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1、,基因工程,授课专业：生物技术 生物工程,推荐教材或参考书目,（1）教材 基因工程 孙明主编，高等教育出版社，2006.5 基因工程原理与应用 陈宏主编，中国农业出版社，2004.1（2）参考书目 基因操作原理（第6版）（中文版），Sandy B.Primrose等主编，瞿礼嘉等译，高等教育出版社，2003.12基因克隆和DNA分析（第4版）（中文版），T.A.Brown编著，魏 群等译，高等教育出版社，2003.8基因工程（第2版），吴乃虎主编，科学出版社，1999分子克隆实验指南（第3版），J萨姆布鲁克，DW拉塞尔著，黄培堂等译，科学出版社，2002,网络课程地址,教务处教学资源网网络课程

2、生命学院基因工程,教学学时分配（授课总学时：54）,各章名称 计划学时1基因工程概述 22分子克隆工具酶 5 3分子克隆载体 44人工染色体载体 45表达载体 46基因操作中大分子的分离和分析 27基因芯片技术 0 8PCR技术及其应用 4 9DNA序列分析 210DNA诱变 211DNA文库的构建和目的基因的筛选 3 12基因组研究技术 0,第一篇基因操作原理32,第二篇 基因工程应用（22学时）,各章名称 计划学时13植物基因工程 414动物基因工程 415酵母基因工程 216细菌基因工程 217病毒基因工程 218医药基因工程 219基因工程产品的安全及其管理 0专题讨论 6,专题讨论(

3、供参考）,基因操作中大分析的分离和分析PCR技术的应用基因组研究技术植物转基因技术基因诊断与基因治疗基因工程的安全性2-3人/小组，做好PPT,10周报告,课程目的,本门课程讲述基因操作相关的原理，为分子生物学的研究服务。通过分子生物学内在的原理，如 DNA 结构、复制、转录、表达、调控等，讲述研究方法和技术的设计原理。,结课方式 平时(课堂讨论、报告和考勤)30%考试（闭卷）70%,第1章 基因工程概述,1.1 基因操作与基因工程1.1.1 基因操作与基因工程的关系基因操作:对基因进行分离、分析、改造、检测、表达、重组和转移等操作的总称。基因工程:专指为实践应用而进行的基因重组事件，产生的基

4、因工程体可以用作生物反应器，或改变了生物性状的工程体等。Gene manipulation/Genetic engineering,基因工程（基因操作）：主要是利用 DNA 重组技术，将生物的某个基因或一个DNA片段通过基因载体（DNA载体）运送到另一生物的活性细胞中，然后经过克隆（clone）和行使正常功能（表达），从而创造生物新品种或新物种的遗传学分子技术（从细菌到高等生物）。,1.1.2 基因工程的诞生与发展,基因工程诞生的基础 理论上的三大发现和技术上的三大发明1971年，史密斯（Smith H.O.）等人从细菌中分离出的一种限制性酶,酶切病毒DNA分子，标志着DNA重组时代的开始。1

5、972年伯格（Berg P.）等用限制性酶分别酶切猿猴病毒和噬菌体DNA，将两种DNA分子用连接酶连接起来,得到新的DNA分子。1973年，科恩（Cohen S.）等进一步将酶切DNA分子与质DNA连接起来，并将重组质粒转入E.coli细胞中。1982年，美国食品卫生和医药管理局批准，用基因工程在细菌中生产人的胰岛素投放市场。1985年，转基因植物获得成功。1994年，延熟保鲜的转基因番茄商品生产。1996年，克隆羊诞生。,理论上的三大发现,（1）DNA是遗传物质 1944 Avery 细菌转化实验 证明：DNA是遗传物质 意义：DNA 可以从一个细菌转移到另一个细菌，从而把遗传性状传递过去。

6、现代生物学科学性的革命性开端和基因工程的先导（Lederberg语）。,理论上的三大发现,（2）DNA双螺旋模型（Watson/Crick 1953）这对于生命科学的发展作用可与达尔文学说媲美，与孟德尔定律齐名。,理论上的三大发现,（3）确定了遗传信息传递的方式（60年代）破译遗传密码和确定了密码子三联体 遗传信息流的中心法则,技术上的三大发明,（1）工具酶的使用：Smith 和 Wilcox（1970）流感嗜血杆菌Haemophilus influenzae d 分离纯化了 限制性内切酶Hind II 其它工具酶（如连接酶）等的发现和纯化奠定了基因工程诞生的最重要的技术基础 分子剪刀和DNA

