基因工程原理及实验技术.ppt

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1、基因工程原理及实验技术 Principles And Experimental Technics in Gene Engineering,教材和参考书,教材：简明基因工程与应用吴建平 主编，2005，科学出版社主要参考书：1.基因工程 张惠展 编著,华东理工大学出版社,2005 2.基因工程 孙明 主编,高等教育出版社,2006 3.基因工程原理 吴乃虎 编著，科学出版社,(第二版),1998 4.基因工程 彭银祥,主编,2007 5.基因工程技术 钟卫鸿主编,化学工业出版社,2007,第一章 基因工程的概论,第一节 基因工程的概念,一、基因工程的基本概念 狭义基因工程 广义基因工程,狭义基因

2、工程,狭义的基因工程(gene engineering):从狭义上讲，基因工程是指将一种或多种生物体(供体)的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另种生物体(受体)内使之按照人们的意愿遗传并表达出新的性状。因此，供体、受休、载体称为基因工程的三大要素。,狭义基因工程,狭义的基因工程:就是重组DNA技术（recombinant DNA techniques）1）重组DNA技术（recombinant DNA techniques)2）分子克隆（molecular cloning)3）基因克隆（gene cloning)4）遗传操作(genetic manipulation）5）遗传工程(gen

3、etic engineering)6）基因工程(gene engineering),广义基因工程,广义的基因工程：是指DNA重组技术的产业化设计与应用，包括上游技术和下游技术两大组成部分。上游技术指的是外源基因重组、克隆、表达的设计与构建(即狭义的基因工程)；下游技术则涉及含有重组外源基因的生物细胞(基因工程菌或细胞)的大规模培养以及外源基因的表达、产物的分离、纯化过程。因此，广义的基因工程概念更倾向于工程学的范畴。,广义的基因工程是一个高度统一的整体。上游DNA重组的设计必须以简化下游操作工艺和装备为指导思想。而下游过程则是上游基因重组蓝图的体现与保证。这是基因工程产业化的基本原则。,狭义的

4、基因工程 重组DNA技术 广义的基因工程 重组DNA技术 细胞工程 染色体工程 细胞器工程,二、基因工程的基本过程,基因工程:两大部分组成 基因工程的整个过程由工程菌(细胞)的设计构建和基因产物的生产两大部分组成 工程菌(细胞)的设计构建:实验室里进行，其单元操作过程如下:(1)从供体细胞中分离出基因组DNA，用限制性核酸内切酶分别将外源 DNA(包括外源基因或目的基因)和载体分子切开(简称“切”)；,(2)用DNA连接酶将含有外源基因的DNA片段接到载体分子上形成DNA重组分子(简称“接”)；(3)借助于细胞转化手段将DNA重组分子导入受体细胞中(简称“转”)；(4)短时间培养转化细胞、以扩

5、增DNA重组分子或使其整合到受体细胞的基因组中(简称“增”)；(5)筛选和鉴定转化细胞，获得使外源基因高效稳定表达的基因工程菌或细胞(简称“检”)；基因工程的上游操作过程；可简化为：切、接、转、增、检。,三基因工程的基本原理,基因工程的主体战略思想是外源基因的稳定高效表达为目的其基本原理可从以下四个方面考虑。（1)利用载体DNA在受体细胞中独立于染色体DNA而自主复制的特性，将外源基因与载体分子重组，通过载体分子的扩增提高外源基因在受体细胞中的剂量借此提高其宏观表达水平。这里涉及到DNA分子高拷贝复制以及稳定遗传的分子遗传学原理。,(2)筛选、修饰和重组启动子、增强子、操作子、终止子等基因的转

6、录调控元件，并将这些元件与外源基因精细拼接通过强化外源基因的转录提高其表达水平。(3)选择、修饰和重组核糖体结合位点及密码子等mRNA的翻译调控元件。强化受体细胞中蛋白质的生物合成过程。上述(2)和(3)两点均涉及到基因表达调控的分子生物学原理。,(4)基因工程菌(细胞)是现代生物工程中的微型生物反应器，在强化并维持其最佳生产效能的基础上，从工程菌(细胞)大规模培养的工程和工艺角度切入，合理控制微型生物反应器的增殖速度和最终数量，也是提高外源基因表达产物产量的主要环节，这里涉及的是生物化学工程的基本理论体系。因此分子遗传学、分子生物学以及生物化学是基因工程原理的三大基石。,.四、生物工程等概念

