基因工程的基本操作程序主要包括四个基本步骤.ppt

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1、点点生物学教学,点点生物学教学,基因工程的基本操作程序主要包括四个基本步骤：,1）目的基因的获取2）基因表达载体的构建3）将目的基因导入受体细胞4）目的基因的检测与鉴定,点点生物学教学,点点生物学教学,步骤一：目的基因的获取,目的基因是人们所需要转移或改造的基因,获取目的基因是实施基因工程的第一步。,如苏云金芽孢杆菌的抗虫基因，还有植物的抗病（抗病毒、抗细菌）基因、种子贮藏蛋白的基因，以及人的胰岛素基因、干扰素基因等。,点点生物学教学,目的基因的获得,从基因文库获得基因文库利用PCR技术扩增人工合成,基因组文库部分基因文库,已知序列,未知序列,点点生物学教学,哪些新技术能大大简化基因工程的操作

2、技术？,1）DNA序列自动测序仪：2）PCR技术：,对提取出来的基因进行核苷酸序列分析。,使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增。,点点生物学教学,点点生物学教学,3）从基因文库中获取目的基因：,基因文库:将含有某种生物不同基因的许多DNA片段,导入受体菌的群体中储存,各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因,称为基因文库(gene library)基因组文库:基因文库中包含了一种生物所有的基因,这种基因文库叫做基因组文库.部分基因文库:基因文库中包含了一种生物的一部分基因,这种基因文库叫做部分基因文库.,点点生物学教学,点点生物学教学,点点生物学教学,用DNA重组技术将某种生物的总DNA用特

3、定的限制性内切酶切割成一个个片段，然后将这些片段随机地连接在某些质粒或其他载体上，再将它们转移到适当的宿主细胞中，通过细胞的增殖而构成各个片段的无性繁殖系（克隆），当这些克隆多到可以包括某种生物的全部基因时，这一批克隆的总体就称为该种生物的基因文库。这一定义也适用于线粒体DNA和叶绿体DNA，分别称为某种生物的线粒体基因文库或叶绿体基因文库。为了有效地保存基因文库，可通过细菌在固体培养基上繁殖而使包含各个特定DNA片段的细菌增多。通过分子杂交的方法，可以筛选出包含有所需基因的DNA片段的细菌（或噬菌体）。经过扩增得到大量这样的细菌（或噬菌体），从中便可分离出所需基因的DNA片段。建立和使用基因

4、文库是分离高等真核生物基因的有效手段，对于基因定位和基因工程的研究都很有用。,点点生物学教学,人工合成,已知其序列已知其mRNA 的序列已知其翻译产物的氨基酸序列,点点生物学教学,步骤二：基因表达载体的构建,1）用一定的限制酶切割质粒，使其出现一个切口，露出黏性末端。2）用同一种限制酶切断目的基因，使其产生相同的黏性末端。3）将切下的目的基因片段插入质粒的切口处，再加入适量DNA连接酶，形成了一个重组DNA分子（重组质粒）,目的基因与运载体的结合过程，实际上是不同来源的基因重组的过程。,点点生物学教学,点点生物学教学,常用的受体细胞：,有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。,

5、将目的基因导入受体细胞的原理,借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。,步骤三：目的基因导入受体细胞-转化,点点生物学教学,直接导入法有电击、显微注射、直接吸收、基因枪等方法。（1）电击法：借助电击仪高压脉冲把目的基因打入宿主细胞。（2）显微注射法：利用微量注射器在显微镜下直接把目的基因注入宿主细胞。（3）直接吸收法：把目的基因和宿主细胞混在一起，让其吸收。（4）基因枪法：在金属微粒上涂一层目的基因，然后发射到宿主细胞中。间接导入法常用的载体是质粒、噬菌体、科斯质粒。（1）质粒是细菌染色体DNA以外的环状双链DNA分子，它能自我复制，也可整合到细胞染色体DNA中与其一起表达。质粒通常还含有标记基因，这可

6、以从细胞的表型特征来识别。（2）噬菌体是一种细菌病毒，其环状双链DNA可以作为目的基因的载体。（3）科斯质粒是一种杂种质粒，含有质粒和噬菌体的部分顺序，很适合用作真核生物基因的载体。,点点生物学教学,1.将目的基因导入植物细胞,其他方法：基因枪法，花粉管通道法,点点生物学教学,2.将目的基因导入动物细胞,显微注射法,点点生物学教学,3.将目的基因导入微生物细胞,大肠杆菌细胞最常用的转化方法是:首先用Ca2+处理细胞,以增大细菌细胞壁的通透性,使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态,这种细胞称为感受态细胞.第二步是将重组表达载体DNA分子溶于缓冲液中与感受态细胞混合,在一定的温度下促

