基因工程的基本操作程序2-公开课.ppt

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1、,2、能否用SARS病毒作为基因载体？,3、作为载体，若没有切割位点将怎样？,4、携带目的基因的载体是否进入了受体细胞，如何鉴定？,5、假如目的基因导入受体细胞后不能复制，将怎样？,1、从化学组成来看，载体应含有什么成分？,双链DNA,不能,目的基因不能插入,载体上应有标记基因,可能造成基因丢失,分子搬运工载体,四环素抗性基因,氨苄青霉素抗性基因,人胰岛素基因,目的基因插入点,目的基因插入点,目的基因,人胰岛素基因,含有四环素的完全培养基,含有氨苄青霉素的完全培养基,死亡,死亡,存活,存活,死亡,存活,1.2 基因工程的基本操作程序,1、目的基因的获取,2、基因表达载体的构建,3、将目的基因导

2、入受体细胞,4、目的基因的检测与鉴定,1、从基因文库中获取（序列未知）,2、利用PCR技术扩增（序列已知）,基因文库,基因组文库,部分基因文库如：cDNA文库,聚合酶链式反应,一、目的基因的获取,3、人工合成,(基因比较小，序列已知),反转录法根据已知的氨基酸序列合成DNA（化学合成）,依据：目的基因的有关信息。如：根据基因的核苷酸序列 基因的功能 基因在染色体上的位置 基因的转录产物mRNA 基因翻译产物蛋白质等特性,从基因文库中获取目的基因,利用PCR技术扩增目的基因,概念：PCR全称为_，是一项 在生物_复制_的核酸合成技术。,原理：_,多聚酶链式反应,体外,特定DNA片段,DNA复制,

3、一段已知目的基因的核苷酸序列,蛋白质的氨基酸序列,mRNA的核苷酸序列,基因的核苷酸序列,目的基因,化学合成,推测,推测,人工合成法,（基因较小，核苷酸序列已知）,反转录法,化学合成法,二、基因表达载体的构建（核心）,1.目的,A.使目的基因在受体细胞中稳定存在 并遗传给子代,B.同时使目的基因能表达和发挥作用,2.基因表达载体的组成：,a、目的基因,b、启动子,c、终止子,d、标记基因,质粒,目的基因,限制酶,3.基因表达载体的构建过程,（1）用_切割质粒，使其出现切口露出_。（2）用_切割目 的基因，使其产生_ _。,（3）将目的基因插入质粒的_处，加入_，形成了一个重组DNA分子,限制酶

4、,黏性末端,同种限制酶,的黏性末端,切口,DNA连接酶,相同,三、将目的基因导入受体细胞-转化,目的基因进入_内，并且在 受体细胞内维持_和_的过程,稳定,表达,受体细胞,方法,将目的基因导入植物细胞,将目的基因导入动物细胞,将目的基因导入微生物细胞,农杆菌转化法,基因枪法,花粉管通道法,显微注射法,Ca2+处理法,1、将目的基因导入植物细胞,（1）农杆菌转化法,特点:,a.能感染双子叶植物和祼子植物,对单子叶植物无感染能力,b.Ti质粒的TDNA可转移至受体细胞并整合到其染色体上,外源基因,（2）基因枪法,特点：成本高,适用于单子叶植物,（3）花粉通道法,我国转基因抗虫棉就是用这种方法获得,

5、2、将目的基因导入动物细胞方法：显微注射法程序：,目的基因表达载体提纯 取卵（受精卵）显微注射 受精卵 新性状动物,3、将目的基因导入微生物细胞,（1）方法：Ca2+处理法（增加细胞膜通透性）,（2）微生物作受体细胞原因：繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少,（3）过程：,Ca2+处理大肠杆菌,感受态细胞,表达载体与感受态细胞混合,感受态细胞吸收DNA,四、目的基因的检测与鉴定,检测（分子水平）:是否插入目的基因是否转录是否翻译鉴定:个体生物学水平鉴定,（1）检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因,A 方法:,DNA分子杂交,B 过程:,1.检测,基因探针通过分子杂交与目的基因结合，产

