土豆磷酸化酶的分离及直链淀粉的酶合成.ppt

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1、土豆磷酸化酶的分离及直链淀粉的酶合成,中南民族大学 药学院 化学生物学教研室,土豆磷酸化酶的分离及直链淀粉的酶合成,化学生物学实验,6学时,5.思考题,1.实验目的,2.实验目的,6学时,酶（土豆磷酸化酶）的分离,酶合成（直链淀粉）,酶活性测定,化学生物学实验,化学生物学实验,6学时,2.实验原理,2.1 土豆磷酸化酶的分离原理（硫酸铵分级沉淀法，盐析法的一种）,化学生物学实验,6学时,1.实验原理,2.2 直链淀粉的合成原理,化学生物学实验,6学时,1.实验原理,2.3 检验磷酸根的原理（酶活性测定原理）,无机磷酸根与钼盐的硫酸溶液可生成磷钼酸。磷钼酸可氧化metol（4-甲氨基酚硫酸盐），

2、而这一氧化反应会发生从黄到蓝的颜色变化。此时可测定溶液的吸光度变化。氧化反应后溶液中的磷酸根量可通过与校正曲线的对比进行测定。,+,颜色由黄变蓝,3.仪器与试剂（1）,仪器与试剂,化学生物学实验,6学时,2.5Kg土豆、削皮和切土豆用的一把刀、一个粉碎机、一台离心机和离心管（1L）、10g三（羟甲基）氨基甲烷（Tris）、一台可控温搅拌器、一个搅拌子和一个三角瓶（2L）、1Kg硫酸铵、水和一台天平,土豆磷酸化酶分离所需,1.1g葡萄糖-1-磷酸酯二钾盐二水合物，7mg麦芽七糖、3g枸橼酸氢二钠倍半水合物、3g枸橼酸三钠二水合物、一个pH计、适于冷冻和加热到100和离心1mL水溶液的离心管，一支

3、移液器（1mL）、一个存储液氮的杜瓦瓶、一个加热快（100）、一台离心机、1mol/L三乙醇胺缓冲液、100mL水、20mL的2.5mol/L硫酸、20mL5%钼酸铵水溶液、0.2g硫酸对甲氨基酚、0.54g亚硫酸氢钠和一台UV光谱仪并带有适当的比色杯,直链淀粉合成和比色法测定所需,3.仪器与试剂（2）,0.54g亚硫酸氢钠,20mL的5mol/L硫酸,20mL的5%钼酸铵水溶液,磷酸盐试剂（用于磷酸根浓度的比色测定）,6学时,化学生物学实验,含有0.2g对氨基酚硫酸盐的100mL水溶液,混合物至少搅拌30min,4.实验步骤,用于酶法合成的沉淀,沉淀,土豆泥,土豆,4.1 分离纯化土豆磷酸化

4、酶的步骤,1.粉碎2.打成匀浆,1.加硫酸铵2.离心,1.溶于水2.加硫酸铵（350g/L),化学生物学实验,6学时,1.离心2.调pH至7.03.55搅拌40min4.加硫酸铵（100g/L)5.离心,4.实验步骤,STEP 1,STEP 2,STEP 3,STEP 4,将2.5Kg土豆去皮，切成小块在粉碎机中打成匀浆。匀浆在5000r/min离心30min，将上清液用Tris缓冲液调至7.0，并在55摄氏度加热40min,将上述混合物冷却至室温，按每升液体加入100g固体硫酸铵,搅拌30min并在5000r/min离心后，再按每升液体250g硫酸铵加入上清液中。,搅拌30min，离心，并收

5、集沉淀置于500mL蒸馏水中，并向其中加入175g硫酸铵。搅拌30min，离心（10000r/min，30min）分出酶,化学生物学实验,6学时,4.1 分离纯化土豆磷酸化酶的步骤,4.实验步骤,进行反应,生成产物,产物检测,葡萄糖-1-磷酸酯+引物,直链淀粉+Pi,比色法测定,化学生物学实验,6学时,P.PH,4.2 直链淀粉的合成及比色测定,从葡萄糖-1-磷酸酯酶法合成直链淀粉的反应图示,4.实验步骤,2.将1.1g（2.9mmol）葡萄糖-1-磷酸酯二钾盐水合物和7mg麦芽七糖溶于50mL上述枸橼酸钠缓冲液，并加热至45。,3.将300mg酶溶于上述2mL枸橼酸钠缓冲液中，加入其中后，每30min从反应混合物中取1mL并立即冷冻保存于液氮中。刚加入酶后即采第一个样品。整个测定过程需要5-6个样品。,4.样品100加热10min后离心，取100L上清液加入2.9mL的1mol/L三乙醇胺缓冲液中，向其中加入7mL的磷酸盐试剂。15min后于578nm测定吸光度。,1.将0.1mol/L枸橼酸氢二钠与0.1mol/L枸橼酸三钠溶液混合，得一pH6.0缓冲液。,使用同一比色杯测定！,6学时,化学生物学实验,5.思考题,1,3,2,简述硫酸铵分级沉淀法纯化土豆磷酸化酶的原理,检验磷酸根的原理,直链淀粉的酶合成原理,中南民族大学 药学院化学生物学教研室,Thank You!,