双向电泳实验步骤.ppt

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1、双向电泳,辉骏生物：http:/免费服务热线：400-699-1663,双向电泳,一、双向电泳原理二、双向电泳样本制备三、第一向电泳IEF电泳四、胶条平衡五、第二向电泳SDS-PAGE六、双向电泳凝胶染色七、双向电泳图片分析,辉骏生物：http:/免费服务热线：400-699-1663,双向电泳,辉骏生物：http:/免费服务热线：400-699-1663,一、双向电泳原理,双向电泳(Two-dimensional electrophoresis)的基本原理是基于蛋白质的等电点（pI)和分子量(Mr)不同而分离蛋白质：第一向电泳等电聚焦（Isoelectric Focusing，IEF）根据蛋

2、白质的等电点不同将蛋白质分离，第二向电泳十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis,SDSPAGE）利用蛋白质的分子量大小不同将蛋白质分离。双向电泳一次可以从细胞、组织或其它生物样本中分离上千种蛋白质，凝胶上的斑点都对应着样品中的蛋白质，且各种蛋白质的等电点，分子量和含量的信息都能通过质谱鉴定和软件分析获得。因此其在蛋白质组分析、疾病标志物检测、细胞差异分析、药物开发、癌症研究等领域都得到了广泛的应用。,辉骏生物：http:/免费服务热线：400-699-1663,1:蛋白质制备主要目的：

3、(1)：细胞，组织的破碎裂解(2)：蛋白质溶解以及破坏蛋白质与蛋白质分子之间，蛋白质与 非蛋白质之间的共价与非共价相互作用,2:蛋白质制备主要遵循的原则：(1)：尽可能溶解全部蛋白质，打断蛋白质之间的共价结合，使 蛋白质以分离的多肽形式存在。(2)：避免蛋白质的修饰作用与蛋白质的降解作用。(3)：避免脂类、核酸、盐等物质的干扰作用。(4):去除高丰度蛋白对低分度蛋白的掩盖作用。(5):防止样品在聚焦时发生蛋白质的聚集和沉淀。(6)：蛋白质样品与第一向电泳的相容性。,二、双向电泳样本制备,辉骏生物：http:/免费服务热线：400-699-1663,二、双向电泳样本制备动物样本,（1）将组织切细

4、后置于研钵中，迅速加入液氮进行研磨，直至组织变成粉末，均匀而没有明显颗粒即可。（2）在研钵中加入800LB（使用前加入1 PMSF），充分溶解（收集）粉末后转移至1.5mLEP管中，4，12000r/min，离心20min，收集上清液。（3）超声处理，破碎核酸。每个EP管超声3次，每次58下，然后进行离心，4，12000r/min，离心20min，收集上清液。（4）将上清液分装成3管，每管约250L，每管再加入1mL丙酮-20沉淀过夜。沉淀完的蛋白质于4，12000r/min，离心20min，倒去上清液后，平放于干净的纸巾上自然干燥，即可得到处理后的蛋白质团块，-80保存备用。(5)在干燥后的

5、蛋白质团块中加入相应量的RB（具体加入量视蛋白团块大小而定），用枪头将蛋白质团块戳小后反复吹打直至蛋白质完全溶解。对于太过干燥的蛋白质团块（呈透明状），可用50L移液器调至10L刻度处，吸上一点RB封住枪头，然后反复的将蛋白质团块戳小，再用超声仪处理，直至看不到明显的蛋白质团块为止。4，12000r/min，离心20min，吸出上清液，转移至新的EP管中。,辉骏生物：http:/免费服务热线：400-699-1663,二、双向电泳样本制备植物样本,（1）植物样本置于研钵中，迅速加入液氮进行研磨，直至组织变成粉末，均匀而没有明显颗粒即可，在研钵中加入一小勺PVPP（用于吸附植物组织破碎后释放出的

6、酚类物质），用药勺将粉末转移至50mL离心管中。（2）在50mL离心管中加入8mL提取液混匀，再加入8mLTris饱和酚，充分振荡后放置于冰上，每隔5min振荡一次，总共6次，45000r/min，离30min，此时溶液会分层，下层为水相，上层为酚相，吸出上层液体，转移到15mL离心管中。（3）加入与酚相同体积的提取液，充分振荡后放置于冰上，每隔5min振荡一次，总共6次，4，5000r/min，离心30min，吸出上层酚相，转移至新的15mL离心管中。重复一次苯酚抽提。（4）加入最后得到的酚的5倍体积的醋酸铵甲醇溶液对蛋白进行沉淀，充分振荡后置于冰上保温每隔5min振荡一次，总共6次，于-2

