基因工程菌苗研究的现状与发展.ppt

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1、第六章 基因工程菌苗研究的现状与发展（Status and development of gene engineering bacteria vaccine）第一节 概述（Section I outline）1883年-1885年巴斯德（Pasteur）用理化和生物学方法制备了减毒的炭疽菌苗和狂犬疫苗等。19世纪以来用菌苗免疫人畜，明显减少了传染病的发生。其中比较成功的是破伤风、白喉类毒素疫苗的应用，其效果可达95%以上。在发达国家破伤风、白喉、百日咳、嗜血性流感的发病率明显降低。抗菌药物的发明和应用，使临床常见的细菌性感染和病死率大幅下降。,细菌一旦获得耐药性，存在与细菌染色体、质粒和转座子

2、中的耐药基因就可通过转化、转导、接合和转座等方式，将抗性基因传播到其他敏感菌，使之成为抗药菌株，给临床传染病的治疗带来困难。据WHO1996年报告，全球每年死亡约5190万人，其中1/3约1730万死于传染病。,在过去20年中，有29种新传染病出现。美国Satcher博士在Emerging Infectious Diseases杂志创刊刊号列出自1973年以来鉴定的主要传染病或病原体22种。近年鉴定的新病原体和疾病鉴定年份依次列于表6-1。,表6-1 新鉴定的病原体,新病原体不断出现与鉴定，新的疫苗研制也相继开始。重要病原体全基因测序的开展和完成，及类似生物表型的不同菌属间的同源序列和异源序列

3、的发现，对抗感染研究来说，像进行了一场革命，不仅会促进病原体致病和发病机制的研究，也会开阔和调整菌苗研究的策略和思路。目前已完成500余种病毒的全基因测序，关于重要病原菌全基因测序进展情况列于表6-2。,表6-2 人类重要病原菌全基因测序现状,总之，已控制传染病的再现及新传染病的出现，已引起全球的注意，对传染病威胁需要再认识，已有共识。因此，有必要加快进行创新性的细菌菌苗的研制与开发。,第二节 目前应用的菌苗及其存在问题 Present bacteria vaccine and the question一、目前应用菌苗的类别The type of bacteria vaccine 按菌苗所含的

4、成份，菌苗可分为九类，即减毒的活菌苗、灭活的死菌苗、纯化的多糖或蛋白成份苗、基因缺失活菌苗、载体重组活菌苗、核酸菌苗、联合重组菌苗、多价菌苗、多糖与蛋白结合菌苗。,1、减毒的活菌苗（Attenuated bacteria vaccine）如卡介苗（BCG），是巴斯德研究院Calmette和Guerin等（1921）将一株牛型强毒结核菌在甘油-胆汁-马铃薯培养基上传230代后（13年），获得的对动物不致病，但产生抗结核免疫反应的菌苗即BCG。对免疫婴幼儿有保护效果。后来发现对成人的保护效果波动范围很大，对其减毒机制始终不清。直至近年来完成结核分枝杆菌全基因测序后，与有毒牛型结核分枝杆菌全基因序列

5、进行比较，方知BCG缺失了毒力相关基因。总之，对胞内菌目前还是用减毒的活菌苗。,2、灭活菌苗（Dead bacteria vaccine）通过加热处理或福尔马林（formaldehyde）、戊二醛（glutaraldehyde）、-内酯（-propiolactone）等化学处理得到。如霍乱死菌苗、百日咳（Bordetella pertussis）死菌苗等。死菌苗的主要优点是稳定，缺点是需要多次免疫才能得到好的保护效果。,3、亚单位或成分苗（Subunit bacteria vaccine）从细菌培养液中提取、用化学方法脱毒的类毒素苗，如破伤风类毒素（TT）、白喉类毒素（DT），免疫后诱导机体产

6、生的抗血清能特异中和TT破伤风类毒素或DT白喉类毒素，其保护效果可达95%以上。由于毒素纯化方法的改进，产品的副作用很小。,荚膜细菌纯化的多糖菌苗，可诱导产生的抗体能保护机体抵抗入侵荚膜菌的感染。如嗜血性流感杆菌b（Hib）、伤寒杆菌Vi多糖等多糖苗，能诱导机体产生T细胞非依赖的抗体反应，其特点是诱导产生短期的IgM抗体，缺乏免疫记忆，对不到18个月幼儿的多糖苗免疫原性差，而没有保护效果。因此多糖类的菌苗急需改进。,目前，将多糖与载体蛋白共价连接，通过载体蛋白提供适当的T细胞表位，由T细胞协助B细胞产生多糖特异性抗体，使T细胞非依赖性抗原转变为T细胞依赖抗原，这类菌苗称为多糖-蛋白结合苗。如嗜

