角瓶内，管（瓶）口塞上棉塞。固体培养基要趁热装。分装时要避免培养基粘染管（瓶）口，引起污染。分装量可分为下面几方面：（1）斜面：装量为管长的1/4-1/5。（2）液体培养基、高层培养基、半固体培养基：装载量不超过管长的1/3。（3）三角瓶：装量不超过容积1/2。,6.灭菌 塞棉塞，包扎，灭菌。高压蒸汽灭菌法：是在密闭的加压容器内进行，加热使器内的水产生蒸汽，由于密闭，增加了器内的压力，使水的沸点升高，从而获得高于100度的蒸汽温度。,1配制肉汤斜面培养基50 mL 将小烧杯置天平上，用药匙

33、取营养肉汤干燥培养基，称取1 g先加少量自来水，溶解彻底再转移到量筒，定容至50ml，然后倒在250 mL烧杯里，加入琼脂1g（2%），浸泡于液体培养基里，液面位置做好标记，在电炉上加热融化后（注意补充蒸发的水分以保持原体积不变），用分液漏斗分装6支小试管，每支5 mL左右（约试管高度的1/5左右），用硅胶塞塞好试管口，再用防潮纸和棉绳将试管塞罩住扎成一捆。图4-10 用漏斗分装培养基及摆斜面2配制麦芽汁斜面培养基（方法同上）,四、实验内容,3注意事项：本实验使用调配好的“干燥培养基”，这种培养基是将新鲜配制的液体培养基用喷雾干燥法，真空干燥法，低温干燥法或蒸发干燥法等将培养基内所含的水分去掉

34、；或将培养基内的各种固形成分，经适当处理，充分混匀，便成干燥粉末而成。使用时只要按比例加入一定量的水，经溶解，无需调pH，分装，高压蒸汽灭菌，即可使用。“干燥培养基”成品很容易吸潮，在称量时动作要迅速。另外，称药品时严防药品混杂，一把药匙用于一种药品，或称取一种药品后，洗净，擦干，再取另一种药品。瓶盖也不要盖错。在烧杯融化琼脂的过程中，人要在电炉旁看着，以免培养基因沸腾而溢出烧杯。同时，需不断搅拌，以防琼脂糊底烧焦。注意带上棉纱手套防止烫伤。分装过程中，注意不要使培养基沾在管口上，以免沾污棉塞而引起污染。,四、实验内容,（二）培养基灭菌 培养基分装好后，塞上棉塞，外面再包一牛皮纸，便可灭菌。灭

35、菌的时间和温度按各培养基规定进行，以保证灭菌效果和不损坏培养基的必要成分。培养基经灭菌后，可放在37恒温箱培养24小时，无菌者方可使用。在实验室里用得最多的加热灭菌法是高压蒸汽灭菌和干热灭菌。一般培养基和灭菌水等用高压蒸汽灭菌，而玻璃器皿常用干热灭菌。蒸汽灭菌为105-121，15-20分钟，干热灭菌为160-170，1-2小时。目的都是使细菌体内蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。在同一温度下，湿热杀菌效力比干热大，因为在湿热情况下，菌体吸收水分，使蛋白质易于凝固，同时湿热穿透力强，而且当蒸汽与被灭菌物体接触凝成水分时，又可放出热量，使温度迅速增高，从而增加灭菌效力。,四、实验内容,（三）包扎1

36、培养皿：以旧报纸密密包紧，一般以6套做一包，待灭菌。2吸管：在距其粗头顶端约0.5cm处，塞一小段1.5cm长的棉花。棉花要塞得松紧恰当（过紧，吹吸液体太费劲；过松，吹气时棉花会下滑），然后分别将每支吸管尖端斜放在旧报纸条的的近左端，与报纸约呈60角，并将右端多余的报纸打一小结。3三角玻扒：跟包扎吸管相似，将三角部分斜放在报纸条的近左端，与报纸约呈45角，并将右端多余的报纸打一小结。,四、实验内容,五、实验报告,思考题：培养基应具备哪些条件?在培养基配制操作过程中应注意什么问题?为什么?培养基配好后，为什么必须立即灭菌?如何检查灭菌后的培养 基是无菌的?高压蒸汽灭菌的关键为什么是高温而不是高压

