实验九水中总大肠菌群的测定.ppt

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1、实验九 水中总大肠菌群的测定,一 实验器材1 培养基乳糖蛋白胨发酵管（内有倒置小套管）培养基、伊红美兰琼脂平板2 溶液和试剂革兰氏染色液3 仪器和其他用品高压湿热灭菌器、显微镜、载玻片、灭菌培养皿、灭菌吸管、试管、三角瓶、接种环二 目的要求1 学习检测水中总大肠菌群的方法。2 了解检测水中总大肠菌群各种方法的原理及其应用中的优、缺点。3 了解水质评价的微生物学卫生标准，明白其应用的重要性。,实验八 水中总大肠菌群的测定,三 基本原理 大肠菌群系指一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。该菌主要来源于人畜粪便，故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量，推断食品中有否污染

2、肠道致病菌的可能。总大肠菌群可用多管发酵法或滤膜法检验。多管发酵法的原理是根据大肠菌群能发酵乳糖、产酸、产气，以及具备革兰氏染色阴性，无芽孢，呈杆状等有关特性，通过三个步骤进行检验求得水样中的总大肠菌群数。试验结果以最可能数简称MPN表示。食品中大肠菌群数系以100mL(g)检样内大肠菌群最可能数（most probable number,MPN)表示。,四 培养基的配制（1）乳糖蛋白胨培养液：按照说明称取适量培养基，溶于蒸馏水中，分装于试管中，每个试管10ml，倒置一德汉氏小管，于115高压灭菌器中灭菌20min，贮存于冷暗处备用。（2）三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液：按上述制备方法配制，除蒸馏水

3、外，培养基用量增加至三倍，分装于试管中，每个试管5ml。（3）伊红美培养基：按照说明称取适量培养基，置于三角瓶中，加蒸馏水溶解，115高压灭菌15min，待冷却至4550，倒平板待用。,培养基配制操作图示：,用漏斗分装培养基及摆斜面,培养基的分装：一般制作斜面培养基时，每只15150毫米的试管，约装34毫升（1/41/3试管高度），如制作深层培养基，每只20220毫米的试管约装1215毫升。每只锥形瓶装入的培养基，一般以其容积的一半为宜。,包扎1培养皿：以旧报纸密密包紧，一般以6套做一包，待灭菌。2吸管：在距其粗头顶端约0.5cm处，塞一小段1.5cm长的棉花。棉花要塞得松紧恰当（过紧，吹吸液

4、体太费劲；过松，吹气时棉花会下滑），然后分别将每支吸管尖端斜放在旧报纸条的的近左端，与报纸约呈60角，并将右端多余的报纸打一小结。3三角玻扒：跟包扎吸管相似，将三角部分斜放在报纸条的近左端，与报纸约呈45角，并将右端多余的报纸打一小结。4.玻璃器皿、金属器械包扎完毕后置干燥箱160170灭菌2 h.,1.灭菌器内加入一定量的水，将用防水纸包扎好的物品放入其中。2.接通电源，进行加热。3.排除高压锅内的冷空气，可将排气阀打开，待排出大气后关闭排气阀；或关闭排气阀，待压力上升到0.5kg/cm2时再打开排气阀，待压力回复到0时再关闭排气阀。4.当压力达15bl/in2（即1.05kg/cm2）时，

5、此时灭菌器内的温度为1210C，维持30min。对热不稳定的培养基如含有葡萄糖、氨基酸等物时，应适当降低压力，延长时间。5.灭菌时间一到，切断电源，待压力降至零时，才能打开排气阀，然后打开灭菌器盖，取出物品。,灭菌,高压蒸汽自动灭菌锅,手提式高压蒸汽灭菌锅,倒平板操作法示意图,斜面摆放与冷凝,五 操作步骤1 水样的采取（1）检测自来水 先将自来水龙头用火焰烧灼3 min灭菌，再开放水龙头使水流5 min后，在火焰旁打开灭菌三角瓶塞，以其接取水样，迅速地进行分析。（2）检测池水、河水或湖水 应取距水面1015cm的深层水样，先将灭菌带玻璃塞的空瓶瓶口向下浸入水中，然后翻转过来，拨开玻璃塞，水即流

6、入瓶中，满后将玻璃塞塞好，再从水中取出。有时需用特制的采样器取水样。采取的水样最好立即检测，否则需放入冰箱中保存。,3 初发酵试验（1）生活饮用水 在两个装有已灭菌的50mL三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液的大试管或烧瓶中（内有倒管），以无菌操作各加入已充分混匀的水样100mL。在10支装有已灭菌的5mL三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液的试管中（内有倒管），以无菌操作加入充分混匀的水样10mL，混匀后置于37恒温箱内培养24h。（2）水源水在装有5ml 3倍浓度浓缩乳糖蛋白胨培养基的试管中加入10ml水样品；于各装有10mL乳糖蛋白胨培养液的5个试管中（内有倒管），分别加入1mL水样；再于各装有10mL乳糖蛋

7、白胨培养液的5个试管中（内有倒管），分别加入1mL 1：10稀释的水样。共计15管，三个稀释度。将各管充分混匀，置于37恒温箱内培养48h。（可以根据水的污染程度选择3个稀释度）,4 分离培养 将初发酵的阳性管(产酸产气)的菌液分别划线接种于伊红美蓝琼脂培养基平板。置361温箱内，培养1824h，然后取出，观察菌落形态。选择符合大肠菌群菌落特征的菌落:深紫黑色，有金属光泽；紫黑色，不带或略带金属光泽；淡紫红色，中心颜色较深,挑取一部分，进行革兰氏染色。,平板划线分离操作法示意图,5 复发酵试验 上述涂片镜检的菌落如为革兰氏阴性无芽孢的杆菌，则挑选该菌落的另一部分接种于装有普通浓度乳糖蛋白胨培养

8、液的试管中（内有倒置管），每管可接种分离自同一初发酵管的最典型菌落13个，然后置于37恒温箱中培养24h，有产酸、产气者，即证实有大肠菌群存在。根据证实有大肠菌群存在的阳性管（瓶）数查附表1“大肠菌群检数表”，报告每升水样中的大肠菌群数。每组：三倍浓缩乳糖蛋白胨（5 ml）15管 普通浓度乳糖蛋白胨（10 ml）15管伊红美兰培养基 150 ml(5个平板)三角瓶1个（装27mL蒸馏水灭菌）、10ml吸管 2支、1ml吸管2支包扎灭菌,表2 最可能数(MPN)表,（接种5份10mL水样、5份1mL水样、5份0.1mL水样时，不同阳性及阴 性情况下100mL水样中细菌数的最可能数和95%可信限值）,思考题,1.何谓大肠菌群？它主要包括哪些细菌属？2.假如水中有大量致病菌，如：痢疾、伤寒、霍乱等病原菌，用多管发酵法检测总大肠菌群，能否得到阳性结果？为什么？3.为什么接种100、10 mL水样，用的是3倍 浓缩的乳糖蛋白胨培养基，而接种1.、0.1、0.01、0.001 mL水样，则用乳糖蛋白胨培养基？,