基因工程原理与技术-植物基因工程.ppt

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1、植物基因工程 1983年，首次获得转基因植物转基因烟草 现在，已获得200多种植物的转基因植株。,第一节 农杆菌及其转化体系一、根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciences)的生物学特征1、形态 细胞呈杆状，大小为 0.8 um 1.53.0um，14根周生鞭毛，菌落无色、光滑。2、生长条件 最适温度：2530，28培养；最适pH：6.09.03、宿主植物 双子叶植物、裸子植物4、侵染宿主的症状及原因 冠瘿瘤，Ti质粒(tumor inducing plasmid)的T-DNA。T-DNA是指农杆菌质粒上一段能转移并整合到植物染色体上的DNA片段。,二、Ti质粒的结构和功

2、能1、Ti质粒的类型与分区 环状双链 DNA分子，140235 kb。根据其诱导植物细胞产生冠瘿碱的种类，分为章鱼碱型、胭脂碱型、农杆碱型、农杆菌素碱型(琥珀碱型)。,章鱼碱型,2、T-DNA的结构与功能 边界序列：25bp，TGACACGATATATTGGCGGGTAAAC 右边界序列是完全保守的，对T-DNA转移是必须的。,3、Vir区的结构与功能 3040 kb，有virAvirM等操纵子。virA操纵子：组成型，长约为2.8kb，virA基因。VirA蛋白(92kD)是内膜受体蛋白，感应并结合酚类化合物(乙酰丁香酮，AS)，是一种自激酶并使VirG蛋白磷酸化而被激活。virG操纵子：组

3、成型，1.0kb，virG基因。VirG蛋白(30kD)为转录激活因子，诱导其他vir基因的表达。virB操纵子：诱导型，virB1virB11基因。VirB蛋白构成跨膜复合体(T-链复合体运输器)供T-DNA越膜转移。virC操纵子：诱导型，virC1、virC2基因。VirC1蛋白与超驱动序列(离右边界外侧17bp处的一个24bp的保守序列)结合，促进T-DNA加工。,virD操纵子：诱导型，virD1virD4基因。VirD1(16kD)、VirD2(47kD)蛋白参与T-DNA加工形成T-链：首先VirD1与25bp边界序列亲和结合，使其松弛，然后使VirD2在特异位点剪切。VirD2

4、与T-链的5端共价结合，并核定位信号，将T-链复合体导向细胞核。virE操纵子：诱导型，virE1、virE2基因。VirE2蛋白(60.5kD)是ssDNA结合蛋白，与T-链结合，参与T-链复合体形成，还具有核定位信号，引导T-链复合体进入植物细胞核。virF操纵子：诱导型，virF基因。VirF蛋白(23kD)参与T-链复合体的运输。virH操纵子：诱导型，virH1、virH2基因。VirH蛋白功能是降解植物伤口细胞产生的杀菌物质。,三、T-DNA转移至植物细胞的机理(农杆菌介导转化的机理)植物创伤反应与农杆菌对植物细胞的识别和附着；信号分子的释放积累与VirA蛋白的感应；VirG蛋白激

5、活与vir基因的诱导表达；T-链复合体的形成；T-链是指vir基因被诱导表达后加工T-DNA而产生的单链T-DNA。T-链复合体是指结合了VirD2、VirE2蛋白的T-链。T-链复合体的跨膜转运；通过T-链复合体运输器和T菌毛进入植物细胞。T-DNA整合到植物染色体上。,四、Ti质粒的改造与转化载体系统的构建 野生型Ti质粒不能直接作为植物转化载体：Ti质粒分子过大，没有单一的限制性内切酶位点，基因操作困难，不能直接将外源基因插入其T-DNA中；T-DNA区的onc基因产物将干扰受体植物内源激素的平衡，导致冠瘿瘤的产生，阻碍细胞的分化和植株的再生；现已通过中间载体途径构建许多植物转化载体系统

6、，主要有共整合载体系统、双元载体系统、隔端载体系统。1、共整合载体系统(cointegrate vector system)由卸甲Ti质粒载体、中间表达载体组成。例如：pGV3850、pLGVneo1103,Ampr,2、双元载体系统(binary vector system)由微型质粒、辅助 Ti质粒组成。例如：Bin19、pAL4404,双元载体系统比共整合载体系统更优越：插入外源基因的操作较简单；转化效率较高。,3、隔端载体系统 与共整合载体系统一样，由卸甲Ti质粒载体和中间表达载体通过同源重组共整合成转化载体，但与基因转移相关的T-DNA左右边界序列分别位于两个载体上。,共整合载体系统