37、?高压蒸汽灭菌 前为什么要将灭菌锅内的冷空气排尽?灭菌完毕后什么情况下 才可以开锅盖取出灭菌物品?玻璃器皿为什么在灭菌前要先行干燥?对含糖(如含葡萄糖或乳糖等)培养基进行高压蒸汽灭菌时，应采用多大压力，多长时间灭菌为宜?加热蒸汽灭菌为什么比干热灭菌所要求的温度低、时间短？干热灭菌完毕后，在什么情况下才可开箱取物？为什么？,四、实验报告记录本实验配制培养基的名称、数量，并图解说明其配制过程，指明要点。五、问题和思考 l配制培养基有哪几个步骤?在操作过程中应注意些什么问题?为什么?2培养基配制完成后，为什么必须立即灭菌?若不能及时灭菌应如何处理?已灭菌的培养基如何进行无菌检查?,实验六 消毒与灭菌

38、,一、实验教学目标与基本要求 了解消毒和灭菌的原理，掌握各种灭菌方法的操作步骤。二、实验内容：1干热灭菌法 2高压蒸汽灭菌 3紫外线灭菌法,三、实验步骤（一）干热灭菌法1、原理 利用高温使微生物细胞内的蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。所需温度(160-170)，时间长(1-2h)。注：干热灭菌温度不能超过180，否则，包器皿的纸或棉塞就会烧焦，甚至引起燃烧。2、步骤,恒温,降温,开箱取物,升温,装入待灭菌物品,（二）高压蒸汽灭菌 1、原理 利用加热一个密闭的加压灭菌锅，使灭菌锅隔套间的水沸腾而产生蒸气。由于蒸气不能溢出，而增加了灭菌锅内的压力，从而使沸点增高，得到高于100的温度。导致菌体蛋白

39、质凝固变性而达到灭菌的目的。一般培养基用0.1Mpa，121.5,1530min 2、步骤,加水,装待灭菌物品,加盖,加热,灭菌时间到后断电源,压力降为零开箱取物,（三）紫外线灭菌法1、原理 紫外线杀菌机理主要是因为它诱导了胸腺嘧啶二聚体的形成和DNA 链的交联，从而抑制了DNA 的复制。另一方面，由于辐射能使空气中的氧电离成O，再使O2 氧化生成臭氧或使水氧化生成H2O2。O3 和H2O2 均有杀菌作用。适用于无菌室，接种箱，手术室内的空气及物体表面的灭菌。,2、步骤 1）单用紫外灯 在无菌室内或在接种箱内打开紫外线灯开关，照射30min，将开关关闭。2）化学消毒剂与紫外线照射结合使用 在无

40、菌室内，先喷洒化学消毒剂溶液，再用紫外线灯照射15imn,四、实验报告 记录无菌检查结果五、问题和思考 1.高压蒸气灭菌开始之前，为什么要将锅内冷空气排尽?灭菌完毕后，为什么待压力降低“0”时才能打开排气阀，开盖取物？2.过滤除菌应注意哪些问题?,实验七 微生物接种技术一、教学目标与基本要求：掌握各种微生物接种的基本操作技术。二、实验内容 1斜面接种 2液体接种 3穿刺接种 4平板接种,三、实验步骤 将有菌的材料或纯粹的菌种转移到另一无菌的培养基上，这个过程就称为接种。常用的几种方法如下：斜面接种液体接种穿刺接种平板接种,1.斜面接种：从已长好微生物的菌种管移接到另一斜面管的方法。此法用于好气

41、性微生物的接种。左手持菌种管和斜面管，使斜面向上，并尽量放平。用右手先将棉塞拧转松动，再拿接种环，用右手的小指、无名指和手掌拨下棉塞并夹紧，同时将管口在火焰上燃烧一圈，接种环灼烧灭菌后插入管内，冷却、挑菌，立即转入斜面管底部，沿斜面划曲线或直线。,斜面接种示意图,2.液体接种：由斜面菌接种到液体培养基（如试管或三角瓶等）中的方法。操作与上法基本一致，只是在将接种环送入液体培养基中时使环在液体与管壁接触的地方轻轻磨擦，使菌体分散，然后塞上棉塞，再轻轻摇动均匀，即可培养。如果菌种是培养在液体培养基中时，一般用移液管或滴管接种。,3.穿刺接种：用接种针挑取菌种后，插入深层固体培养基内，（不要刺到底部

