基因工程载体-人工染色体载体.ppt

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1、第三节 其他载体,2012.09,其他载体,一、人工染色体二、植物基因工程载体三、动物基因工程载体,一、人工染色体,人基因组十分庞大，约含4109bp，建立和筛选人的基因组文库，要求有容量更大的载体，酵母人工染色体（yeast artificial chromosome,YAC）载体应运而生。YAC含有酵母染色体端粒（telesome）、着丝点(centromere)及复制起点等功能序列，可插入长度达200-500kb的外源DNA，导入酵母细胞可以随细胞分裂周期复制繁殖供作克隆，成为人基因组研究计划的重要,1、酵母人工染色体,（yeast artificial chromosome,YAC),

2、酵母人工染色体（yeast artificial chromosome，YAC）,酵母人工染色体是另一类酵母穿梭载体。具有自主复制序列、克隆位点以及可在细菌和酵母菌中选择的标记基因。YAC可以接受100-1000 kb的外源DNA片段，这一特点使YAC成为人类基因组计划及图位克隆分离基因的重要工具，并促进了发展人类人工染色体(human artificial chromosome，HAC)的研究。,正常酵母人工染色体含有：*四膜虫端粒（tel)*酵母自主复制序列（ARS)*酵母着丝点(CEN)*酵母的选择标记(TRP1、URA1),YAC载体,the capacity to clone lar

3、ge exogenous DNA fragments(up to 2 Mb)has made YACs a vital tool in physical mapping,The functional elements of a yeast chromosome,（1）着丝粒区（CEN）,A A GTCACGTG,T TGTTTCTGNTTTCCGAAA,YAC的组成结构,酵母染色体着丝粒区的保守序列:,78-86bp,I,II,III,由三个区组成,酵母端粒保守序列是(G4T2)n 重复序列。,（3）复制起点（ORI）,约100bp的自主复制序列（ARS）。,（2）端粒（TEL）,（真核生物中

4、只有酵母菌有ARS）,两个端粒序列Tel。,位于 SUP4 基因内部。,（4）克隆位点,插入失活选择：,SUP4酶失活的酵母菌落呈红色；不失活的菌落是白色。,14,2、细菌人工染色体（Bacterial artificial chromosome,BAC）,细菌人工染色体（bacterial artificial chromosome，BAC）,BAC载体是基于细菌的性因子(F因子)质粒的一些特点构建的。F因子在细菌接合时转移1Mb的细菌染色体片段。将F因子经基因工程改良构成的BAC载体，可用于克隆100 kb以上的DNA片段。带有外源片段的BAC载体在细菌细胞中通常仅单个拷贝，这一特点有利于

5、保持DNA大分子，在细胞内稳定复制而不发生重组。BAC载体本身分子量小，具有氯霉素抗性选择基因及多克隆位点。,Structure of a bacterial artificial chromosome(BAC),used for cloning large fragments of donor DNA.CMR is a selectable marker for chloramphenicol resistance.oriS,repE,parA,and parB are F genes for replication and regulation of copy number.cosN is

6、 the cos site from l phage.HindIII and BamHI are cloning sites at which foreign DNA is inserted.The two promoters are for transcribing the inserted fragment.The NotI sites are used for cutting out the inserted fragment.,3、PAC载体,二、植物载体,Plant cloning vectors,Ti质粒:侵染广泛的双子叶植物T-DNA或T-区(T-region)：约20kb，包含

7、专化冠瘿碱生化合成和冠瘿瘤生长的基因，随机地整合到植物染色体上。结构特点：两端具有25个碱基对的顺向重复序列，但重复不是完全的。25个碱基对的序列称为T-DNA的边界序列(T-DNA border sequence)。去除右边界序列，将使T-DNA失去转移和整合的功能；左边界的缺失，对致瘤性无明显影响。毒性区域即vir(virulence)区域:引起T-DNA转移的区域。长度约35kb，和T-DNA处于不同位置,植物Ti质粒载体,（1）T-DNA区（transferred-DNA regions）T-DNA是农杆菌侵染植物细胞时，从Ti质粒上导入植物细胞的一段DNA。T-DNA两端各有一段25

8、bp的重复序列(LB,RB)。T-DNA携带的致瘤基因是一些与激素合成有关的基因，由于激素合成基因使细胞处于不停的分裂状态，形成冠瘿瘤，不能进行细胞分化。Ti质粒改造后才能应用于植物的基因工程。保留T-DNA两端的末端序列，然后用外源DNA插入或直接取代野生型T-DNA的部分基因，使转化的植物细胞不具有成瘤能力。,T-DNA区域内的所有基因与转移无关，所以将致瘤基因全部缺失即卸甲(disarmed)后，将细菌抗生素的抗性基因或其它序列插入到这个区域，形成的T-DNA仍可将RB至LB内的序列转移并整合到植物基因组。Vir区的毒性基因是T-DNA转移所必需的，毒性基因可以顺式及反式两种方式控制T-