7、,生物工程：直接或间接利用生物体的机能生产物质的技术。包括发酵技术、基因重组、细胞融合、细胞大量培养、生物反应器等技术。生物技术：是在细胞水平上，特别是在分子水平上对生物体遗传性实现巨大的接近定向改造的一套内容繁多和复杂的技术。包括基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程等。,现代科技革命,高新技术,生物技术,基因工程,基因克隆,第二节 基因工程的发展历史,基因工程的发展历史概括为三个阶段 基因工程的诞生 基因工程的成熟 基因工程的腾飞,一、基因工程的诞生,基因工程是一项新兴的工程技术，它的诞生需要理论和技术上的支持 理论上的三大发现技术上的三大发明,证明了生物的遗传物质是DNA（基因工程的先导）

8、DNA的双螺旋结构和半保留复制机理遗传信息的传递方式（中心法则）,1.理论上的三大发现,证明了生物的遗传物质是DNA（基因工程的先导）：1944年首先用体外的转化实验证明基因的化学本质就是DNA分子的是加拿大生物化学家艾弗里 O.T.Avery（1877-1955）。他和他的合作者CMMacLeod及MMcCarty在纽约进行细菌转化的研究。,1)遗传物质是DNA,体外的转化实验证明基因就是DNA分子,2).DNA的双螺旋结构和半保留复制机理,DNA双螺旋结构的发现Watson（沃森）and Crick（克里克）（1953）美国遗传学家Watson(J.Watson)和英国生物学家克里克(F.

9、Crick)1953年4月25日DNA的双螺旋结构假说（不到1000字的短文）核酸的分子结构脱氧核糖核酸的一个结构模型在（自然）杂志上发表。1个月后在（自然）杂志上又发表了遗传物质的复制机理。1962年与M.H.F.Wilkins 共获诺贝尔生理学奖。DNA半保留复制机理的证明Meselson-Stahl实验(1958)DNA复制模式的破解M.Meselson(Matthew Meselson,西尔逊)and F.W.Stahl(Franklin Stahl,斯塔尔)(1958)1958年来西尔逊（Meselson）和斯塔尔（Stahl）首次在分子水平上成功地证明了DNA的半保守复制（semi

10、conservative replication）利用氮标记技术在大肠杆菌中首次证实了DNA的半保留复制(15N),DNA半保留复制图,3）遗传信息的传递方式（中心法则）,中心法则的确立F.Crick(1958),中心法则的确立F.Crick(1958),中心法则的确立F.Crick(1958）,1958年克里克确立的中心法则(1971年修改),最早提出遗传密码这一名词的是量子力学奠基人之一，奥地利物理学家施勒丁格(ESchrodinger，1944)。第一个提出遗传密码具体设想的是美国物理学家G.Gamov，他通过推算提出了三联体密码子的概念，并且进一步推论一种氨基酸可能不止有一个密码子。第

11、一个用实验破译密码子的是马太(Matthaei)和尼伦伯格(Nirenberg)，1966 M.Nirenberg and H.Khorana（1968年诺贝尔生理医学奖获得者）建立了完整的遗传密码表,DNA技术分子体外切割与连接技术 限制性内切酶(1970)和DNA连接酶(1967)发现，标志着DNA重组时代的开始基因工程载体技术 1970载体（vector）的使用成功1970年，逆转录酶的发现 使真核基因的制备成为可能。,2 技术上的三大发明,DNA技术分子体外切割与连接技术 限制性内切酶和DNA连接酶的发现,限制性核酸内切酶Hind 1970年，美国生化學家 Simith 和Wilcox