7、血流感杆菌Hib的结合苗已在几个国家获得证书，证明对不到18个月的儿童有很高的免疫原性，能诱导免疫记忆，免疫球蛋白的类型转换及抗体亲和力成熟，明显减少Hib菌的入侵感染与发病。,表6-3 目前可用于人群的菌苗,注：i.d皮内，s.c皮下，d.s划痕，i.m肌注，p.o口服,（二）研制菌苗的新方法（New method of produce bacteria vaccine）1、研制菌苗的新方法（new methods）对细菌感染发病机制认识的深入及涉及许多病原体毒力决定簇如粘附素、侵袭素、荚膜多糖、脂多糖、毒素等编码基因及其产物的结构与功能的分析与鉴定，是不断设计和研制新型疫苗的重要基础。针对

8、不同病原体致病特点和毒力决定簇的特点，发展和产生了不同的菌苗研制方法，得到不同类型的菌苗。目前研制菌苗新方法及可能的后选菌苗列于表6-4。,表6-4 目前研制菌苗的新方法及可能的候选菌苗,2、目前菌苗存在的问题（questions）（1）尽管疫苗免疫取得了巨大的成功，但小于5岁的婴幼儿每年死于传染病的数目仍然很高。如疟疾几种腹泻病等均无有效疫苗，虽然卡介苗（BCG）使用几十年了，甚至纳入WHO的计划免疫，但其效果波动很大0%80%，因此急需安全有效的结核菌苗问世。,（2）与病毒相比：基因工程细菌及细菌核酸苗报导明显少。至今国际上还没有成功满意的重组细菌苗提供人群使用。关于细菌毒素的分子及其编码

9、基因与调控机制都比较清楚，因此，有关毒素的基因工程菌苗的构建或载体构建等均无问题。但菌外膜上的其它结构如粘附分子，侵袭蛋白，鞭毛及脂多糖等分子结构十分复杂，编码基因多呈丛分布，如LPS的表达涉及近30个基因的级联反应，操作起来尚有困难。因此还有毒力相关或保护相关基因的分离、克隆和表达等基因工程菌苗研制的前期工作要做,（三）理想菌苗的条件（Ideal bacteria vaccines condition）理想疫苗应该是：（1）安全，遗传性状稳定，无毒性，无致癌性，无致畸变或致流产性。（2）结构简单清楚，可生物降解，有生物相容性，与组织抗原无免疫学交叉反应。,（3）对各年龄组人群均有长时间的免疫

10、保护作用。（4）多价，有更大的覆盖面，最好一次性免疫。（5）能口服，能有效诱导粘膜免疫。（6）易于生产，储存及服务，不需冷藏。每一项要求，都需要大量的基础研究，已能提出更为合理的疫苗研究策略，研制出安全高效，使用方便，价格低廉的菌苗,第三节 重要细菌基因工程苗的研究进展（Development of important gene engineering bacteria vaccine),当前国内外细菌基因工程菌苗，现有菌苗对重要细菌感染性疾病的问题有：现有菌苗保护效果不好；副反应大；难以培养的细菌；可诱发癌变，有严重后遗症；新出现的病原体或新变异病原菌。,一、霍乱菌苗(Cholera vac

11、cine)霍乱是由革兰氏阴性霍乱弧菌引起的烈性传染病。霍乱弧菌在小肠分泌霍乱毒素（CT）引起腹泻及其他症状。已知有O抗原，毒素共调节菌毛（TCP），血凝素（HA），外膜蛋白（OMPs）等，及引起水样腹泻的霍乱毒素（CT）由AB5的六聚体构成。霍乱产毒株ctxAB的5端有一6kb的DNA，依次有20t,ace,orfu,cep和RS序列与ctxAB一起称为霍乱毒素元件（CTX）元件，可进行转移，与一种丝状噬菌体（CTX）有关，而非产毒株没有这段DNA。,据菌体抗原霍乱弧菌可分为200个以上的血清型1881-1896年间的5次及1899-1923年的第6次大流行均由O1群古典型霍乱弧菌引起。第7次

