分子流行病学的研.ppt

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1、分子流行病学的研究进展及临床应用,概述,定义分子流行病学研究进展分子流行病学在医院感染控制中的应用,分子流行病学定义,分子流行病学是应用先进的实验技术测量生物学标志，结合流行病学现场研究方法，从分子水平阐明疾病的病因及其相关的致病过程。,传统流行病学,应用血清学方法对血清中各种成分（抗原、抗体、代谢产物、生化物质等）的出现和分布进行研究，阐明疾病及健康状态在人群中的分布及其影响因素，并在采取预防控制措施后应用血清学方法来考核其效果。,传统流行病学 暴露 疾病 揭示“黑匣子”秘密分子流行病学,传染性疾病 耐药性质粒、病原体变异、新传染病慢性非传染病 证实疾病的病因 多病因、多阶段、多基因、长潜隐

2、期 人群易感性-研究个体的发病差异 生物个体间的遗传和环境不同，易感性差异很大，传统流行病学无法有效测量,分子流行病学的产生,分子生物学的快速发展理论突破 断裂基因，操纵子模型，限制性内切酶，DNA聚合酶等技术创新 凝胶电泳技术、核酸体外扩增、DNA测序、蛋白质测序、分子杂交等,分子流行病学的发展轨迹,1972年Kilbone博士美国传染病学会第10次年会上首次提出1982年Perera提出“癌症分子流行病学”1993年美国人Schulte出版了世界上第一本分子流行病学专著，即“分子流行病学”应用分子标志物或生物学测量研究致病因子与所致疾病之间的联系。A 研究方法拓展B 研究范围拓宽,分子流行

3、病学和传统流行病学的关系,分子流行病学与医院感染控制-细菌同源性分析研究在感控中的应用,手术伤口感染！院内感染？导管相关性血流感染！呼吸机相关性肺炎！,证据,医院感染,医院感染是当前医疗卫生的重大问题之一，由于院内感染密切关系到医疗服务质量，关系到病人的预后、病死率、住院时间、床位周转率以及病人和国家的巨额经济损失等。因而，院内感染的控制问题已列为国家乃至世界各国医院管理的重要内容。,医院感染的常规检测项目,医院感染病例监测医院环境卫生学监测消毒灭菌效果监测,医院感染爆发定义,指在医疗机构或某科室的患者中短时间内发生3例以上同种同源感染病例的现象 同一种病原体，药敏一致,院内感染控制,院内感染

4、的研究中，一个很重要的问题，就是如何确定感染源和传播途径，只有明确病原菌的感染方式，才能采取有效的预防和控制措施。,临床微生物实验室 基础微生物检验学 分子流行病学 方法 院内感染控制 目的 临床诊断 基础,16,分子分型（分子流行病学研究）,从核酸分子水平上分析医院感染的发生、发展规律及机理，更加准确有效地进行医院感染管理控制，已成为当前国际医院感染管理研究中的重要方向。,从患者分离株到病区周围环境株的比较分析；从外源性感染到内源性感染从某一医院的医院感染暴发到大范围甚至世界范围的感染菌株流行变迁；,基因多态性分析技术已成为医院感染监测控制的高水平研究领域。,微生物室在医院感染中的作用,鉴定

5、特殊耐药菌的检出流行病学分型 PFGE 脉冲场凝胶电泳 RAPD 随机扩增DNA多态性,18,消化、释放出DNA,PFGE原理,19,Enzyme,酶切,PFGE原理,约520个、长度10800kb的大片段DNA,20,脉冲场凝胶电泳(PFGE),制备琼脂糖栓块,消 化,酶 切,脉冲电泳,结果解释,PFGE原理,电场不断在两种方向（有一定夹角，而不是相反的两个方向）变动。DNA分子带有负电荷，会朝正极移动。相对较小的分子在电场转换后可以较快转变移动方向，而较大的分子在凝胶中转向较为困难。因此小分子向前移动的速度比大分子快可以用来分离大小从10kb到10Mb的DNA分子,22,脉冲电泳,PFGE

6、原理,23,PFGE结果判读,目测法：按美国疾病控制和预防中心(CDC)Tenover等人推荐的方法判读。图谱完全相同的定为一个型，彼此之间相差一个带的定为同一型的不同亚型，相差23个带的认为亲缘关系密切，相差46个带的认为可能相关，条带相差7个以上的认为无亲缘关系。并随机地选择不同的字母如A、B、C、D等的字母顺序分型。聚类分析计算机输入SPSS，做树状图,案例一,2006年7月，本市某医院外科重症监护病房（ICU）8例患者下呼吸道感染多重耐药鲍曼不动杆菌,目标性检测,对该ICU的环境、医疗用品、医务人员手及鼻咽拭子进行细菌学监测，共采样107份，其中23份检出鲍曼不动杆菌，阳性率21.3%