7、进感受态细胞吸收DNA分子,完成转化过程.第三步目的基因在受体细胞内，随其繁殖而复制，由于细菌繁殖的速度非常快，在很短的时间内就能获得大量的目的基因。,点点生物学教学,1）将细菌用CaCl2处理，以增大细菌细胞壁的通透性。2）使含有目的基因的重组质粒进入受体细胞。3）目的基因在受体细胞内，随其繁殖而复制，由于细菌繁殖的速度非常快，在很短的时间内就能获得大量的目的基因。,点点生物学教学,步骤四：目的基因的检测与鉴定,点点生物学教学,四、目的基因的检测与鉴定,1、检测与鉴定的目的,目的基因进入受体细胞后，是否可以稳定维持和表达其遗传特性,检测目的基因是否插入了转基因生物的染色体DNA上,2、,检测

8、目的基因是否转录出了mRNA,检测目的基因是否翻译成蛋白质,另外：个体生物学水平的鉴定,点点生物学教学,思考：检测mRNA 是否合成，可以用分子杂交的方法吗？,#检测目的基因是否翻译成蛋白质,抗原抗体杂交,#个体生物学水平的鉴定,点点生物学教学,不能，受体细胞必须表现出特定的性状，才能说明目的基因完成了表达。,受体细胞摄入DNA分子后就说明目的基因完成了表达吗？,若不能表达，要对抗虫基因再进行修饰。,点点生物学教学,点点生物学教学,前三步的处理十分繁锁，为保证目的基因得到有效利用，通常用大量的受体细胞来接受不多的目的基因。这样，处理的受体细胞中真正摄入了目的基因的很少，必须将它从中检测出来。,

9、细菌的检测，将每个受体细胞单独培养形成菌落，检测菌落中是否有目的基因的表达产物。淘汰无表达产物的菌落，保留有表达产物的进一步培养、研究。,点点生物学教学,多细胞生物的检测，将每个受体细胞单独培养并诱导发育成完整个体，检测这些个体是否摄入目的基因，摄入的基因是否表达（是否表现出相应的性状）。淘汰无变化的个体，保留有相应变化的个体进一步培养、研究。,例：用棉铃饲喂棉铃虫，如虫吃后不出现中毒症状，说明未摄入目的基因或摄入目的基因未表达。如虫吃后中毒死亡，则说明摄入了抗虫基因并得到表达。,点点生物学教学,寻根问底（1）为什么要构建基因文库？直接从含有目的基因的生物体内提取不行吗？,提示：构建基因文库是

10、获取目的基因的方法之一，并不是惟一的方式。如果所需要的目的基因序列已知，就可以通过PCR方式从含有该基因的生物的DNA中，直接获得，也可以通过反转录，用PCR方式从mRNA中获得，不一定要构建基因文库。但如果所需要的目的基因的序列完全不知，或只知道目的基因序列的一段，或想从一种生物体内获得许多基因，或者想知道这种生物与另一种生物之间有多少基因不同，或者想知道一种生物在个体发育的不同阶段表达的基因有什么不同，或者想得到一种生物的全基因组序列，往往就需要构建基因文库。,点点生物学教学,寻根问底：将目的基因直接导入受体细胞不是更简便吗？如果这么做，结果会怎样？,提示：有人采用总DNA注射法进行遗传转

11、化，即将一个生物中的总DNA提取出来，通过注射或花粉管通道法导入受体植物，没有进行表达载体的构建，这种方法针对性差，完全靠运气，也无法确定什么基因导入了受体植物。此法目前争议颇多，严格来讲不算基因工程。,点点生物学教学,1.利用大肠杆菌可以生产出人的胰岛素，联系前面有关细胞器功能的知识，结合基因工程操作程序的基本思路，思考一下，若要生产人的糖蛋白，可以用大肠杆菌吗？,有些蛋白质肽链上有共价结合的糖链，这些糖链是在内质网和高尔基复合体上加工完成的，内质网和高尔基复合体存在于真核细胞中，大肠杆菌不存在这两种细胞器，因此，在大肠杆菌中生产这种糖蛋白是不可能的。,2.-珠蛋白是动物血红蛋白的重要组成成

12、分。当它的成分异常时，动物有可能患某种疾病，如镰刀形细胞贫血症。假如让你用基因工程的方法，使大肠杆菌生产出鼠的-珠蛋白，想一想，应如何进行设计？,寻根问底：,点点生物学教学,（1）从小鼠中克隆出-珠蛋白基因的编码序列（cDNA）。（2）将cDNA前接上在大肠杆菌中可以适用的启动子，另外加上抗四环素的基因，构建成一个表达载体。（3）将表达载体导入无四环素抗性的大肠杆菌中，然后在含有四环素的培养基上培养大肠杆菌。如果表达载体未进入大肠杆菌中，大肠杆菌会因不含有抗四环素基因而死掉；如果培养基上长出大肠杆菌菌落，则表明-珠蛋白基因已进入其中。（4）培养进入了-珠蛋白基因的大肠杆菌，收集菌体，破碎后从中