7、缝合工具（2）基因运载工具DNA载体的使用(对质粒的认识）细菌的致育因子（Fertility factor）F因子 Lederberg 1946 抗药性因子（R）大肠杆菌素因子（Col）（3）逆转录酶的使用 Baltimomore 等和 Temin 等（1970）各自发现了逆转录酶意义：丰富了“中心法则”、真核基因的制备成为可能、构建 cDNA 文库成为可能。,全世界转基因植物种植面积,19962005年，全世界转基因植物在21个国家种植，面积从1996年的170万公顷增加到2005年的9 000万公顷，增加了50倍之多。,美国斯坦福大学生物化学系：Paul Berg教授(1980年诺贝尔化学

8、奖获得者),1970年美国科学家特明（）和巴尔的摩（D.Baltimore）分别于动物致癌RNA病毒中发现的，他们并因此获得1975年度诺贝尔生理学或医学奖。David L.Baltimore(born 7 March 1938)is an American biologist,university administrator,and Nobel laureate in Physiology or Medicine.,Martin Temin(December 10,1934 February 9,1994)was a U.S.geneticist.Along with Renato Dulb

9、ecco and David Baltimore he discovered reverse transcriptase in the 1970s at the University of Wisconsin-Madison,for which he shared the 1975 Nobel Prize in Physiology or Medicine.,图1-1 1973年Cohen和Boyer开展的基因重组示意图质粒pSC101和pSC102连接，转化大肠杆菌,抗Tet和抗Kan.蟾蜍DNA核糖体RNA片段+pSC101，转化大肠杆菌,1.2 基因因工程是生物科学发展的必然产物,1.2

10、.1 基因是基因重组的物质基础1.遗传因子由孟德尔提出，认为生物性状的遗传是由遗传因子所控制的。1909年，丹麦学者W.Johannsen提出“基因”（gene）一词,代替了孟德尔的遗传因子，认为在杂种中等位基因不融合，各自保持其独立性。2.DNA与遗传的关系 1928年Griffith首先发现了肺炎球菌的转化作用，为以后的研究开辟了道路。1944年Avery用转化实验证明了DNA是遗传物质。,1.2.2 DNA的结构和功能1.DNA的结构（1）DNA的组成成分 DNA是由五碳糖、磷酸基团和4种含氮的碱基（即腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和胞嘧啶）组成。（2）DNA的三维结构Watson和Crick

11、于1953年推导出DNA的结构是双链缠绕的双螺旋结构（图1-2）,DNA的复制1955年，Watson和Crick提出了DNA的复制模型，即每一条链都可以复制出各自的互补链。1957年，Meselson和Stahl的实验表明，在复制完成后DNA链与新合成的互补链重新形成双链结构，也就是说DNA的复制是采用半保留复制（semiconservative replication）的方式进行。,传递遗传信息基因可以控制蛋白质的产生，基因和蛋白质的氨基酸序列之间存在对应关系，基因突变会导致蛋白质中一个氨基酸的变化。RNA是DNA遗传信息和蛋白质氨基酸序列之间的桥梁。指导蛋白质合成DNA可编码3种RNA，

12、即mRNA、rRNA和tRNA。tRNA上的反密码子与mRNA上的密码子互补，并在蛋白质合成过程中携带氨基酸到正确的位置。转录是以DNA为模板，将遗传信息转移到mRNA的过程，翻译就是将mRNA中的遗传信息转移到蛋白质的氨基酸序列的过程。,中心法则,1.2.3 基因操作技术的发展促进基因工程的诞生和发展,基因工程的工具（1）基因操作的车间大肠杆菌Escherichia coli和病毒（2）获得基因片段的工具限制性核酸内切酶（3）连接基因片段的工具连接酶（4）基因操作的载体质粒和病毒 重组DNA实验 基因工程的核心,1.2.4 基因工程的内容,1.基因操作原理（1）DNA和RNA的操作（2）基因

