土壤中分解尿素的细菌的分离和计数-上课用.ppt

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1、课题2土壤中分解尿素的细菌的分离和计数,课题2 微生物的培养与应用,一、课题背景,1、尿素的利用,尿素是一种重要的农业氮肥。尿素不能直接被农作物吸收。土壤中的细菌将尿素分解成氨之后才能被植物利用。,2、细菌利用尿素的原因,土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成脲酶,3、常见的分解尿素的微生物,芽孢杆菌、小球菌、假单胞杆菌、克氏杆菌、棒状杆菌、梭状芽孢杆菌，某些真菌和放线菌也能分解尿素。,4、课题目的,从土壤中分离出能够分解尿素的细菌,统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌,一.研究思路,.筛选菌株,.统计菌落数目,.设置对照,1、实例：,启示：寻找目的菌种时要根据它对生存环境的要求，到相应的环

2、境中去寻找。,问：如果请你寻找这种耐高温的酶，你会去哪里寻找？,DNA多聚酶链式反应（PCR）是一种在体外将少量DNA大量复制的技术，此项技术要求使用耐高温的DNA聚合酶（930C）。,.筛选菌株,问：为什么Taq细菌能从热泉中被筛选出来？,水生耐热细菌Taq：美国科学家布鲁克于1966年在美国黄石国家公园的一个热泉中发现，并分离出耐高温的TaqDNA聚合酶。,原因：因为热泉温度70800C，高温淘汰了绝大多数微生物（不耐热），只有Taq细菌被筛选出来。,【研究思路】,（一）筛选菌株,原理：,人为提供有利于目的菌株生长的条件（包括营养、温度、PH等），同时抑制或阻止其他微生物生长。,有选择作用

3、,要分离一种微生物，必须根据该微生物的特点，包括营养、生理、生长条件等；配置合适的培养基方法：抑制大多数微生物生长 造成有利于该菌生长的环境，结果：培养一定时间后，该菌数量上升，再通过稀释涂布平板法等方法对它进行纯化培养分离。,2、实验室中微生物的筛选原理：,3、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培养基：,从物理性质看此培养基属于哪类？从功能上属于哪类培养基？,固体培养基,在此培养基中哪些作为碳源、氮源？,碳源：葡萄糖、尿素 氮源：尿素,选择培养基,培养基的氮源为尿素，只有能合成脲酶的微生物才能利用尿素作为氮源而生存。缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生长发育繁殖，而受到抑制，

4、所以用此培养基就能够选择出分解尿素的微生物。,4、该培养基如何将分解尿素的细菌选择出来？,选择培养基：在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。,分离尿素细菌,用以判断选择性培养基是否具有选择性,对设计实验的训练,对照组牛肉膏蛋白胨培养基,实验组以尿素为氮源的培养基,【统计菌落数目】,常用方法：稀释涂布平板法、显微镜直接计数法，还可以用过滤膜法,1、稀释涂布平板法（也叫活菌计数法）,（1）原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。1个菌落=1个活菌,稀

5、释涂布平板法。,（2）操作方法：稀释涂布平板 统计菌落数。,（3）统计原则、选 30300 个菌落的平板统计。、每个稀释度取3个平板取其平均值。（4）统计结果：统计的菌落数往往比活菌的实际数目低，因此统计结果一般用菌落数来表示。,没有设置重复组，因此结果不具说服力。,1个平板的计数结果与另2个相差太远，说明在操作过程中可能出现了错误。,不能简单地将3个平板的计数值用来求平均值。,在设计实验时，一定要涂布至少3个平板，作为重复组，才能增强实验的说服力与准确性。在分析实验结果时，一定要考虑所设置的重复组的结果是否一致，结果不一致，意味着操作有误，需要重新实验。,统计菌落数目 P22,注意事项为了保

6、证结果准确，一般选择菌落数在30300的平板上进行计数。为使结果接近真实值可将同一稀释度加到三个或三个以上的平皿中，经涂布，培养计算出菌落平均数。统计的菌落往往比活菌的实际数目低。涂布平板法所选择的稀释度很重要，一般以三个稀释度中的第二个稀释度所出现的平均菌落数在50个左右为最好。,（三）设置对照,在做本课题的实验时，A 同学从对应106倍稀释的培养基中筛选出大约150个菌落。但是，其他同学在同样的稀释度下只选择出大约50个菌落。其他同学认为A同学的结果有问题。他们分析可能是A同学的培养基被杂菌污染了，或者培养基中混入了其他含氮物质，因而导致不能分解尿素的细菌也能在该培养基上生长。但是，A同学

7、确信自己的实验操作准确无误，与其他同学的结果之所以不相同，是因为自己所选用的土壤样品不同。但是，A同学在设计实验的时候并没有设置对照，因而此时也拿了不出令人信服的证据。你能通过设置对照，帮助A同学学排除上述两个可能影响实验结果的因素吗？,设置对照的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。,.设置对照：,设置对照的方法：,空白对照：不给对照组任何处理因素。,条件对照：给对照组施以部分实验因素，但不是所要研究的 处理因素。,自身对照：对照组和实验组都在同一研究对象上进行。,相互对照：不单设对照组，而是几个实验组相互对照。,A同学的结果与其他同学不同，可能的解释有两种

8、。,一是由于土样不同；,二是由于培养基污染或操作失误。,小结：通过这个事例可以看出，实验结果要有说服力，对照的设置是必不可少的。,方案一：由其他同学用与A同学相同土样进行实验,方案二：将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。,结果预测：如果结果与A同学一致，则证明A无误；如果结果不同，则证明A同学存在操作失误或培养基的配制有问题。,二.实验的具体操作.土壤取样 从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌。.制备培养基：制备以尿素为唯一氮源的选择培养基。,