13、提取-珠蛋白。,点点生物学教学,思考：作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？为什么？,不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用，还需要有其他控制元件，如启动子、终止子和标记基因等。必须构建上述元件的主要理由是：（1）生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因的启动子才能比较有利于基因的表达；（2）通过cDNA文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体生物中无法转录；,点点生物学教学,（3）目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记；（4）为了增强目的基因的表达水平，往往还要增加一些其他调控元件，如增强子等；（5）有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的什

14、么部位，往往要加上可以标识存在部位的基因（或做成目的基因与标识基因的融合基因），如绿色荧光蛋白基因等。,点点生物学教学,3.根据农杆菌可将目的基因导入双子叶植物的机理,你能分析出不能导入单子叶植物的原因吗?若将一个抗病基因导入小麦中,理论上讲你应该怎样做?,要选择合适的农杆菌菌株，因为不是所有的农杆菌菌株都可以侵染单子叶植物；要加趋化和诱导的物质，一般为乙酰丁香酮等，目的是使农杆菌向植物组织的受伤部位靠拢（趋化性）和激活农杆菌的Vir区（诱导）的基因，使T-DNA转移并插入到染色体DNA上。,点点生物学教学,1为了培育节水高产品种，科学家将大麦中与抗旱节水有关的基因导入小麦，得到转基因小麦，其

15、水分利用率提高了20%。这项技术的遗传学原理是A基因重组 B基因突变 C基因复制 D基因分离,巩固练习,点点生物学教学,2利用苏云金芽孢杆菌的抗虫基因培育的抗虫棉是否成功，最好检测A是否有抗生素产生 B是否有目的基因表达C是否有抗虫的性状出现 D是否能分离到目的基因,巩固练习,点点生物学教学,3水母发光蛋白由236个氨基酸构成，其中天冬氨酸、甘氨酸和丝氨酸构成发光环，现已将这种蛋白质的基因作为生物转基因的标记，在转基因技术中，这种蛋白质的作用是A促使目的基因导入受体细胞 B促使目的基因在受体细胞内复制C使目的基因容易被检测出来 D使目的基因容易成功表达,巩固练习,点点生物学教学,4根据mRNA

16、的信息推出获取目的基因的方法是（）A、用DNA探针测出目的基因B、用mRNA探针测出目的基因C、用mRNA反转录形成目的基因D、用PCR技术扩增mRNA,巩固练习,点点生物学教学,5 PCR技术扩增DNA,需要的条件是()目的基因引物四种脱氧核苷酸DNA聚合酶等mRNA核糖体A、B、C、D、,巩固练习,点点生物学教学,6 获取目的基因的方法有多种，下列不属于目的基因获取方法的是（）A、从基因组文库中获取B、从cDNA文库中获取 C、从含目的基因生物细胞中获取D、利用PCR技术获取,巩固练习,点点生物学教学,7 下列高科技成果中，根据基因重组原理进行的是（）A、我国科学家袁隆平利用杂交技术培育出

17、超级水稻。B、我国科学家将苏云金杆菌的某些基因转移到棉花体内，培育出抗虫棉。C、我国科学家通过返回式卫星搭载种子培育出太空椒。D、我国科学家通过体细胞克隆技术培育出克隆牛。,巩固练习,点点生物学教学,8 有关基因工程的叙述正确的是（）A、限制性内切酶只在获得目的基因时才使用B、DNA连接酶可以切断磷酸二酯键C、质粒都可以做载体基因工程都能定向改变生物的性状,巩固练习,点点生物学教学,9 科学家将控制某药物蛋白合成的基因转移到白色来亨鸡胚胎细胞的DNA中,发育后的雌鸡就能产出含该药物蛋白的鸡蛋,在每一只鸡蛋的蛋清中都含有大量的药物蛋白;而且这些验收孵出的鸡,仍能产出含该药物蛋白的鸡蛋.据此分析()A.这些鸡是转基因工程的产物 B.这种变异属于可遗传的变异C.该过程运用了胚胎移植技术 D.该种变异属于定向变异,巩固练习,点点生物学教学,10 下图是利用基因工程办法生产人白细胞干扰素的基本过程图，据图回答：（1）过程需要_酶的参与。（2）物质是从大肠杆菌分离出的_。其化学本质是_，它必须能在宿主细胞中_。(3)过程表明目的基因_,