7、。主要分布在医务人员手、咽部及床头柜、输液泵、监护仪、治疗车、地面、病人用物等环境和医疗用品。,院感爆发流行的控制,空气消毒 15%过氧乙酸铵2g/m3用量进 行蒸熏及臭氧消毒物表消毒 地面、台面0.5%过氧乙酸拖擦 消毒医疗用品消毒 高压蒸汽灭菌 0.5%过氧乙酸浸泡消毒感染患者 隔离治疗，分组护理医务人员咽部带菌者 每日2-3次呋喃西林滴鼻，口泰嗽口,案例二,2006年我市某院发现了一例携带耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌（痰，血）的患者为了防止该耐药菌在医院内的播散，对该病区进行目标性监测,四株肺炎克雷伯菌的药敏,12 3 4亚胺培南16161616厄他培南16161616头孢西丁=64=64=6

8、4=64头孢匹汚=64=64=64=64头孢曲松=4=4=4=4妥布霉素4444头孢他啶=16=16=16=16氨曲南=64=64=64=64头孢他啶=64=64=64=64环丙沙星=64=64=64=64哌拉西林他唑巴坦=128=128=128=128左氧氟沙星=64=64=64=64氨苄西林=32=32=32=32氨苄西林，舒巴坦=32=32=32=32KB(mm）2163219320852011多粘菌素B20202120美罗培南15151515头孢哌酮 舒巴坦6666,耐药菌的基因型分析,1.为阳性对照（KPC-2)2.肺克（患者痰）3.肺克（患者血）4.肺克（隔壁床患者痰）5.肺克（病

9、房拖把）6.为阴性对照Mark,聚类分析,院感及时控制因素,及时发现 医务人员的重视ICU 环境因素(单房间,单独护理)环境的消毒措施有效半年内未出现耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌,KPC酶,水解亚胺培南或美罗培南（是目前临床上控制革兰阴性菌感染的最有效的抗菌药物）的一类内酰胺酶属于功能分类法的2f组，A类，可被克拉维酸抑制，不被乙二胺四乙酸（EDTA）所抑制现已报道的KPC亚型共12种亚型 在中国主要见于浙江,产KPC酶耐药菌的传播,研究认为，blaKPC位于一种新型的Tn3型的转座子Tn4401上，其转座子的结构是KPC基因转移的原因这种新型的转座子结构可以使blaKPC从其原始位置转移至各类不同

10、的质粒同时认为转座子Tn4401是一个复合转座子，由2次序列插入形成,产KPC酶耐药菌,有限的DNA指纹和脉冲凝胶电泳资料显示产KPC酶的肠杆菌科细菌易发生医院感染的暴发流行最早在美国、特别在美国的东北部各州蔓延，并造成局部地区暴发流行以后几年再世界各地都有报告,脉冲场凝胶电泳（PFGE),对基因组的DNA酶切片段多态性进行同源性分析，是短期院内感染爆发流行判断的金标准是一种分离大分子DNA的方法,耐碳青酶烯肠杆菌科细菌,2007年下半年零星出现(肺克)2010年1-8月收集到18株.包括肺克克雷伯菌（15）大肠埃希菌（1）阴沟肠杆菌（1）枸橼酸杆菌（1）,产KPC-2肺克同源性分析(2010

11、.1-8),流行病学分析,A型传播源头:患者来自上海某医院，转至我院重症监护室，入院次日做痰培养，检出亚胺培南耐药的肺克。后转入康复科，耐药菌一直被检测到。A型患者分布于重症监护室，康复科，血液科。B型和C型的七名患者住我院某外科。B型的五名患者在分离出该耐药菌前未使用过碳青霉烯类抗生素，推测是院内环境感染所致C型的两名患者，源头的患者住院时间长达121天，在分离出该菌之前，美罗培南使用时间近二十天，推测C型可能是抗生素筛选的结果。,PFGE的局限性,无法判断2006年产KPC酶肺克的小范围流行与2010年出现的15株产KPC酶的肺克A,B,C,三个克隆间有无同源性不同实验室间的分型结果不能进

12、行比较,多位点序列分型(Multilocus sequence typing,MLST,一种基于核酸序列测定的细菌分型方法通过PCR扩增管家基因内部片段测定其序列，分析菌株的变异,MLST的原理,一般测定610个管家基因内部400600bp的核苷酸序列，每个位点的序列根据其发现的时间顺序赋予一个等位基因编号，每一株菌的等位基因编号按照指定的顺序排列就是它的等位基因谱，也即是这株菌的序列型（sequence type,ST）。这样得到的每个ST均代表一组单独的核苷酸序列信息。,序列型（ST),序列型（Sequence-typying,STs）等同于MLEE得出的电泳型(Electrophoretic type,ET）通过比较ST可以发现菌株的相关性,即密切相关菌株具有相同的ST或仅有极个别基因位点不同的ST,而不相关菌株的ST至少有3个或3个以上基因位点不同,MLST的分析方法,MLST技术针对看家基因设计引物对其进行PCR扩增和测序,得出每个菌株各个位点的等位基因数值然后进行等位基因图谱(allelic profile)或序列类型(sequence types,STs)鉴定再根据等位基因图谱使用配对差异矩阵(matrix pair-wise differences)等方法构建系统树图进行聚类分析,谢谢,