7、0沉淀过夜。（5）对沉淀过夜的蛋白质4，5000r/min，离心30min，倒掉上清液，加入5mL甲醇对蛋白进行洗涤，反复吹打均匀后，4，5000r/min，离心30min。重复一次。,辉骏生物：http:/免费服务热线：400-699-1663,（6）加入4mL丙酮对蛋白进行洗涤，反复吹打均匀后，4，5000r/min，离心30min。重复一次操作。加入3mL丙酮，吹打均匀后将蛋白质平均分到3支1.5mLEP管中，4，12000r/min，离心20min。倒去上清液后，平放于干净的纸巾上自然干燥，即可得到处理后的蛋白质团块，-80保存备用。(7)在干燥后的蛋白质团块中加入相应量的RB（具体加

8、入量视蛋白团块大小而定），用枪头将蛋白质团块戳小后反复吹打直至蛋白质完全溶解。对于太过干燥的蛋白质团块（呈透明状），可用50L移液器调至10L刻度处，吸上一点RB封住枪头，然后反复的将蛋白质团块戳小，再用超声仪处理，直至看不到明显的蛋白质团块为止。4，12000r/min，离心20min，吸出上清液，转移至新的EP管中。,二、双向电泳样本制备植物样本,rehydration buffer stock(RB),辉骏生物：http:/免费服务热线：400-699-1663,Alklysis buffer(LB),Phenol extraction buffer,醋酸铵甲醇溶液Ammonium ac

9、etate in methanol,用甲醇配制0.1M的醋酸铵,二、双向电泳样本制备,辉骏生物：http:/免费服务热线：400-699-1663,三、第一项电泳IEF电泳,1：蛋白质定量,根据定量所得的数据吸取相应量的蛋白质，分析胶的一般上样量为银染120g，考染600g，质谱胶的一般上样量为银染200g，考染1200g。将所有样品稀释成5g/L。2：每根胶条的上样液的成分为：相应量的蛋白质、1%DTT、1%IPG Buffer、1溴酚蓝、RB调制最终体积至460L。将样品溶液混合均匀后，4 12000r/min，离心20min，吸取上清液450L进行泡胀。3：取出水化盘，在底下铺上白色纸巾

10、（方便观察胶条泡胀情况），调节水平备用。从冰箱取出干胶条复温（如不复温胶条会吸潮）。吸取离心后的样品上清液加到水化盘的槽中，450L样液可分3枪加入，第一二枪每枪吸160L，从槽顶端开始，沿左右边缘加入，将样液加成一条细线，长约22cm，第三枪吸至管中样液剩余20L左右即可，加至槽的顶端，将顶端部分覆盖满。调节室内温度为20，让胶条泡胀过夜（1012h），4：等点聚焦（IEF),等电聚焦程序为：S1 stp 300V 20min,S2 stp 700V 30min,S3 stp 1500V 1.3h,S4 grd 9900V 3h,S5 stp 9990V 5.3Hr,S6 stp 600V

11、20h5：跑完等电聚焦以后，取出胶条，吸干表面的覆盖油，胶面朝上将胶条放入平衡管中，胶条应置于-20保存。如果需要运输，则要用冰完全包埋平衡管保温。,辉骏生物：http:/免费服务热线：400-699-1663,四、胶条平衡,1：作用 DDT与IAA联合使用，还原蛋白质的巯基，SDS使蛋白质带上负电荷以利于第二向SDS-PAGE电泳。2：实验步骤（1）：取出放置有胶条的平衡管，每管加入10mL左右去离子水洗掉胶条表面的覆盖油，去掉去离子水。（2）：SDS平衡液加入100mM DTT混匀后，每支平衡管加入8mL平衡液进行平衡15min，去掉平衡液。（3）：SDS平衡液加入250mM IAA混匀后