7、和隔端载体系统统称为一元载体系统或顺式载体系统。双元载体系统也称为反式载体系统。,五、Ri质粒载体系统 发根农杆菌(Agrobacterium rhiizogenes)Ri质粒分为农杆碱型、甘露碱型、黄瓜碱型 Ri质粒的Vir区与Ti质粒的高度同源，T-DNA区的边界序列与Ti质粒的高度同源，只含有编码与生长素合成有关的酶(iaaM和iaaH)和与冠瘿碱合成有关的酶，不具细胞分裂素合成相关的基因。,第二节 目的基因的导入植物一、植物转化受体系统及其考虑因素 建立一个高效再生体系是植物遗传转化的关键。1、植物转化受体系统 植物转化受体系统是指用于植物遗传转化的再生体系或繁殖体系。,2、建立植物转

8、化受体系统的主要考虑因素 具有稳定的外植体来源；具有高效稳定的再生能力；具有较好的遗传稳定性；对选择性抗生素敏感。二、植物基因转移的方法1、农杆菌介导法 一般程序：制备工程农杆菌侵染液 农杆菌侵染外植体 共培养 筛选与分化培养 获得抗性植株 分子检测 转基因植株,1、工程农杆菌的制备 把构建好的中间载体导入到农杆菌的方法：三亲交配法 含有中间载体质粒的大肠杆菌、含有迁移质粒的大肠杆菌、含有Ti质粒的农杆菌 直接转化法 如电击法、液氮冷冻法。效率低，但简单、快速。2、农杆菌转化植物的操作方法 整株感染法 创伤整株感染法、非创伤整株感染法 优点：免去了组织培养过程，操作简单。外植体转化法 如：叶盘

9、转化法、子叶柄转化法、原生质体转化法,叶盘转化法,2、基因枪法(微弹轰击法、粒子轰击法)原理 利用火药爆炸、高压放电或高压气体作驱动力，将载有外源DNA的金粉(钨粉)等金属微粒加速射入受体细胞，从而将外源DNA分子导入细胞并实现转化。,基因枪的类型 火药爆炸基因枪(1987年 Sanfrod等)：污染、可控性低 高压气体基因枪(杜邦公司的PDS-1000HE型)：无污染、可控性较高 高压放电基因枪：无污染，可控性最高,操作步骤 a、受体细胞或组织的预处理；高渗(甘露醇、山梨醇)培养 b、DNA微弹的制备；钨粉微粒的直径一般为0.71um，金粉微粒的直径一般为11.6um。金粉对细胞的伤害、毒性

10、小，但较贵。c、受体材料的轰击；根据基因枪操作说明选择适当大小外植体、装配DNA微弹等。无菌操作 d、过渡培养与筛选培养 过渡培养：无选择、高渗培养，12周,3、花粉管通道法 花粉管通道法是利用植物受精过程中形成的花粉管通道将外源DNA导入植物的技术。1983年周光宇等提出并建立。原理 授粉一定时间后，将外源DNA加在柱头上，外源DNA能沿着花粉管通道渗入，经过珠心进入胚囊，转化尚不具备正常细胞壁的卵、合子或早期胚胎细胞。操作方法 a、柱头切除法；b、柱头涂抹法；c、花粉粒携带法。优点 操作简单、无需组织培养、避免了组培中无性变异带来的优良农艺性状丧失。但受植物花器、花期的限制。,4、聚乙二醇

11、法(PEG法)原理 PEG可通过改变细胞膜表面的电荷，引起细胞膜透性变化，并促进DNA与膜接触、粘连，同时Ca2+离子与DNA结合成DNA-磷酸钙复合物而沉积于原生质体的膜表面，从而促进外源大分子进入原生质体。优点 a、实验成本低廉，不需要特殊的仪器设备；b、受体植物不受种类的限制；c、嵌合体很少；d、结果比较稳定，重复性也较好；e、转化效率较高，可达10-3。,5、电击法 优点：操作简便、不需制备原生质体、转化效率较高、无受体限制。6、显微注射法 显微注射法是利用显微注射仪将外源DNA直接注入受体细胞而实现转化的方法。固定受体细胞的方法：琼脂糖包埋法、多聚-L-赖氨酸粘连法、吸管支持法。优点

12、：转化效率高、不受植物种类的限制 缺点：工作效率低、不能规模化转化、需要昂贵仪器,7、浸渍法(浸泡法)浸渍法是指将叶子、胚、胚珠、子房、花粉粒、幼穗、悬浮细胞甚至幼苗等直接浸泡在外源DNA溶液中，利用渗透作用把外源基因导入受体细胞并得到整合与表达的一种转化方法。优点：简单、快速、便宜、可规模化转化 缺点：转化频率低、重复性差8、其他转化方法：超声波导入法、激光微束法、碳化硅纤维法、脂质体介导法、病毒介导法、转座子介导法,常 用 植 物 转 化 方 法 比 较,第三节 外源基因的表达、检测与遗传特性一、转基因植物的外源基因表达及其调控 转基因沉默是指转入植物的外源基因不表达或表达水平很低的现象。

