基因操作的主要技术原理.ppt

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1、第五节 基因的化学合成,1 基因化学合成的概况,随着基因工程的发展，需要定向地修改、设计生物基因组，快速合成DNA片段的方法显得十分重要。,19571965年H.G.科拉纳等人设计并合成了由一种、两种或 3种脱氧核苷酸组成的重复顺序的脱氧寡核苷酸片段，并以此为模板用DNA聚合酶和RNA聚合酶进一步复制和转录，得到了具有对应的互补顺序的长链人工信使核糖核酸(mRNA)，再用这种人工mRNA在无细胞体系中进行蛋白质合成。通过分析这样得到的多肽产物的氨基酸顺序和与模板中核苷酸顺序的对应关系破译了遗传密码。,1977年,坂仓等人首先合成了生长激素释放抑制因子的基因，并使之在大肠杆菌中实现了表达，得到了

2、在大肠杆菌中原来并不存在的活性肽（十四肽）。1979年，Khorana在Science杂志上发表题为“一个基因的合成”的论文，报道了基因化学合成的成功事例。1981年中国生化学家王德宝等完成了酵母丙氨酸转移核糖核酸的全合成工作，这是第一个人工合成的具有全部生物活性的RNA分子。,一系列多肽和蛋白质基因，如胰岛素、干扰素和生长激素等的基因相继被合成，并得到了很好的表达，使得这些原来只能从动物组织中得到的含量不多的蛋白质能以细菌发酵的办法大量生产。,概念：以核苷或单核苷酸为原料并且不依靠任何天然模板或引物，采用有机合成反应或酶促合成反应进行的寡核苷酸或核酸大分子的合成。,核酸的人工合成,在基因的化

3、学合成中，首先要合成出有一定长度的、具有特定序列结构的寡核苷酸片段，然后再通过DNA连接酶的作用，使他们按照一定的顺序共价连接起来。干扰素基因就采用此方法合成。磷酸二酯法、磷酸三酯法、亚磷酸三酯法，及在后二者基础上发展起来的固相合成法和自动化法。,核酸合成包括化学合成和酶促合成两个方面,化学合成以核苷或单核苷酸为原料，完全用有机化学方法来合成核酸。由于核苷酸是一个多官能团的化合物，因此,在化学合成中,必须将不希望发生反应的基团保护起来。,酶促合成通过酶促反应可以把化学合成的小片段连接成为大片段，或是从已经合成的单链制成双链，它可以加快合成工作的进展，使人工合成核酸大分子的目标得以顺利地实现。大

4、肠杆菌DNA连接酶和T4噬菌体DNA连接酶是两种经常使用的DNA连接酶。,基本原理是将一个5端带有适当保护基的脱氧单核苷酸与另一个3端带有适当保护基的脱氧单核苷酸偶联起来，形成一个带有磷酸二酯键的脱氧二核苷酸分子。,2 磷酸二酯法,由于以上反应是通过磷酸单酯和羟基缩合生成3-5磷酸二酯，故称为磷酸二酯（合成）法。能合成长达200bp的寡核苷酸片段 但在磷酸二酯法中，由于产物为磷酸二酯，磷酸上所剩下的OH基团，虽然化学活性较小,但也能发生反应,因此,当合成的寡核苷酸链逐渐增长时,由这个磷酸OH基团所带来的副反应也愈益严重，使合成产率急剧下降，目前这个方法已基本上被淘汰。,改进的办法之一是采用适当

5、的保护基把磷酸上的OH基团也保护起来，再进行连接反应。即如图4 所表示的那样，用甲核苷3-磷酸二酯（用R5保护磷酸上的OH基团）同乙核苷的5-羟基反应生成磷酸三酯型的产物，这个方法称为磷酸三酯法。,3 磷酸三酯法,4 亚磷酸三酯法,以保护的亚磷酰胺单体为原料，经1-H-四氮唑活化后与羟基组分连接，先生成亚磷酸三酯，再氧化得到磷酸三酯，称为亚磷酰胺法或亚磷酸三酯法。,4 固相亚磷酸三酯法合成寡核苷酸,在磷酸三酯法和亚磷酸三酯法基础上发展起来的固相合成法,其基本原理是将要合成的寡核苷酸链的3末端核苷先固定在一个不溶性的高分子上面，然后再从此末端核苷开始，逐步接长，接长的链始终被固定在载体上，过量的