12、从流感嗜血杆菌中分离提纯了限制性核酸内切酶 Hind（1978年诺贝尔生理医学奖获得者)EcoR 1限制性核酸内切酶(1972年Bover实验室 发现）GAATTC DNA连接酶的发现：1967年世界上5个实验室几乎同时发现了DNA连接酶。1970年，在美国Khorana实验室发现了一种高效连接活性的DNA连接酶T4 DNA连接酶,1970美国Dullecco Temin 和Baltimore（1975年诺贝尔生理医学奖获得者）在肿瘤病毒中存在反转录酶打破了中心法则，使真核基因的制备成为可能。DNA分子序列分析及相关技术的发展也推动了基因工程的发展 DNA分子的核苷酸序列分析技术，琼脂糖凝胶电

13、泳和Southern杂交技术等技术的展。,基因工程载体技术,1970载体（vector）的使用成功.1970年噬菌体导入大肠杆菌细胞内（转化）,1970年，逆转录的发现.,1973年，美国斯坦福大学Boyer 和Cohen等获得了抗四环素和抗新霉素（卡那霉素）的重组菌落，标志着基因工程的诞生。1973年建立的基因工程的基本模式为标志的。他们将大肠杆菌体内的两个不同的质粒提取出来，拼接成一个杂合的质粒。当杂合质粒被导入大肠杆菌后，它能在大肠杆菌内复制并表达双亲质粒的遗传信息。这是基因工程的第一个成功的克隆转化实验。,Tetracycline pSC101,EcoR I,DNA Ligase,Ka

14、namycin R6-5,Kanr and Tetr,基因工程的诞生标志,基因工程的成熟,1977年日本的Itakura及其同事首次在大肠杆菌中克隆并表达了人的生长激素释放抑制素基因。几个月后美国的Ullvich克隆并表达了人的胰岛素基因。1978年，美国Genentech公司开发出利用重组大肠杆菌合成人胰岛素的先进生产工艺，从而揭开了基因工程产业化的序幕。,表1-1 主要基因工程产品的研制、开发、上市时间,三、基因工程的腾飞：,1.1982年，美国人，大鼠生长激素基因转入小鼠；2.1983年，美国人，Ti质粒导入植物细胞（细菌 Neor基因）3.1990年，美国人，腺苷脱氨酶（ADA）基因治

15、疗，重度联合免疫缺陷症（SDID）4.1990年，美国倡导，人类基因组计划，15年时间30亿USD；2000年6月26日各国科学家向全世界宣布“人类基因组计划”工作草图绘制成功，“基因”和“基因组研究”更是成为人们谈论的焦点问题。2003 人类基因组侧序完成。5.1997年，英国，克隆多利绵羊,三、基因工程的腾飞：,四.基因工程的意义,基因工程可以绕过远缘有性杂交的困难，使基因在微生物、植物、动物之间交流，迅速并定向的获得人类需要的新的生物类型概括地讲，其意义体现在以下三个方面 大规模生产生物分子；设计构建新物种；搜集、分离、鉴定生物信息资源,导致第四次工业大革命,1980年11月15日，美国

16、纽约证券交易所开盘的20分钟内，Genentech公司的新上市股要从3.5USD上至89USD，胰岛素基因表达 1.医学：抗病毒、抗癌因子、新型抗生素、疫苗、抗衰老保健品、心脏血管药物、生长因子诊断剂 2.轻工食品：氨基酸、助鲜剂、甜味剂、淀粉酶、纤维素酶、脂肪酶蛋白酶、生物拆分混旋体 3.能源：石油二次开采、纤维素分解、太阳能转换 4.环保：微生物生态种群 5.信息：蛋白芯片、基因芯片 日本政府称基因工程为战略工业,第二次农业大革命,1.蛋白类杀虫剂（生物农药）、抗广谱虫害植物；2.农作物品种改良；高营养、长保存、抗环境压力、花卉颜色与型状；3.畜牧业；高蛋白乳汁、鱼生长激素、饲料利用率4.固氮,第四次医学大革命,1.分子病：（文明病富贵病）基因治疗，遗传病、心脑血管病、糖尿病、癌症、过度肥胖综合症、老年痴呆症、骨质疏松症 2.抗衰老：端粒酶编码基因基因疗法补充突变基因原始产物、更换突变基因,五、基因工程的应用,工业轻工业能源工业,医药重组药物基因治疗检测遗传疾病、病原,农业,抗病虫提高品质提高花卉的观赏价值抗逆性家畜瘦肉比饲料利用率加快生长,