12、大流行自1961年延续至今，波及五大洲1992年出现了一新的流行株O139血清型霍乱目前流行的霍乱为O1和O139两种血清型。近十年来研制的新霍乱菌苗有四类：,1.BS/WC灭活菌苗(BS/WC dead bacteria vaccine）由提取的或重组的霍乱毒素B亚单位（BS）及杀死的全菌细胞（WC）组成。2.CVD103-HgR减毒活菌苗（Levine 1998）在美国获准，为一次剂量的霍乱活菌苗。它是由霍乱经典型569B菌株构建而成的CVD103减毒株（CTA-B+）。并在其染色体溶血素基因nlyA位点插入汞抗性基因作为筛选标记。3.以沙门氏菌为载体表达霍乱弧菌O抗原的伤寒/霍乱双价菌苗

13、。4.O139减毒菌苗候选株CVD112及Bengal-15,表6-5 重组霍乱菌苗的特性,a副反应包括由疫苗株引起的腹泻，腹部痉挛，厌食，发热b服苗者粪便中排菌苗株的百分率c用野生株攻击服苗者不发生腹泻的百分率d攻击后在服苗者粪便培养中可查到野生型霍乱弧菌的百分率e未得到数据f未做,另外，发现霍乱毒素是很强的黏膜免疫原，能有效刺激黏膜sIgA及血清IgG反应，及黏膜免疫记忆反应，对CT及CTB的免疫佐剂活性进行了大量的研究，对多种蛋白、多糖及病毒、细菌等的免疫佐剂效果得到肯定的认识。进展情况见表6-6。,表6-6 CT/CT-B佐剂应用的抗原,二、痢疾菌苗（Dysentery vaccine

14、）痢疾是我国常见和多发传染病，其发病率始终居24种法定传染病的前二位。主要病原体为痢疾杆菌，其致病特点是定居侵入结肠黏膜上皮细胞，且能迅速溶解吞噬泡膜进入胞浆.临床表现为发烧，脓血便，腹泻，里急后重，甚至引起神经症状和血尿综合症。,痢疾菌共有4群：A志贺氏痢疾菌（Shigella dysenteriae），B福氏痢疾菌（S.flexneri），C鲍氏痢疾菌（S.bordii）和D宋内氏痢疾菌（S.sonnei）。按其菌膜表面LPS-O抗原分为44个血清型。目前已知至少27个基因和15个蛋白与痢疾菌入侵宿主细胞相关，它们作为III型分泌系统的调节子与效应子，以接触依赖方式被分泌进入宿主细胞。,1

15、.死菌苗（Dead bacteria vaccine）五、六十年代大量动物及人体实验证明灭活的痢疾全菌非口服途径，虽可诱导机体产生高的血清抗体，但没有保护效果；用提取的宋氏痢疾菌的核糖体，皮下免疫途径，在豚鼠和猴中证实可提供特异保护，证明LPS-O多糖是保护性抗原；Robbins(1992)将痢疾菌LPS与不同蛋白载体（TT，DT）交联进行非口服途径免疫能诱导豚鼠产生高的血清抗体反应，豚鼠眼模型证明有一定保护作用。宋内氏LPS-O-蛋白（TT，DT）有保护作用，Robbins（1996）将多糖-蛋白结合苗用于越南士兵，报告宋氏多糖-蛋白结合苗保护效果达70%。,2.活菌苗（Living bac

16、teria vaccine）采取了多种方法进行痢疾菌野生毒株的减毒研究。Meitert等（1984）在胆盐平皿连续传代32次获得S.f2a减毒株IstratiT32；80年代初中国近一万人现场观察，证实T32菌苗安全，有保护活性，效果与免疫次数和剂量有关。,80年代中国国内以T32为受体株开始致力于构建双价痢疾菌苗株的研究。牟兆钦等，1989年将一编码宋内氏菌LPS-O抗原的大质粒转移至T32菌中获得福氏2a宋内氏双价痢疾菌苗株FS-18，FSM2117；宋树珍等构建了FS痢疾双价菌苗株，其中FSM2117识别福氏2a和识别宋内氏痢疾苗LPS-O抗原；林纪胜(1999)构建了S.flexenr