6、未反应物和分解产物则通过过滤或洗涤除去，每接长一个经历一次循环。当整个链的增长达到所需要的长度后，再将寡核苷酸链从固相载体上切落下来并脱去保护基，经过分离纯化得到所需要的最后产物。固相合成不仅可以缩短合成的时间,提高总产率,并且由于每一个缩合循环都经过同样的操作步骤，因此可以采用自动控制手段。目前已经设计出多种型号的全自动或半自动的合成机器，其每一次的连接产率达到9799，最快的每轮循环不到10分钟，最长的合成片段可到100核苷酸以上。,原理是将所要合成的寡核苷酸链的3末端先以3-OH与一个不溶性载体，如多孔玻璃珠连接，然后依次从3-5的方向将核苷酸单体加上去，所使用的核苷酸单体的活性官能团都

7、是经过保护的，其中5-OH用4,4-二对甲氧基三苯基保护，3-端的二丙基亚磷酸酰上的磷酸的OH，用保护基封闭合成的一个循环周期分四个步骤：1、脱三苯甲基作用 用二氯乙酸或三氯乙酸处理，脱去核苷酸1的5-OH基团偶联的保护基团DMT2、偶联反应 通过弱碱-四唑的催化反应，使第二个核苷酸同已附在固相载体上的核苷酸1的暴露5-OH缩合。3、封端反应 加入乙酸酐激发的乙酰化作用，把所有没有参与偶联反应的5-OH基团全部封闭起来4、氧化作用利用碘液催化作用，把核苷酸1和2间的3-5亚磷酸三酯键氧化为稳定的3-5 磷酸三酯键反复重复以上步骤,化学合成法优缺点,优点：准确性极高，合成速度较快缺点：合成的寡核

8、苷酸链长度短(不大于80个碱基)一般用于PCR引物、寡核苷酸探针、人工接头、较小基因的合成。对于超过该法合成范围的寡核苷酸链的合成，可采用分段合成法。,用的基因组装方法主要有两种：第一种方法是将寡聚核苷酸激活，带上必要的5-磷酸基团，然后与相应的互补寡核苷酸片段退火，形成带有粘性末端的双链寡核苷酸片段，再用T4DNA连接酶将它们彼此连接成一个完整的基团或基团的一个大片段。第二种方法是将两条具有互补3末端的长的寡核苷酸片段彼此退火，所产生的单链DNA作为模板在大肠杆菌DNA聚合酶Klenow片段作用下，合成出相应的互补链，所形成的双链DNA片段，可经处理插入适当的载体上。,目前，化学合成寡聚核苷

9、酸片段的能力一般局限于150-200bp，而绝大多数基因的大小超过了这个范围，因此，需要将寡核苷酸适当连接组装成完整的基因,5.用寡核苷酸片段组装基因的方法,生物化学法,即在体外以目的DNA片段为模扳，利用酶学反应(Klenow酶或Taq酶)，在特异引物的引导下，合成特异的DNA片段。目前最常用的方法是PCR法。,生物化学法优缺点,优点：合成基因效率高、速度快、特异性好。随着PCR技术的发展，现在已能合成长达几十kb的DNA片段。缺点：产物中可能有1l0000-l1000的错配率，也就是说，PCR产物中可能存在突变体，因此，通过PCR克隆的基因，必须通过DNA序列测定才能确认。,全基因合成,化