13、1、转基因沉默的原因及其克服措施 分为转录沉默、转录后沉默，或分为同源依赖性沉默、位置依赖性沉默。同源依赖性沉默是由于转基因出现多拷贝而发生转基因之间或转基因与内源基因之间相互作用而诱发的转基因沉默。位置依赖性转基因沉默是指由于转基因整合到宿主基因组的一定位置而引起的转基因失活。,DNA甲基化 常发生在外源基因的启动子区，是转录沉默或位置依赖性转基因沉默的直接诱因。导致外源基因失活的机制：a、甲基化序列与甲基化DNA结合蛋白结合，后者再与协同抑制蛋白mSin3A、组蛋白去乙酰酶等形成多蛋白抑制复合物，阻碍了转基因启动子与转录因子的接触，从而引起转录抑制。b、甲基化导致DNA构象转变为Z型，从而

14、降低转录水平，造成转基因失活。,多拷贝整合 重复诱导的转基因沉默是指外源基因多拷贝整合而引起转基因表达水平降低或失活的现象。顺式失活是指相互串联或紧密连锁的转基因间产生的失活。反式失活是指非同一染色体上转基因间引起的失活。导致外源基因失活的机制：a、转基因间异位配对，形成三链或四链结构，导致染色体异染色质化，阻碍了转录因子与转基因启动子的结合，从而使转录受到抑制；b、转基因mRNA的特异降解(空载tRNA触发机制、反义RNA触发机制)。,位置效应 a、外源基因整合在异染色质区和转录不活跃区域(占植物基因组90%)；b、外源基因整合在非等容线位点，被宿主的特定识别机制识别而被甲基化，导致转基因沉

15、默。后成修饰作用 后成修饰作用是指转基因的表达在个体发育的某一阶段受到细胞内因子的修饰作用而关闭。与内源基因竞争性结合某些转录、翻译因子 克服转基因沉默的措施：a、单拷贝插入；b、建立位点特异整合的转基因体系；c、采用非甲基化启动子；d、外源基因的密码子优化；e、将核基质结合区序列置于外源基因两侧，使其成为一个独立的表达结构；f、筛选稳定表达的转基因植株。,2、提高外源基因表达水平的策略 启动子的选择和改造；组成型启动子、组织特异性启动子、诱导型启动子 人工杂合启动子 利用增强子序列；利用真核基因的翻译调控序列；如：5端因子、kozak序列、3端poly(A)信号序列、内含子等 利用定位信号序

16、列；如：内质网定位信号 KDEL的编码序列 叶绿体转化。a、叶绿体DNA拷贝数多；b、具原核表达方式，可直接表达来自原核生物的基因；c、能以多顺反子的形式表达多个基因。,二、外源基因表达的检测 Northern杂交、RT-PCR、酶联免疫吸附分析(ELISA)、Western杂交、报告基因检测法。1、gus基因的检测 底物：5-溴-4-氯-3-吲哚-D葡萄糖苷酸酯(X-Gluc)组织化学法、分光光度法、荧光法2、NPT-II基因的检测 底物：-32PATP 凝胶原位检测法、点渍法、层析法3、荧光素酶基因的检测 底物：荧光素 荧光分光光度法、荧光显微镜法,4、胭脂碱和章鱼碱的检测 纸电泳分析法

17、菲醌(荧光染料)染色5、cat基因的检测 底物：乙酰CoA、氯霉素 分光光度计法6、pat基因的检测 PPT乙酰转移酶 底物：乙酰CoA、PPT 分光光度计法,三、外源基因的遗传特性1、外源基因的遗传稳定性 一旦外源基因整合，就随植物基因组而稳定遗传。但也会发生外源基因丢失。其原因是：转基因植株是嵌合体；减数分裂同源染色体对等交换；有丝分裂的同源重组和基因重排；外源基因整合在细胞器基因组中，在随后的细胞质分裂中丢失。2、外源基因的遗传规律 孟德尔式遗传 单拷贝整合 多拷贝整合,第四节 植物基因工程的应用一、植物基因工程在植物分子生物学研究中的应用1、转座子标签法 玉米的Ac/Ds、En/Spm

18、和金鱼草的Tam转座子系统,2、T-DNA标签法,3、反义RNA技术 反义RNA技术是指将某反义基因转入植物而抑制其相应内源基因表达的技术。原理：反义RNA与内源目标RNA互补结合形成稳定的双链，从而影响RNA加工和翻译，导致基因表达被抑制。转查尔酮合成酶反义基因的矮牵牛，开白色花。4、位点特异性重组技术 Cre/loxP 位点特异重组系统 应用：删除转基因植株的选择标记,基因敲除,转基因的活化,(与特异表达Cre酶的转基因植株杂交),二、改良植物品种 基因工程育种的优势：目的性强；育种周期短；打破物种界限，扩大育种基因资源库。1、抗虫转基因植物 Bt毒蛋白基因、蛋白酶抑制剂基因(豇豆胰蛋白酶