42、），再沿原路拔出，此法用于厌气性细菌接种、检查细菌的运动能力。4.平板接种：将菌种接至培养皿的方法，平板接种的目的是观察菌落形态、分离纯化菌种，活菌计数以及在平板上进行各种试验时采用的一种接种方法，可分为下面几种：,1)斜面接平板a.划线法：见平板划线分离法。b.点种法：一般用于观察霉菌和酵母细胞，轻轻点在平板的表面（根霉点一点，曲霉、酵母可点3-4点）即可。2)平板接斜面：一般是将经平板分散培养得到的单菌落接种到斜面，以便作鉴定或扩大培养、保存之用。,四、问题和思考1.稀释分离时，为何要将融化的培养基冷却到50左右，才倒入装有菌液的培养皿内？2.接种时，为何要尽量使试管平放？,一、实验目标与

43、基本要求：学习并掌握观察放线菌形态的基本功方法，了解放线菌的形态特征。二、实验内容：观察放线菌菌落形态。三、材料：1、菌种：白色链霉菌、红色链霉菌。2、0.1%美蓝染液、载片和盖片。,实验八 放线菌的形态观察,四、步骤1、菌落形态及菌苔特征：以无菌操作分别取白色链霉菌、红色链霉菌制成菌悬液在平板培养基上用划线法接种，25-28培育5-7天，观察菌落的表面形状、大小、颜色和边缘等；并注意放线菌在基质上着生紧密情况。区别基内菌丝，气生菌丝及孢子丝的着生部位，取斜面培养的白色链霉菌、红色链霉菌观察菌苔特征，注意孢子颜色，营养菌丝颜色和色素分泌情况等。,A：卡特利链霉菌；B：弗氏链霉菌；C：吸水链霉菌

44、金泪亚种；D：卡那霉素链霉菌；E：除虫链霉菌；F：生磺酸链霉菌,2、个体形态特征的观察 取一个平板，选择菌丝和孢子生长较薄的部位，直接置于低倍镜和高倍镜下观察。或用接种铲连同菌苔一薄层培养基取下一小块，平置于载玻片上进行观察，注意放线菌菌丝直径大小，孢子丝的形状。,链霉菌形态观察,放线菌的孢子丝描绘图,3、孢子形状的观察（印片法）：取一盖片，轻轻放在菌落表面按压一下，使孢子贴附在盖片上，然后在载片上加一小滴0.1%美蓝染液（或加一滴水），将盖片带有孢子的面向下，盖在染液上，用吸水纸吸去多余的染液，在高倍镜或油镜下观察孢子形状以及断裂方式。,四、实验报告绘图 玻璃纸法、水封片法、印片法及自然生长

45、状态下观察的放线菌形态。五、问题与思考1在高倍镜或油镜下如何区分放线菌的基内菌丝和气生菌丝?2用插片法和搭片法如何制备放线菌标本，其主要优点是什么?可否用此法观察其他微生物?为什么?,实验九,微生物的分离纯化技术,一、目的要求,学习从混杂的微生物群体中分离与纯化微生物 菌种的方法。综合练习微生物学实验的各种无菌操作技术,二、基本原理,自然界中各种微生物混杂生活在一起，即使取很少量的样品也是许多微生物共存的群体。人们要研究某种微生物的特性，首先须使该微生物处于纯培养状态。微生物的分离、纯化技术是指从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程。微生物的平板分离纯化技术自1880年被发明