10、学合成目的基因的前提条件是基因的DNA序列已知，有三种战略：,混合退火,根据目的基因全序列，分别合成12-15碱基长的单链DNA小片段,T4-DNA连接酶连接,克隆入合适的载体,1、小片段粘接法：,生化合成法的基本战略,全基因合成,2、补钉延长法：,混合退火,根据目的基因两条互补链全序列，分别合成12-15碱基长的单链DNA小片段以及20-30碱基长的单链DNA中片段,T4-DNA连接酶连接,克隆入合适的载体,Klenow酶聚合,全基因合成,3、大片段酶促法：,混合退火,根据目的基因的全序列，分别合成40-50碱基长的单链DNA片段：,T4-DNA连接酶连接,克隆入合适的载体,Klenow酶聚

11、合,全基因合成,上述三种方法各有利弊：生化合成DNA的单片段愈短，收率就愈高，但由于生化合成的份额较大，成本较高；在大片段酶促法合成目的基因时，虽然生化合成的份额相对较小，成本较低，但大片段化学合成的收率极低，例如，每聚合一个单体的产物收率为95%则合成50个碱基长的DNA单链大片段的总收率只有7.7%,6.寡核苷酸化学合成的实际用途,（1）作为合成基因的元件通过寡核苷酸的合成，能构建出长达2000bp的基因的全序列（2）作为核苷酸序列分析的引物寡核苷酸链可以同DNA互补链杂交，因此可作为合成DNA互补链的引物（3）作为核酸分子杂交的探针根据蛋白质的氨基酸顺序，反推出基因编码区的可能的DNA核

12、苷酸序列，并据此合成出寡核苷酸混合物作探针，用以筛选特定基因（4）用于基因定点诱变研究体外化学合成一段带有预定突变序列的寡核苷酸片段（5）作为PCR扩增反应的引物20个核苷酸左右的PCR寡核苷酸引物（6）作为重组DNA连接构件制备重组DNA过程中常用到的连接构件衔接物和接头,DNA合成仪,设计用于合成结构上类似DNA或RNA的寡核苷酸的自动化仪器。一般应用于固相合成法，每次将一个核苷酸加到所接长的寡核苷酸链上，加入每一个核苷酸都利用相同的化学反应与相应的嘌呤或嘧啶碱基衍生物作用。所用化学反应和操作细节随不同的仪器而改变，最广泛应用的方法是DNA合成的磷酸酰胺法。,DNA合成仪的基本组成结构(一

13、)压力系统(二)试剂和溶剂储液瓶(三)压力管路及输送管路(四)亚磷酰胺瓶排气(五)输送阀块(六)辅助真空(七)柱子(八)路节流阀(九)废液和排气(十一)电池(十二)控制器,俄罗斯产，6万美元,原理是将所要合成的寡核苷酸链的3末端先以3-OH与一个不溶性载体，如多孔玻璃珠连接，然后依次从3-5的方向将核苷酸单体加上去，所使用的核苷酸单体的活性官能团都是经过保护的，其中5-OH用4,4-二对甲氧基三苯基保护，3-端的二丙基亚磷酸酰上的磷酸的OH，用保护基封闭合成的一个循环周期分四个步骤：1、脱三苯甲基作用 用二氯乙酸或三氯乙酸处理，脱去核苷酸1的5-OH基团偶联的保护基团DMT2、偶联反应 通过弱

14、碱-四唑的催化反应，使第二个核苷酸同已附在固相载体上的核苷酸1的暴露5-OH缩合。3、封端反应 加入乙酸酐激发的乙酰化作用，把所有没有参与偶联反应的5-OH基团全部封闭起来4、氧化作用利用碘液催化作用，把核苷酸1和2间的3-5亚磷酸三酯键氧化为稳定的3-5 磷酸三酯键反复重复以上步骤,DNA固相合成法,DNA固相合成法,亚磷酰胺,4,4-二甲氧基三苯基,二异丙基胺,DNA固相合成的原理如下：全部反应是按一个不大的固相柱子中进行的。首先要将待活化的核苷酸上的某些游离基团保护（封闭）起来，使反应按设计的方向进行。5-OH用二对甲氧三苯甲基(DMT)保护，碱基上的氨基用苯甲酸保护。然后对3-OH则用