19、抑制剂)、淀粉酶抑制剂基因(菜豆淀粉酶抑制剂基因)、植物凝集素基因(雪莲花凝集素基因)、昆虫特异性神经毒素基因 防止或延缓害虫产生耐受性的方法：采用特异性的启动子，使目的基因在适当的时间和特定的组织进行表达；在同一植物中转入两种以上抗虫基因；在种植模式上控制昆虫的抗性。,2、抗病转基因植物 抗病毒病转基因植物 病毒外壳蛋白基因、病毒卫星RNA、病毒复制酶突变基因、病毒反义RNA基因 抗真菌病转基因植物 几丁质酶基因、葡聚糖酶基因、核糖体失活蛋白基因、PR基因、植物抗真菌蛋白基因 抗细菌病转基因植物 溶菌酶基因、抗菌肽基因、植物抗病基因(Xa21),3、抗除草剂转基因植物 抗除草剂基因工程的策略

20、：过量表达靶标酶或靶标蛋白质，使作物吸收除草剂后，仍能进行正常代谢作用；导入除草剂不敏感靶标酶或蛋白的突变基因；产生能修饰除草剂的酶，使除草剂降解或解毒。,4、抗逆境转基因植物 导入抗渗透胁迫相关基因 甘露醇、果聚糖、甜菜碱、海藻糖、脯氨酸等小分子的合成酶基因 导入抗冻蛋白基因 导入胚胎发育后期丰富蛋白(LEA)基因 LEA蛋白表面有丰富带电基团，可中和因脱水而增加的离子，因此，LEA蛋白的积累与植物抗旱性有关。导入氧化胁迫相关酶的基因 超氧化物歧化酶(SOD)基因、过氧化物酶基因,5、改良营养品质转基因植物 导入富含人体必需氨基酸蛋白质的基因 巴西豆2S清蛋白基因 导入淀粉合成相关酶的基因

21、ADP-葡萄糖焦磷酸化酶基因 导入脂肪酸合成相关酶的基因 月桂酰载体蛋白基因 导入提高维生素和矿物质含量的相关基因 转铁蛋白基因水稻 转植酸酶基因水稻(增加肠道吸收铁)转八羟番茄素合酶基因水稻(-胡萝卜素),6、转基因“工程三系”TA29-barnase-bar TA29-bastar7、改变花形花色的转基因植物 查尔酮合成酶基因(chs)玉米的二氢黄酮醇-4-还原酶基因矮牵牛橙色花 黄酮-3,5-羟化酶基因玫瑰兰色,三、转基因植物作为生物反应器 优点：安全、廉价、高效、规模化1、转基因植物生产疫苗 1990年Curtiss等人利用转基因烟草表达链球菌表面蛋白抗原A，用该转基因烟草饲喂小鼠，能

22、引起免疫反应。植物表达系统生产疫苗的特点：成本低廉；免疫活性高；安全性好；易于贮存和运输；使用方便。包括：稳定表达系统、暂态表达系统,2、转基因植物生产抗体 1989年Haiti获得分别表达抗体重链和轻链的转基因烟草植株，杂交后在杂种中获得了与抗原结合的抗体。迄今，不同类型的完整抗体如IgG1、IgM、IgA、Fab抗体、IgG1/IgA嵌合抗体、单链抗体(scFv)和单域抗体(VH)等基因都先后转入烟草、拟南芥、伞藻和大豆等作物中，并得到表达。3、转基因植物生产其他多肽类药物 1988年比利时PGS公司首次利用转基因烟草生产神经肽。,4、利用转基因植物生产糖类、脂类物质 将枯草杆菌果糖转移酶基因转入烟草和马铃薯，在转基因烟草中获得的果糖可达植物干重的38，转基因马铃薯叶中果糖含量达到了叶片干重的13，在块茎可达到17。将大肠杆菌的甘露醇-1-磷酸脱氢酶基因转入烟草，转基因植株中的甘露醇含量可达 6 mol/g鲜重，而且转基因植物的耐盐、耐旱能力也大大提高。Calgene公司已经用转基因油菜生产用于润滑剂和洗涤剂生产的12碳的脂肪酸以及润滑剂和尼龙生产的芥酸。5、利用转基因植物生产可降解生物塑料 聚-3-羟基链烷酸酯可用于制造可降解的生物塑料。目前主要是细菌发酵生产，成本很高，难以推广。,