12、，每支平衡管加入8mL平衡液进行平衡15min，去掉平衡液。（4）SDS 平衡液：50mM Tris-HCl(pH8.8)，6M Urea(FW 60.06)，30%(v/v)Glycerol(87%v/v)，2%(w/v)SDS(FW 288.38)，0.002%(w/v)Bromophenol blue。注：在进行IPG胶条平衡前，第二向凝胶必须准备好,辉骏生物：http:/免费服务热线：400-699-1663,五、第二向电泳SDS-PAGE电泳,1、根据实验分离片段大小选择不同浓度的PAGE胶：,2、配制12.5%SDS-PAGE凝胶：,五、第二向电泳SDS-PAGE电泳,30%T,2

13、.6%C Monomer stock solution：,4 Resolving gel buffer：,10%SDS：,辉骏生物：http:/免费服务热线：400-699-1663,五、第二向电泳SDS-PAGE电泳,3、灌胶：灌胶时使胶液沿着灌胶口斜面的厚塑料垫板流下，动作均匀，灌至液面到灌胶口平为止。迅速在胶面上加入水饱和正丁醇压平液面，加入时使枪头贴着玻璃长板缓慢划动均匀加入，当所有玻璃板加完2mL后，在玻璃板和灌胶器的缝隙处也各加入2mL使内外液面相平，然后再加正丁醇至没过短板为止。蒙上保鲜膜过夜。,辉骏生物：http:/免费服务热线：400-699-1663,4:电泳（1）用1x电

14、泳缓冲液配制1%的低熔点琼脂糖45mL，1%的普通琼脂糖80mL，加入溴酚蓝溶液至1X后放于泡沫盒中备用，吸取低熔琼脂糖封住SDS-PAGE整个胶面。迅速从平衡管中取出胶条，在装上槽液的量筒中稍微涮洗一下，将胶条放入玻璃板中，酸性端朝左放置，用尺子把胶条压到二向胶胶面处，使胶条下端紧密接触二向胶胶面，注意不要让胶条下端困住气泡。（2）依次放好胶条后将玻璃板装入下槽中，装玻璃板时可倾斜放入，避免玻璃板下端产生气泡。装好玻璃板后装上槽，然后在槽与玻璃板的缝隙处加入1%普通琼脂糖封住缝隙防止垂直方向上漏电。在上槽中轻轻地加入上槽液（2 x 电泳缓冲液）至最大刻度处，用上槽液稀释一倍配置成下槽液（1

15、x 电泳缓冲液），加入到下槽中直到上下槽液面相平，盖上盖子，接上电极后开始电泳。电泳条件为，2W/gel 45min后改为17W/gel继续电泳，当BPB跑出二向胶以后可停止电泳。10 SDS 电泳缓冲液，1%SDS，250mM Tris-base，1.92M Glycine。300 X 溴酚蓝储存液，1%溴酚蓝，50mM Tris-base。,五、第二向电泳SDS-PAGE电泳,辉骏生物：http:/免费服务热线：400-699-1663,六、染色,1、考染：（1）电泳结束后，用塑料尺子将玻璃板翘开，轻轻取下胶条，拨走胶面的琼脂糖，并用塑料尺子在胶面的酸性端切一个小角。用去离子水冲洗玻璃板下

16、表面和胶面，并将挤瓶头伸至胶下冲洗，使胶稍微脱离玻璃板，将玻璃板反扣到染色盘上，让胶依靠重力慢慢脱离玻璃板落入染色盘中。（2).染色：固定 40%MeOH+10%HAc 30min-over night。漂洗 H2O 15min X 4次。染色 室温摇荡过夜 终止 H2O漂洗至背景清楚。（3）.染色液：（0.12%G-250,10%100mlH3PO4,10%（NH4）2SO4,20%MeOH)。,辉骏生物：http:/免费服务热线：400-699-1663,六、染色,2、银染：,注：为了与质谱鉴定相兼容，敏化步骤不加戊二醛，银染步骤也不加入甲醛。,辉骏生物：http:/免费服务热线：400-699-1663,七、图片分析,目前常用于常规双向电泳图片分析软件：（1）IamgeMaster(GE)（2）PDQuest(Bio-Rad),辉骏生物：http:/免费服务热线：400-699-1663,辉骏生物：http:/免费服务热线：400-699-1663,THANKS!,