15、氨基亚磷酸化合物进行活化。完全自动化的固相合成DNA片段仪器,可在几小时或一天内合成出长度为几十个核苷酸或一百多个核苷酸的DNA片段，供实验室应用。,目的基因的获取,1.化学合成法已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列。2.基因组DNA文库(genomic DNA library)3.cDNA文库(cDNA library)4.聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR),相关知识点：,1.化学合成法,由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列,组织或细胞染色体DNA,基因片段,克隆载体,重组DNA分子,含重组分子的转化菌,限制性内切酶,受体菌,存在于转化细菌内由

16、克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合,2.基因组DNA文库,是一种在体外利用酶促反应大量获得特异序列的基因组DNA或cDNA的专门技术，又称为无细胞的分子克隆。,4.聚合酶链反应（PCR）,PCR反应的基本原理,第六节 基因定点诱变,基因突变技术是通过在基因水平上对其编码的蛋白质分子进行改造，在其表达后用来研究蛋白质结构功能的一种方法。根据其特点，可将基因突变分为两大类：位点特异性突变和随机突变。位点特异性突变又可大体分为三种类型：一类是通过寡核苷酸介导的基因突变；第二类是盒式突变或片段取代突变；第三类是利用聚合酶链反应(PCR)，以双链DNA为模板进行的基因突变。PCR技术的出现为基因的突

17、变，基因的剪接开辟了一条极其有效、极其快捷的道路。当然无论哪种方法都可以在为蛋白质编码的基因序列上产生插入、缺失、取代等突变。,一、传统的诱变,利用能够修饰DNA分子的化学或物理诱变剂处理生物体射线（紫外线、X射线、射线等）化学诱变剂（亚硝酸、羟胺、EMS、亚硝基胍等）,不足：经诱变剂处理的生物体，它的任何基因都可能发生突变，目的基因突变率较低，筛选困难即使分离到期望表型的突变体，无法保证突变确实发生在目的基因上在基因克隆和核苷酸测序技术发展之前，无法知道基因中突变的位置和性质（单碱基或DNA片段）,定点诱变（site-directed mutagenesis)体外特异性改变某个碱基的技术，能

18、够取代、插入或缺失克隆基因或DNA序列中的任何一个特定的碱基 研究基因的结构与功能的关系 获得所需功能的突变体蛋白质,二、基因定点诱变,2寡核苷酸诱发基因定点突变的过程（1）正链DNA的合成（2）突变引物的合成（3）异源双链DNA分子的制备（4）闭环异源双链DNA分子的富集（5）转化（6）突变体的筛选（7）突变基因的鉴定,寡聚核苷酸定点诱变技术是由加拿大的生物化学家M史密斯（Michael Smith）发明的。基本原理：应用寡聚核苷酸进行DNA的定点诱变时，首先要把含有待突变的DNA片断克隆到MI3噬菌体载体中，MI3噬菌体的正链可以感染具有纤毛的细菌，并在细菌体内进行复制后，以出芽的形式形成

19、新的带有正链DNA的噬菌体。而存留在菌体内的则是双链状态的复制型MI3。受MI3噬菌体感染的细菌生长速度减慢，在细菌培养皿上会形成透明的噬菌斑。,寡聚核苷酸定点诱变技术,基因工程技术可使基因产生特异性位点突变，也可以产生区域性的突变。常用的方法如盒式突变法(cassette mutagenesis)，又称片段取代法(DNA fragment replacement)。盒式突变的具体操作是利用目标基因中所具有的适当的限制性内切酶位点，用具有任何长度、任何序列(或任何混合序列)的DNA片段来置换或取代目标基因上的一段DNA序列。,1.寡核苷酸盒式诱变（Cassette mutagenesis）,利

20、用一段人工合成的具有突变序列的寡核苷酸片段，即寡核苷酸盒，取代野生型基因中的相应序列,盒式取代诱变：突变体盒子简单地取代野生型片段，重组质粒全部是突变体,盒式突变的两个关键问题：,目标基因中要有适当的限制性内切酶识别位点。对于天然蛋白质来说，其所含可供利用的限制性内切酶识别位点很少，可利用遗传密码的简并性在不改变氨基酸序列的前提下，通过改变某些核苷酸的序列，产生合适的限制性内切酶位点，便于盒式突变的操作。用于取代目标基因中特定DNA片段的突变DNA片段的获得。目前利用PCR技术可产生具有特定限制性内切酶位点的、具有各种突变位点的盒式突变DNA片段的技术已经很成熟。,如今，对目标基因进行区域性定