17、i 2a和S.dysenteria I双价痢疾菌株，有双价免疫原性，现FSM2117与FS两株痢疾双价菌苗均已获国家新生物制品证书和试生产文号。,90年代国内外开展了痢疾侵袭活菌苗的研究。主要针对痢疾菌毒力相关基因的插入失活或缺失的方法，构建减毒突变株，目的是保存其入侵能力，限制其无限繁殖能力。对其免疫原性和保护效果进行了大量实验室研究。国外工作主要集中在福氏2a，福氏5型或Y型。构建出福氏2a-宋内氏双价侵袭的菌苗株，目的是降低目前非侵袭双价苗的免疫剂量，提高免疫原性。,痢疾杆菌III型分泌系统将不同侵袭蛋白分泌和导入宿主细胞的调节分子与效应分子的鉴定，可能会找到构建痢疾基因工程菌苗新的靶分

18、子和靶基因。,表6-7 入侵性痢疾基因工程菌苗候选株研制情况,注：a胞内扩散；b国内研制；c,gp豚鼠；d,m猴；e,h人,三、产毒性大肠杆菌苗（ETEC vaccine）ETEC是婴幼儿和旅游者腹泻的主要病原菌。全球年病例为2.1亿次，死亡病例达38万，多为5岁以下的儿童。其致病特征是分泌ST和LT毒素及菌膜表面存在致病相关的菌毛抗原CFAs。正在采用减毒痢疾菌为载体进行LT或菌毛抗原的表达，进行多价菌苗研制的前期工作，或用重组的BCG为载体进行LT-B的表达研究。国内早年构建表达K88、K99及LT的幼畜工程菌苗已投入生产。,四、肠出血性大肠杆菌苗（EHEC苗）大肠杆菌O157：H7是肠出

19、血性大肠杆菌的主要病原菌，首次鉴定于1982年。1996年日本大规模爆发EHEC O157出血性肠炎以来，引起国际上的极大关注。致病特点通过特殊的黏附分子（intimin）黏附靶器官，产生类志贺毒素和肠溶血素（hly）等，出血性腹泻，溶血性尿毒综合症，血栓形成性血小板减少性紫癜。,当前研制的菌苗O157多糖绿脓杆菌外毒素蛋白的结合苗（O157LPS-rEPA），已进行I期临床观察，认为安全，有免疫原性。重组的Stx的减毒活菌苗，重组Stx亚单位苗及钴照射的全菌死菌苗正在进行动物实验观察。,五、伤寒杆菌（Typhoid bacillus vaccine）伤寒杆菌能入侵肠黏膜上皮细胞，在吞噬细胞酸

20、性吞噬泡内存活，经淋巴系统进入血流引起菌血症，近而侵犯肝，脾，肾等多种脏器与器官，并大量繁殖而再次引起严重菌血症，临床表现为高热，胃肠炎，败血症等。世界伤寒杆菌感染病例约300万，死亡人数50万。灭活死菌苗已有70余年的历史，由于副反应较大的问题促进了活苗的研制。,Ty21a 是Germamier经NTG诱导后，筛选得到伤寒Vigal E减毒株。它缺乏UDP-4-半乳糖异构酶而不能正常合成胞壁脂多糖，在体内外有半乳糖供给情况下可正常合成细胞壁。伤寒Vi多糖苗 Vi是位于菌膜LPS外的荚膜多糖抗原，由O-乙酰-氨基糖醛酸高度聚合而成，可阻止外膜与补体的结合，对菌的入侵也有一定作用。目前正进行Vi

21、多糖与蛋白交联的结合苗的研制。另外，国内外用减毒的伤寒杆菌或鼠伤寒杆菌作为载体表达外源抗原进行多价菌苗研究的探索。,六、结核菌苗（Tubercle vaccine）据WHO估计，全球每年增加结核病人达800万，年死亡病例为300万。全球有1/3的人（即17亿）曾感染过结核，其中90%-95%的人感染初期并无症状，此时虽然机体的免疫反应控制了初始的感染，但并未完全排除病原体。,最近的研究进展证明T细胞不仅只分泌TH1类的细胞因子激活感染的宿主细胞杀伤病原体，而且通过CTL溶解感染靶细胞和胞内病原体，CD8+T细胞在直接杀伤胞内结核杆菌有其特殊作用。结核杆菌是专性需氧胞内致病菌，由于血清各种检测方

22、法交叉反应严重，至今不甚清楚它的抗原决定簇的定位及数目，其毒力机制不清。,卡介苗（BCG）是预防结核病的唯一活菌苗，经大量资料的统计指出BCG的效果波动很大（0%-80%）。以及在艾滋病人和HIV携带者接种BCG后发生全身性感染，促使人们研制新一代结核菌苗。显然核酸免疫是结核菌苗的重要研究方向。,由于BCG广泛应用的安全性，它可长期在体内存活，其增殖可达几个月，生长缓慢可诱发强的，持续的免疫应答，具有佐剂活性，可诱发TH1型免疫反应，以BCG为载体构建重组疫苗的研究日益受到注意。,七、嗜血流感杆菌苗（Hib）嗜血流感杆菌（Hib）为G-有荚膜短小杆菌，其荚膜多糖有特异型免疫原性，其中b型毒力最