9、应在火焰旁称取土壤10g。在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行,分离不同的微生物采用不同的稀释度 原因：不同微生物在土壤中含量不同 目的：保证获得菌落数在30300之间、适于计数的平板,三样品的稀释,（二）土壤稀释,二、实验设计,.取样涂布,如果得到了2个或2个以上菌落数目在30300的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如果同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试验不精确，需要重新实验。,.微生物的培养与观察,在菌落计数时，每隔24h统计一次菌落数目。选取菌落数目稳定时的记录作为结果，以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。,培养不同微生物往往需要不同培养温

10、度。细菌：3037培养12d放线菌：2528培养57d霉菌：2528的温度下培养34d。,微生物的培养与观察,三.结果分析与评价1.通过对照实验，若培养物有杂菌污染，菌落数偏高；若培养物混入其他氮源，则菌落形态多样，菌落数偏高，难以选择出分解尿素的微生物。2.提示：选择每个平板上长有30300个菌落的稀释倍计算每克样品的菌数最合适。同一稀释倍数的三个重复的菌落数不能相差悬殊，如相差较大，表示实验不精确。,大小、形状（圆形，假根状，不规则状）表面特征（光滑，皱缩，颗粒状，龟裂状，同心圆状）隆起形状（扩展，台状，凹面，凸面，乳头状）边缘情况（整齐，波状，裂叶状，锯齿状）表面光泽（无光泽，金属光泽，

11、闪光）质地（油脂状，膜状，粘脆）颜色、透明度,四、操作提示,无菌操作,做好标记,规划时间,五.课外延伸 在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂。培养某种细菌后，如果PH升高，指示剂将变红，说明该细菌能够分解尿素。,测定饮水中大肠杆菌数量的方法是将一定体积的水用细菌过滤器过滤后，将滤膜放到 伊红美蓝 培养基上培养，大肠杆菌菌落呈现深紫色，并且有金属光泽，通过记述得出水样中大肠杆菌的数量。,大肠杆菌呈 黑色中心,有或无金属光泽,大肠杆菌在伊红美蓝琼脂(EMB)上典型特征,本课题知识小结:,六、例题解析,例1对细菌群体生长规律测定的正确的表述是 A在液体培养基上进行 B至少接种一种细菌 C接种一

12、个细菌 D及时补充消耗的营养物质,解析：细菌群体生长规律的测定是人们在一定条件下进行的。这些条件是：一种细菌、恒定容积的培养基，液体培养基、定时测定细菌总数。在这些条件下，才能测定出细菌的生长规律。测定时只能用一种细菌的子细胞群体的变化规律表达微生物的生长；恒定容积是给微生物提供一定的生存环境；液体培养基才能通过样品推测细菌总数。若接种多种细菌，则会发生种间斗争而不能测定一种微生物的生长规律。在接种时，要保证一定的接种量。,答案：A,例2在微生物群体生长规律的测定中，种内斗争最显著最激烈的时期是A调整期 B对数期 C稳定期 D衰亡期,解析：种内斗争是一种生态因素。种内斗争反应了种内生物对生存空

13、间和生活资源的争夺。在生活空间充裕，营养充足的时候，种内斗争的程度是比较低的。随着微生物个体数目的增加，每个个体的生存空间越来越少，营养物质也越来越少，每个个体对生存空间和资源的争夺也越来越激烈，种内斗争就越来越激烈。由此可知，在稳定期的种内斗争最激烈。在衰亡期，微生物的数目已经开始减少，pH已经极度不适于微生物的生存，次级代谢产物积累到很高的程度，这时的微生物的生存斗争主要是与无机环境的斗争。,答案：C,1.对细菌群体生长规律测定的正确的表述是（）A.在液体培养基上进行 B.至少接种一种细菌 C.接种一个细菌 D.及时补充消耗的营养物质 2.使用选择培养基的目的是（）A.培养细菌 B.培养真

14、菌 C.使需要的微生物大量繁殖 D.表现某微生物的特定性状与其他微生物加以区别3.能合成脲酶的微生物所需要的碳源和氮源分别是()A.CO2和N2 B.葡萄糖和NH3 C.CO2和尿素 D.葡萄糖和尿素,实践训练,A,C,D,4.下列说法不正确的是（）A.科学家从7080度热泉中分离到耐高温的TaqDNA聚合酶 B.统计某一稀释度的5个平板的菌落数依次为M1、M2、M3、M4、M5，以M3作为该样品菌落数的估计值 C.设置对照实验的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度 D.同其他生物环境相比，土壤中的微生物数量最大，种类最多。5.为培养和分离出酵母菌并淘汰杂菌，

15、常在培养基中加入（）A.较多的氮源物质 B.较多的碳源物质 C.青霉素类药物 D.高浓度食盐,B,C,例3（2005年江苏）抗生素作为治疗细菌感染的药物，其高效性和巨大的经济价值使抗生素工业经久不衰。其中青霉素的发现和应用具有划时代的意义。青霉素发酵产生青霉素。青霉菌的新陈代谢类型是，青霉素是青霉菌的 代谢产物。在生产和科研中，常选用处于 期的青霉菌作为菌种或研究材料，因为此时的青霉菌代谢旺盛，和 比较稳定。对青霉菌菌体生长情况的测定：取一定体积的发酵液，经离心分离、反复洗涤后，再计算发酵罐中菌体的总重量。,异养需氧型,次级,对数,个体的形态,生理特性,称菌体的湿重（称烘干后的重量）,下课了,