9、DNA转移。,（2）Vir区（virolence region）Vir区段上的基因与T-DNA从细菌转移到植物细胞的遗传过程有关，区段上的基因能够使农杆菌表现出毒性，故称之为毒性区。Vir区段总长度大约35kb，由7个互补群组成，分别命名为VirA、VirB、VirC、VirD、VirE、VirG和VirH。（3）Con区(regions encoding conjugations)该区段上存在着与细菌间接合转移的有关基因（tra），调控Ti质粒在农杆菌之间的转移。（4）Ori区(origin of replication)该区段基因调控Ti质粒的自我复制，故称之为复制起始区。,Ti质粒分子受

10、到信号分子的激活作用之后，virD基因编码的一种核酸内切酶，先在T-DNA的RB序列中的第3和第4碱基之间切开一个单链缺口，随后在T-DNA同一条链的LB序列中切出第二个单链缺口。T-DNA便以单链形式释放出来，并在RB序列的引导下定向地转移到寄主植物细胞。在有关的植物细胞酶体系的催化作用下，合成互补链形成双链形式的T-DNA分子。在一系列酶的参与下整合进植物基因组。这种整合是一种非正常重组。,T-DNA转移的机制,2、Ti质粒载体,Disarmed Ti vectors（非致瘤载体）Cointegrate vectors（共整合载体）Binary vectors（双元载体）,1）Disarm

11、ed Ti vectors,去除T-DNA中的肿瘤基因在T-DNA中插入用于转化植株筛选的遗传标记基因,Intermediate vectors,A small portion of T-DNA was subcloned in a conventional E.coli plasmid vector(i.e.pBR322)for easy manipulation,producing intermediate vectorsIntermediate vectors are incapable of replication in A.tumefaciens and also lack conj

12、ugation functions.Transfer of them was achieved using a triparental mating.,Triparental mating,An E.coli strain A carrying a helper plasmid able to mobilize the intermediate vector in transThe E.coli strain B carrying the recombinant intermediate vectorA.tumefaciens carrying the disarmed Ti plasmid,

13、3.Binary vector,T-DNA does not need to be physically attached to the rest of the Ti plasmidUse separate plasmids to supply the disarmed T-DNA and the virulence functions,The small plasmid can be used to inserted foreign gene When the two plasmids present together in the same A.tumefaciens cell,the T

14、-DNA carried by pBI121 is transferred to the plant chromosomal DNA by proteins coded by genes carried by pAL4404,Ti质粒及其衍生载体,Ti质粒是约200-500kb的环状DNA分子，很难直接使用，故需对其加以改造，构建出Ti质粒的衍生载体系统，广泛用作植物基因工程中的载体：（1）双元载体(binary vectors）如pBin19载体，具有原核生物的卡那霉素抗性基因(Aph)作为细菌选择标记，真核生物的卡那霉素抗性基因(nos-Npt)作为植物的选择标记，pUC19的多克隆位点及

15、-互补显色标记（2）共整合载体(integrated vectors),（1）双元载体系统（binary vector）具有两个质粒穿梭质粒和Ti质粒。（2）共整合载体（integrated vector）共整合载体系统包括在T-DNA上的激素合成区经过突变后的Ti质粒和中间载体两部分。,Ti质粒的衍生载体,发根农杆菌存在另一种质粒，Ri质粒。Ri质粒也可完成外源基因向植物的转移工作。发根农杆菌侵染后植物细胞产生许多不定根，这种不定根生长迅速，不断分枝成毛状，故称之为毛状根，也称为发状根，分别简称为毛根或发根，Ri质粒为根诱导质粒。Ri质粒的结构与Ti质粒的结构很相似，可以分为T区、vir区、

16、ori区和其它区域等几个部分。,Ri质粒,T区与Ti质粒的T-DNA十分相似：T区的左右边界序列。左右边界上含有25bp的重复序列。TL-DNA区。该区中含有与毛状根形成有关的rolA、B、C、D基因群。TR-DNA区。该区中含有与农杆碱合成有关的基因（ags）和生长素合成有关的基因（tms1、tms2）。ags基因在转化的初期起着重要的作用，是不定根产生的关键,Ri质粒,CaMV克隆载体,含1个约8kb的环状双链DNA分子；用于十字花科和少数非十字花科的植物基因转移；其感染对植物有害，不能直接做载体；CaMV的DNA在植物细胞中能高水平转录35S RNA，其启动子是一强启动子。构建的含35S

