基因工程的操作复习.ppt
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1、基因工程的操作,1、掌握基因操作的工具2、掌握基因操作的基本步骤3、了解获取目的基因的方法,掌握PCR技术与细胞内DNA分子复制的异同4、掌握基因操作的工具在构建基因表达载体过程中的重要意义5、掌握农杆菌转化法的过程,了解其它转基因的方法6、掌握目的基因检测的方法,学习目标,基因工程的操作步骤,目的基因的检测与鉴定,获取目的基因,构建基因表达载体,将目的基因导入受体细胞,第一步:获取目的基因,从基因文库中获取目的基因,基因文库包括基因组文库和cDNA文库,工具:限制酶,DNA连接酶,人工合成目的基因,条件是:,基因比较小,且核苷酸序列已知,方法:,1、从蛋白质合成,2、反转录法,3、PCR法,
2、第二步:基因表达载体的构建:,它们所处的位置和有什么作用?,a、目的基因,b、启动子,c、终止子,d、标记基因,位于基因的首端,是mRNA聚合酶结合位点,位于基因的末端,终止转录,检测目的基因是否导入受体细胞,标记基因,第三步:将目的基因导入受体细胞(又称为转化),将目的基因导入植物细胞,将目的基因导入动物细胞,将目的基因导入微生物细胞,检测,导入检测:目的基因是否导入受体细胞,方法,DNA分子杂交,表达检测,转录检测分子杂交,翻译检测抗原抗体杂交,分子检测法,鉴定,抗虫鉴定抗病鉴定活性鉴定等,个体水平的鉴定,第四步:目的基因的检测与鉴定,关于限制酶的问题,一般来说,不同的限制酶有不同的识别序
3、列,有不同的切点位置,切出不同的黏性末端,但也有两种特殊情况:,1.不同的限制酶有不同的识别序列,但可以切出相同的黏性末端,如以下两种酶处理得到黏性末端均为AATT:,酶I,识别序列,GAATTCCTTAAG,酶II,AAAATTTTTTTTAAAA,两种酶经常用于同一个基因工程中,限制酶的选择使用,例题:基因工程中,需使用特定的限制酶切割目的基因和质粒,便于重组和筛选。已知限制酶的识别序列和切点是GGATCC,限制酶的识别序列和切点是GATC。根据下图示判断下列操作正确的是,A目的基因和质粒均用限制酶切割B目的基因和质粒均用限制酶切割C质粒用限制酶切割,目的基因用限制酶切割D质粒用限制酶切割
4、,目的基因用限制酶切割,限制酶的选择使用,变式训练1,抗四环素基因,EcoB,BamH,HinD,BamH,应选择哪种限制酶?,HinD,限制酶的选择使用,变式训练2,抗四环素基因,EcoB,HinD,BamH,抗青霉素基因,关于限制酶的问题,2.不同的限制酶有相同的识别序列,但可以切出不同的黏性末端,如:,酶I,识别序列,GGAATTCCCCTTAAGG,酶II,GGAATTCCCCTTAAGG,黏性末端,GAATTC,AATT,这两种酶不会在同一个基因工程中采用,1、将目的基因导入植物细胞,(1)农杆菌转化法,特点:,能感染双子叶植物和祼子植物,对大多数单子叶植物无感染能力,Ti质粒的TD
5、NA可转移至受体细胞并整合到其染色体上,转化过程:,Ti质粒目的基因,构建,表达载体,植物细胞,植物细胞染色体DNA,新性状,农杆菌,整合到染色体上,转移至受体细胞,(2)基因枪法,基因枪法又称微弹轰击法,是利用压缩气体产生的动力,将包裹在金属颗粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中,使目的基因与其整合并表达的方法。,常用于单子叶植物的转化方法,(2)基因枪法微弹轰击法,特点:成本高,适用于单子叶植物,胚珠,花药,花丝,柱头,花柱,子房壁,子房,雄蕊,雌蕊,(3)花粉通道法,植物花粉在柱头上萌发后,花粉管要穿过花柱直通胚囊。花粉管通道法就是在植物受粉后,花粉形成的花粉管还未愈合前,剪去柱头,然后
6、,滴加DNA(含目的基因),使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。,我国转基因抗虫棉就是用这种方法获得,2、将目的基因导入动物细胞,方法:,显微注射技术,操作程序:,提纯含目的基因表达载体,取受精卵,显微注射,移植到子宫,早期胚胎,新性状动物,2、将目的基因导入动物细胞方法:显微注射法程序:,目的基因表达载体提纯 取受精卵 显微注射 受精卵 新性状动物,3、将目的基因导入微生物细胞,常用法:Ca2+处理,常用菌:大肠杆菌,微生物作受体细胞原因:繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少,过程:,Ca2+处理大肠杆菌,感受态细胞,表达载体与感受态细胞混合,感受态细胞吸收DNA,比较目的基因导入不同细胞的
7、方法,农杆菌转化法,显微注射法,Ca2+处理法,体细胞,受精卵,原核细胞,(一)、检测,1、检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因(关键步骤),.首先取出转基因生物的基因组DNA,(1)方法:,DNA分子杂交,(2)过程:,.用含目的基因的DNA片段用放射性 同位素等作标记,以此做探针,.使探针和转基因生物的基因组杂交,若显示出杂交带,表明染色体已插入染色体DNA中,(二)、鉴定(个体生物学水平),2、检测目的基因是否转录出了mRNA,3、检测目的基因是否翻译成蛋白质,抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等,原理:,分 子 杂 交,方法:,抗原抗体杂交,方法:用上述探针和转基因生物的mRNA
8、杂交,若出现杂交带,表明目的基因转录出了mRNA,PCR技术,原理:前提:原料:优点 过程:,PCR扩增仪,DNA复制,已知目的基因的一段核苷酸序列,:以_方式扩增,在短时间内大量扩增目的基因,指数,模板DNA;DNA引物;四种脱氧核苷酸;热稳定DNA聚合酶(Taq酶);离子,变性,复性,延伸,关于PCR技术中的原料和能量,问题:PCR技术也是合成DNA分子的过程,属于合成反应,是消耗能量的,但图18中未提到能量。,图18分析:PCR的原料是dCTP、dGTP、dATP、dTTP。这四种物质并不是必修二中我们熟悉的四种游离的脱氧核苷酸,而是脱氧核苷酸连接上了两个磷酸,和ATP一样,是高能化合物
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