46、以来以有100多年的历史，该技术的建立和发展为人类获得丰富的微生物资源以及在工、农、医、环境、动物细胞培养等方面的应用作出了巨大的贡献。平板稀释涂布、平板稀释混合、平板划线法是分离和纯化微生物的常规方法。分离纯化技术其实是进行平板接种，即用接种环将菌种接至平板培养基上，或用移液管、滴管将一定体积的菌液移至平板培养基上，然后培养。平板接种的目的是观察菌落形态，分离纯化菌种，活菌计数及在平板上进行各种实验时采用的一种接种方法。本实验是利用分离纯化技术来获得三大类微生物的平板纯培养物，为下次实验微生物的形态观察提供菌落形态的部分（形态观察主要包括群体形态（菌落形态）和个体形态观察两个方面。,三、实验

47、材料,1、各组所需物品：无菌培养皿：两包，12套无菌三角玻扒：1支无菌吸管：3支接种器具：酒精灯，镊子，消毒棉球，打火机，标签贴纸，圆珠笔，一次性口罩，纸巾。制平板的培养基：肉汤琼脂培养基（1瓶）,麦芽汁琼脂培养基（1 瓶）(于杀菌锅里保温)2、平板的制备：将融化的琼脂培养基,冷却至50左右(以手背能忍受的温度为准)温度过高时，皿盖上的冷凝水太多；温度低于45时，培养基易于凝固而无法制作平板。平板的制作应在酒精灯火焰旁进行，右手掌心握住三角瓶的底部，左手打开三角瓶棉塞，以右手的无名指和末指夹持瓶塞，灼烧瓶口。左手拿培养皿，用左手的大拇子将皿盖掀开一缝，至瓶口刚好伸入，向皿内注入培养基（约15

48、mL,厚度约0.5 mL左右），迅速盖好皿盖。左手持培养皿稍加旋转摇动，使培养基均匀分布于整个培养皿底部，然后平置于桌面水平位置,待凝后即为平板。,四、实验内容,1.平板混合分离法：大肠杆菌，枯草杆菌，单球菌（3皿）将菌液分离样品摇匀，用无菌移液管取1 ml的菌液移至无菌培养皿中，然后将融化，凉至50左右的培养基，在每个培养皿内各倒入约15 ml，摇匀，凝固，制成平板。图3-1 混合倒平板操作法示意图,四、实验内容,2.平板划线分离法：（3皿）将菌液分离样品摇匀，以无菌操作用接种环直接取试管中待分离纯化的菌液，将菌液点种在平板边缘一处，取出接种环，烧去多余的菌种。将接种环再次通过稍打开皿盖的缝

49、隙（约30）伸入平板，在平板边缘空白处接触一下使接种环冷却,然后从接种有菌的部位在平板上自左向右轻轻划线，划线时平板面与接种环面成30-40，以手腕力量在平板表面轻巧滑动划线,接种环不要嵌入培养基内划破培养基,线条要平行密集，充分利用平板表面积，注意勿使前后两条线重叠，划线完毕，关上皿盖.灼烧接种环，待冷却后放置接种架上。,图3-2 平板划线分离操作法示意图,图3-3 平板划线菌落分离效果图,3.平板涂布分离法(3皿)：面包酵母菌，古巴酵母菌，假丝酵母菌 将菌液分离样品摇匀，将0.1ml菌悬液小心地滴在平板培养基表面中央位置。右手拿无菌三角玻扒在平板培养基表面上,将菌悬液先沿一条直线轻轻地来回

50、推动,使之分布均匀，然后改变方向沿另一垂直来回推动,平板内边缘处可改变方向用三角玻扒再涂布几次。,四、实验内容,图3-4 涂布平板操作法示意图,四、实验内容,4.平板点殖：黑曲霉，黄曲霉，根霉（3皿）一般用于观察霉菌的菌落。在无菌操作下，用接种针从斜面或孢子悬液中取少许孢子，轻轻点种于平板上。,四、实验内容,5.生物的培养技术：培养箱恒温培养法 细菌于37恒温培养箱培养1-2d，平板倒置培养。霉菌和酵母菌于32恒温培养箱培养2-3d，平板 倒置培养。,五、实验报告,1、观察记录实验结果：微生物的菌落特征 注:菌落特征描写方法参考如下：大小：大，中,小,针尖状形态：圆形，不规则等干湿情况：干燥，