17、启动子的系列克隆载体可在植物细胞内高效表达基因。,三、动物载体,Cloning vectors of animal cell,动物病毒：猿猴病毒-40(SV-40)的衍生物 5243 bp共价闭合环状分子 感染率高，几乎100寄主细胞能被感染 能提供完整的真核基因转录所需的成分 侵染性具有寄主特异性改建：野生型最多只能包装其基因组长度的1.05倍的 DNA分子其他：痘苗病毒DNA作载体，表达乙肝表面抗原 用家蚕的核多角体病毒表达人-干扰素,反转录病毒克隆载体,反转录病毒是一类含RNA的病毒，进入受体细胞后，RNA反转录成DNA，通过两端由数百bp组成的长末端重复序列，整合到染色体上，成为原病毒

18、。只要将外源目的基因组入原病毒DNA的合适克隆位点，就能在感染的动物细胞中表达。,Hock等选用了缺失编码病毒外壳蛋白基因的逆转录病毒，因此不能合成自身的外壳，但它有识别外壳蛋白进行包装的信号（一段尚未鉴定的DNA顺序）。用这种缺陷的逆转录病毒去感染某种细胞株，这种细胞株包含有辅助病毒（helper virus）。辅助病毒能合成蛋白外壳，但缺失了识别蛋白外壳进行包装的信号，因此它不能包装成病毒颗粒。当用逆转录病毒感染细胞株后，逆转录病毒的RNA进入辅助病毒的外壳蛋白，成为病毒颗粒。这时把受感染的细胞同骨髓细胞一起培养，包装在辅助病毒外壳蛋白中的逆转录病毒RNA，进入骨髓细胞，病毒DNA插入宿主

19、细胞基因组，基因的活性得到表达。这时，由于骨髓细胞里面没有辅助病毒，所以整合进宿主基因组的逆转录病毒，不再有外壳蛋白可供包装，因此也就无法增殖，而只能被“陷”在宿主基因组中，通过细胞分裂而传给下一代子细胞。,分子克隆载体的选择,选择克隆载体的几个重要参数（1）实验对象（2）实验性质（3）载体容量（4）合适克隆位点（5）载体的稳定性（6）载体DNA制备的难易（7）外源基因表达产物产量、产物特点等,实验对象,（1）供体：遗传背景与DNA特点等，其中包括染色体DNA大小，基因大小与结构，碱基组成，目的基因的产物特点以及遗传物质的传递方式等。（2）受体：各种中间宿主与终宿主的遗传背景，如遗传物质的传递

20、方式(包括人为的方法)，DNA限制修饰系统，DNA重组基因特点，基因产物修饰系统，即转录与翻译后修饰系统。,实验对象,如常用于基因工程的宿主菌E.coli，菌株不同，基因型亦不同，不同载体要求不同菌株。如：E.coli DH5、E.coli DH5、E.coliDH5F 1）三者均有限制-修饰系统和重组基因缺陷，外源DNA可存活，且不发生重组2）DH5和 DH5F都具有一个可供遗传标记lacZ检测的遗传背景3）DH5F可供M13mp系列载体配套使用，M13病毒的感染需要 F的存在,1当一DNA片段插入终止子探针型载体pBU10的Hind克隆位点后，重组质粒仍可转化E.coli(CmlsTcs)

21、为CmlrTcr，为什么?可设计什么实验证明其假设?2当一DNA片段插入pUC18后，在x-gal平板上出现两类菌落，兰色菌落和白色菌落。从白色菌落中分离纯化的质粒经电泳检查，均比原载体DNA分子大；但从兰色菌落随机分离的质粒DNA却有两类，其中一类与载体大小相同，另一类却与白色菌落中分离的质粒大小相同。如何解释这一实验结果?可设计何种实验证明你的解释是正确的?3当把一外源DNA插入一克隆载体后，重组DNA分子转化E.coli 细胞所获得的重组子分子可根据其限制酶图谱分为两类，即这两类转化子中所含的重组DNA分子的限制酶图谱不一样，从这两类转化细胞中分离到的重组DNA分子可用限制酶回收插入的片

22、段。而从这两类转化细胞培养液所分离到的DNA却,不能用限制酶回收该片段。当把同类转化细胞培养液所分离到的DNA进行复性分析时，DNA分子间不会发生复性，但把从不同类转化细胞培养液分离到的DNA进行同样的实验时，发现在电镜下可观察到十分类似于8字形的结构。如何解释上述实验结果?可利用图示法解释。4.由于分子克隆载体的大小决定外源DNA插入片段的大小，两者呈反比关系，因而在建立载体时千方百计地减小载体分子量。对于穿梭载体，因为复制起点和标记基因具有生物特异性，所以载体上需要同时具有两个以上的复制起点和标记基因。已知不同生物的某些基因启动子可以在E.coli细胞中启动基因转录，问可以采取一些什么方法减小穿梭载体的分子量?,载体的种类和特征（重点）,载体容量,M13mp载体 4 kb 细菌质粒载体 10kb 载体 23kb cos质粒载体 48kb P1载体 95 kb pYAC载体 1000 kb,