21、向突变，除了上述的盒式突变外，也完全可以通过PCR方法对给定基因序列进行融合和剪接，这种基因改造方法不受特定限制性内切酶位点的存在与否的限制。,利用掺假的寡核苷酸进行盒式诱变盒式取代诱变：碱基错误掺入合成掺假的寡核苷酸群体，从转化子中分别纯化质粒DNA并测序，从中鉴定出单碱基置换的突变体作功能测试,某种碱基的浓度是其它的30倍,盒式取代诱变：简单易行，突变效率高 靶DNA区段的两侧需要存在一对限制酶单切点,利用掺假的寡核苷酸进行盒式诱变盒式取代诱变：取代作用随机发生，群体中有的寡核苷酸分子是野生型，有的发生了一个或数个碱基取代,小结：,这类突变都是在含有突变序列的寡核苷引物介导下进行的，也称为

22、专一性位点突变。这种突变的方法从问世至今不断更新，特别是PCR技术出现后变得更高效。(1)寡核苷酸介导的基因突变中的各种因素(2)几种寡核苷酸介导的基因突变方法,2.寡核苷酸引物诱变,诱变原理：使用化学合成的含有突变碱基的寡核苷酸片段作为引物，启动单链DNA分子进行复制，随后这段寡核苷酸引物便成为了新合成DNA子链的一个组成部分，因此所产生出来的新链便具有已发生突变的碱基序列,作为诱变剂的寡核苷酸序列：人工合成一段818个碱基的寡核苷酸序列，该序列中除了所需的碱基突变外，其余的则与目的基因编码链的特定区段完全互补错配碱基的位置应设计在寡核苷酸分子的中央部位通常采用化学合成,成功获得定点突变的原

23、则：1、寡核苷酸引物中的错配碱基必须得到保护，避免被DNA聚合酶I5-和3-外切酶活性切除2、用Klenow大片段酶及保证错配碱基3-还有一个以上其它碱基2、错配碱基的位置设计在接近诱变剂寡核苷酸分子的中央部位，以便在完全配对的双链分子同具错配碱基的双链分子间造成最大的结合差别,将待突变的目的基因插入M13噬菌体载体，制备单链DNA将合成的寡核苷酸片段与单链模板退火，在DNA聚合酶作用下合成互补的双链DNA将双链DNA转化大肠杆菌，获得突变基因突变体的筛选：寡核苷酸探针杂交筛选法,诱变过程：,寡核苷酸介导的基因突变中的各种因素,关于DNA模板的制备寡核苷酸突变引物的设计和选择 寡核苷酸突变引物

24、与DNA模板的退火和引物延伸条件DNA聚合酶的选择存在于dNTP中的dUTP对离体DNA合成反应的影响受体细胞对突变体产率的影响,关于DNA模板的制备双链DNA模板：质粒单链DNA模板：M13噬菌体载体，足够纯净(避免RNA污染),寡核苷酸突变引物的设计和选择引物特征：具有和模板DNA的互补区；足够长，能与目标DNA序列退火；避免形成稳定二级结构的回文序列、重复序列或自身互补序列；不能与目标DNA的其它区域和载体DNA形成稳定的杂交体。引物设计取决于所要产生的突变类型：用于单个核苷酸改变的引物，一般长度为1719个核苷酸；多处改变核苷酸或改变2个以上，一般长度为25个核苷酸以上。,寡核苷酸突变

