双缩脲法测定蛋白质的浓度.ppt

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实验五 双缩脲法测定蛋白质的浓度,一、实验原理具有两个或两个以上肽键的化合物皆有双缩脲反应。蛋白质在碱性溶液中可与CU2+形成紫色化合物，在一定浓度的范围内，蛋白质浓度与生成的紫色化合物颜色的深浅成正比，可用比色法测定。,尿素被加热，则两分子的尿素放出一分子氨而形成双缩脲。双缩脲在碱性环境中，能与硫酸铜结合成紫色的化合物，此反应称为双缩脲反应。,双缩脲反应,蛋白质分子中含有肽键与缩脲结构相似，故也能进行此反应。双缩脲反应可作为蛋白质定量测定的依据。,二、实验仪器1、试管2、吸管3、7200分光光度计,三、实验试剂1、2mg/ml牛血清白蛋白液：将1g牛血清白蛋白溶于0.9%NaCl溶液并稀释至1000ml.2、双缩脲试剂：将1.75gCuSO4.5H2O溶于约150ml蒸馏水，然后置于1000ml容量瓶中，加入300ml浓氨水、300ml冰冷的蒸馏水和200ml饱和氢氧化钠溶液，摇匀，室温放置2小时，再加蒸馏水至刻度，摇匀备用。,四、实验步骤1、标准曲线的绘制：取7支干燥的试管，按下表加入试剂：将上述溶液混合后，试管中即有紫红色出现，在540nm下测的各管的吸光度，以蛋白质浓度为横坐标，OD值为纵坐标作出标准曲线。2、样液的测定取未知浓度的蛋白质溶液3.0ml置试管中，加入双缩脲试剂2.0ml，混匀，测其540nm的吸光度，对照标准曲线求得未知液蛋白质浓度。,