6、生杂交带，能从浩翰的基因组中把目的基因显示出来。,(2)检测目的基因是否转录出了mRNA,方法:,分子杂交法,过程:用上述探针和转基因生物的mRNA杂交,若出现杂交带,表明目的基因转录出了mRNA。,（3）检测目的基因是否翻译成蛋白质,方法:,抗原-抗体杂交,提取,方法抗原-抗体杂交,Bt毒素蛋白,将Bt毒蛋白注射小鼠体内,从小鼠血管抽出血液分离出抗Bt毒素的抗体,抗体,蛋白质,出现杂交带,脱分化,组织培养,2.鉴定（个体生物学水平）,抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等,目的基因的表达和检测,抗虫鉴定 抗病鉴定活性鉴定等,抗原抗体杂交法,DNA-RNA分子杂交法,DNA分子杂交法,非编码区,非编码

7、区,编码区,外显子,内含子,终止子,基因的结构,启动子,原核,真核,原核细胞与真核细胞的基因结构比较,思考,编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核细胞与真核细胞基因结构一样长吗？,连续,不连续,编码区,非编码,编码区,非编码区,非编码区,mRNA前体,mRNA,单链DNA,cDNA,转录,剪接,逆转录,复制,启动子,终止子,基因,不含非编码系列。即不含非编码区和内含子,模板DNA,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,引物1,引物2,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,引物1,引物2,Taq酶,Taq酶,基因组DNA文库与cDNA文库的比较,PCR的基本原理,P

8、CR反应条件PCR过程PCR的特点,第1轮结束,第2轮开始,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,Taq,Taq,Taq,Taq,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,第2轮结束,过程：,a、变性（90-95）：双链DNA在受热下，_断裂，形成_,b、复性（55-65）：温度降低，引物与单链DNA结合，形成局部_。,c、延伸（70-75）：在Taq酶的作用下，合成与模板互补的_。,氢键,单链DNA,双链,DNA链,方式：以_方式扩增，即_,条件：前提条件:_,结果：,指数,2n,短时间内大量扩增目的基因,已知基因的核苷酸序列,PCR技术扩增与DNA复制的比较

9、,高温,解旋酶,体外复制,主要在细胞核内,热稳定的DNA聚合酶,细胞内的DNA聚合酶,（3）人工合成法：,在基因较小，核苷酸序列已知的情况下，可以利用DNA合成仪人工合成,化学合成法、反转录法,蛋白质,mRNA,DNA,DNA,根据已知的氨基酸序列合成DNA法：,生物某个发育时期的mRNA,单链DNA,双链cDNA片段,重组DNA,与载体连接,cDNA文库,反转录酶,DNA聚合酶,导入受体菌中储存,cDNA文库的构建-逆转录法：,目的基因所在片段,CTTAA,G,CTTAA,G,CTTAA,CTTAA,G,G,PSt,运载体的特点3：,有标记基因,导入,接种培养,接种培养,接种培养,接种培养,

10、含有四环素的完全培养基,完全培养基,大肠杆菌不含抗四环素基因,证明：,不存活,含有四环素的完全培养基,证明：,大肠杆菌含抗四环素基因,证明：,大肠杆菌的受体细胞含有目的基因,四环素抗性基因,四环素抗性基因,完全培养基,存活,如何把导入了目的基因的受体细胞筛选出来？,导入,接种培养,接种培养,接种培养,接种培养,含有四环素的完全培养基,完全培养基,大肠杆菌不含抗四环素基因,证明：,不存活,含有四环素的完全培养基,证明：,大肠杆菌含抗四环素基因,证明：,大肠杆菌的受体细胞含有目的基因,四环素抗性基因,四环素抗性基因,完全培养基,存活,如何把导入了目的基因的受体细胞筛选出来？,基因文库,将含有某种生

11、物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。,（便于在不知道目的基因核苷酸序列的情况下，获得所需的目的基因。）,某种生物的全部DNA,限制酶,DNA片段,DNA片段与载体连接,重组DNA,基因组文库,导入受体菌中储存,基因组文库的构建,导入,接种培养,含有四环素的完全培养基,死亡,如何把导入了目的基因的受体细胞筛选出来？,接种培养,含有氨苄青霉素的完全培养基,死亡,导入,接种培养,含有四环素的完全培养基,存活,如何把导入了目的基因的受体细胞筛选出来？,接种培养,含有氨苄青霉素的完全培养基,存活,运载体自连,导入,接种培养,含有四环素的完全培养基,死亡,如何把导入了目的基因的受体细胞筛选出来？,接种培养,含有氨苄青霉素的完全培养基,存活,