25、引物与模板DNA的退火和引物延伸条件退火条件：突变引物与模板DNA的浓度比为1050；退火通常将二者混合物加热到Tm值以上20度，然后再缓慢冷却到室温；对于AT含量高的引物，为保证退火安全，加热后可冷却到较低温度，以稳定模板和引物复合体。引物延伸条件：退火完成后加入4种脱氧核苷三磷酸，DNA聚合酶、DNA连接酶等，进行2-15小时的延伸反应。,DNA聚合酶的选择目前一般选择T4DNA聚合酶和T7DNA聚合酶,存在于dNTP中的dUTP对离体DNA合成反应的影响,dCTP氧化脱氨可产生微量dUTP，dUTP渗入到新生DNA链中后，受体菌中的尿嘧啶-N-糖基化酶可在U的位置切断DNA链，降低突变体

26、的产率。利用经HPLC纯化的高质量的dNTP可以降低U碱基的错误搀入，提高突变产生的比率。,受体细胞对突变体产率的影响,受体菌中的错配修复系统将产生的突变去除；当用M13作为克隆载体时，由于M13 DNA可能出现不对称复制，如果突变链的复制效率较低，则最终将降低突变体的产率。为了提高突变体的回收率，即提高突变效率，利用点错配修复缺失的菌株为受体菌可使突变产率提高近10倍。,提高寡核苷酸引物诱变突变效率的方法,Kunkel 定点诱变法:ung:尿嘧啶脱糖苷酶,寡核苷酸引物诱变法的局限性,突变体子代频率低异源双链DNA分子并非真正异源突变体子代中突变碱基被错配修复体系修复,Kunkel 突变法,1

27、985年由发明,硫代磷酸诱变法:已知有些限制酶不能切割硫代磷酸DNA分子在异源双链DNA分子制备时，加入硫代核苷酸，使之掺入突变链中然后用前述酶切割，并用外切酶局部消化后，进行聚合反应，从而产生具有定点突变的异源双链DNA,诱变,(1)重组PCR定点诱变:克服寡核苷酸引物诱变能力仅限于5端.特点:经3轮PCR反应,一对互补的带有突变碱基的内侧引物和2个外侧引物,Higuchi,1988.Four primers,three PCR缺点：步骤相当繁琐,(2)大引物诱变:核心是第一轮PCR产物为第二轮PCR引物三种扩增引物，2轮PCR反应,优点：获得目的突变体可达100%不足：1、PCR产物需连接

28、到载体分子2、TaqDNA聚合酶拷贝DNA的保真性低,Sarkar and Sommer1990,Three primersTwo rounds of PCR,Directed evolution（直接进化或定向进化）对目的基因人为制造大量突变，然后按照特定的需要和目的，给予选择压力，将满足要求的、适合特定目的的分子筛选出来，从而实现在试管中分子水平的模拟进化。,三、基因的直接进化技术,Key steps of a typical directed enzyme evolution experiment,突变 基因突变库的建立,筛选：基因突变库的活体或离体筛选,随机突变的策略：,1.易错PCR

29、（error-prone PCR）在扩增目的基因的过程中，通过改变PCR反应的条件（如改变4种dNTP的比例、改变Mg2+的浓度等），在PCR过程中引入碱基错配，导致目的基因的随机突变,2.DNA shuffling（DNA 重排或改组）指DNA分子的体外重组,是基因在分子水平上进行有性重组。通过改变单个基因（或基因家族）原有的核苷酸序列，创造新基因，并赋予表达产物以新功能,基本步骤:目的基因片段的准备：根据不同的需要选择一个基因或其片段，也可以是几个序列上具有较高同源性的基因DNaseI酶切：将基因随机切割成约50100bp左右的小片段不加引物的PCR：在Taq酶的作用下将切割后的DNA重叠

30、小片段重新连接起来，在这个过程中可能发生许多突变和重组加引物的PCR：加入目的基因片段两端的引物,使连接好的DNA得到扩增，筛选正突变。,基因家族的改组,突变基因的表达与筛选,Phage display of random peptidesExpression of exogenous proteins,peptides or peptides libraries on the surface of phageM13,T7,Express cDNA as fusion protein on cell surface,Phage Display,基因直接进化的用途,提高酶活性改变底物特异性改善酶的稳定性获取具有新功能的酶提高药用蛋白和疫苗的活性改善整个代谢途径,