13、克隆2.基因工程应用（1）生物反应器 微生物 动植物细胞 转基因动植物（2）遗传改良（3）基因治疗,1.3 基因的结构-基因操作的理论基础,1.3.1 基因的结构组成对基因操作的影响1基因及其产物的共线性基因决定蛋白质的序列组成，是由密码子对应特定氨基酸所决定的。当一个基因的核苷酸序列与其产物的氨基酸序列是一一对应时，则表明它们是共线性的。,2基因及其产物的非共线性20世纪70年代以来，在真核生物中发现了间断基因（interrupted gene），后来发现这种间断基因在真核生物中普遍存在，也就是后来所说的基因间存在着内含子（intron）。内含子指真核生物基因中不能翻译成蛋白质的DNA片段，

14、但可被转录，当两侧序列（外显子）的转录RNA被剪接在一起时，就将内含子转录的RNA从整个转录物中除去。外显子是指能够翻译成蛋白质的任一间断的基因片段，一个基因可有多个外显子。图1-3是遗传信息从DNA传到蛋白质的流程。,图1-3 真核生物蛋白质合成过程中外显子和内含子的关系,3基因的重叠与基因的可变性,DNA序列与蛋白质序列的对应关系不是单一的，单个DNA序列可编码一个以上的蛋白质，这些蛋白质在结构上有的是相同的序列重复，也可以是全新的蛋白质。由单个基因通过在不同部位的起始（或终止）表达而形成两种蛋白质，两个基因也可通过在不同读码中译读DNA而共用同一序列。基因的重叠与可变性也可从重组中得以体

15、现。例如芽胞杆菌的spo基因片段分布在两个不同区域，当需要发挥作用时，便通过重组而连接在一起。,4启动子和终止子,启动子是基因转录过程中控制起始的部位。RNA聚合酶的结合位点（binding site)，不同生物中这个结合（识别）位点是有差异的，同一生物的不同基因之间也有差异。上游（upstream）指转录起始点左侧的序列，而下游（downstream）指起始点右侧的序列。或上游指其5方向，下游指其3方向。转录终止子主要有两种，一种依赖因子，另一种不依赖因子。后者主要是能够形成特定二级结构的DNA序列，如茎环结构。,1.3.2 基因克隆的通用策略,克隆的概念是广泛的，但基因克隆在一定程度上被等

16、同于基因的分离克隆的简要步骤(见图1-4):外源DNA和载体的酶切、连接、转化和筛选构建基因文库 亚克隆（subcloning）：从克隆（或克隆文库）中寻找出目的基因的小片段的过程。,图1-4 原核生物基因克隆的步骤示意图,细菌基因工程流程,小结,思考题,1.简述基因操作、基因重组和基因工程的关系。2.为什么说基因工程是生物学和遗传学发展的必然产物？3.简述基因的结构组成对基因操作的影响。4.基因工程研究的意义和前景如何？,补充,基因概念的发展,基因是有功能的DNA片段 20世纪40年代和提出了一个基因一个酶的假说。1953年Watson和Crick提出了DNA双螺旋结构模型。1957年Cri

17、ck提出了中心法则。1961年提出了三联遗传密码。,基因概念的发展,操纵子模型 1961年F.Jacob和J.Monod通过不同的大肠杆菌乳糖代谢突变体的研究，提出了操纵子模型学说（operon theory）。生物活性相关基因组织在一起进行统一的调控，并保持各基因产物的精确比例。原核生物的操纵子模型系统是最经济的调控在转录水平上的体现。,基因概念的发展,“跳跃基因”和“断裂基因”的发现 20世纪50年代B.McClintock在玉米的控制因子的研究中发现某些遗传因子可以转移位置。后来将这些可转移位置的成分称为跳跃基因（jumping gene），亦称转座子（transposon elemen

18、t）。70年代后期发现绝大多数真核生物基因都是不连续的，其中被一些不编码序列所隔开，成为断裂基因。另外，在噬菌体中还发现了重叠基因。,1951 McClintock B.发现跳跃基因Barbara McClintock(June 16 1902 September 2 1992),the 1983 Nobel Laureate in Physiology or Medicine,断裂基因,断裂基因,真核基因结构,重叠基因,噬菌体x174的编码基因及其功能,什么是基因？,根据目前人们的认识，基因应该是能够表达和产生基因产物的DNA（RNA）序列。根据产物类别分为：Protein基因、RNA基因（tRNA基因和rRNA基因）两大类。根据产物功能分为：结构基因（酶和不直接影响其他基因表达的蛋白质）和调节基因（阻遏蛋白或转录激活因子）。概括起来基因就是一段含有特定遗传信息的核苷酸序列，是遗传物质的最小功能单位。,