23、强，主要引起化脓性感染如急性肺炎、脑膜炎、败血症等，常在流感、麻疹、百日咳、肺结核等之后合并感染。,磷酸聚核糖基核糖醇（PRP）是Hib多糖菌苗的有效成分，将PRP与载体蛋白如白喉（DT）、破伤风类毒素（TT）脑膜炎球菌外膜蛋白（OMP）等共价交联成多糖-蛋白结合苗。证明Hib-蛋白结合苗对婴幼儿使用安全，有免疫原性，可诱导免疫记忆，入侵性Hib嗜血流感杆菌感染有防御作用。,由于Hib结合苗的成功，WHO对目前批准的23个血清型肺炎球菌多糖与蛋白交联的结合苗，在各地进行临床观察，其中美国已完成III期临床，认为高度有效，用结合苗控制肺炎球菌病很可能会获更大成功。,八、细菌的DNA苗 DNA菌苗

24、是用编码抗原基因的真核表达质粒DNA直接于体内接种后，被细胞摄取并转录翻译，表达相应的抗原，通过不同途径诱导机体的特异免疫应答。进展情况列于表6-8。,表6-8 细菌DNA免疫研究情况,在核酸免疫研究中，用减毒的胞内细菌释放DNA苗的报导引人注意。绝大多数的胞内菌都可被DNA转染，携带这些质粒进入细胞的吞噬泡或胞浆，释放DNA；表达编码抗原，诱导体液或细胞免疫。与裸DNA释放相比，用细菌释放DNA的优点 如下：,1）用肌肉注射或基因枪注入DNA只能转染有限的抗原提呈细胞（APCs）；而通过适当的细菌释放DNA，能将质粒DNA特异靶向相关免疫组织的APCs，且除APCs外，还可靶向树突状细胞（D

25、Cs），能更好地进行抗原提呈。2）细菌的成份，如G-菌的LPS和G+菌的脂肽酸及细菌DNA中没有甲基化的序列等，都有佐剂活性，可增加释放DNA的免疫原性。3）细菌载体还能进行口服，转染肠相关淋巴组织，促进粘膜免疫效果。他们可停留在吞噬泡中，也可通过分泌溶质膜素破泡而进入胞浆。控制抗原提呈的途径及相应的T细胞亚类的效应反应。,用胞内细菌释放DNA系统也存在危险因素：1）入侵性虽然利于DNA释放，也存在毒力回复的危险。2）G-菌的LPS也有毒性问题。3）释放的DNA有整合到宿主细胞基因组的可能。,第四节 基因工程菌苗开发战略的几点考虑（Development strategy of gene en

26、gineering bacteria vaccine）,1、创新菌苗的研制，开发和应用（preparation，exploitation and application of new vaccine）近年对菌苗研制的主要贡献之一就是将荚膜多糖与蛋白载体交联起来，研制多糖-蛋白结合苗，使载体蛋白特异的T细胞参与辅助B细胞，产生多糖特异的抗体。解决了长期以来多糖菌苗对2岁以下的婴幼儿无效和无记忆反应的问题。Hib嗜血流感杆菌-蛋白结合苗，成为WHO的推荐项目，并建议推广至其它荚膜多糖菌苗中去。,2、对病原体致病与发病机制的认识及宿主抗感染免疫机制的了解（understanding of patho

27、genynosogenesis and mechanism of disease and immunomechanism）3、粘膜疫苗及粘膜释放途径是创新菌苗研制的重要方向（mucous membrane vaccine and the release pathway is the important direction of new vaccine production）机体90%以上的感染发生在粘膜或由粘膜入侵，正在研制的大多数疫苗实际上是粘膜疫苗。另外，粘膜免疫途径无可争议的优点是易于接受。,4、人类重要病原体基因组测序的完成，将为创新菌苗的研制提供新的机会和条件（supply the new occasion and condition）5、创新菌苗的研制需要不同学科的协作，理论的融合及各类生物技术包括动物模型的合理使用与创建（collaboration of different subject and fusion of theory）,