两水相萃取过程的选择性-生物分离工程.ppt

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1、两水相萃取过程的选择性,(1)细胞，细胞碎片影响分配（粘度）总分配系数(2)亲和两水相分配(3)液体离子交换剂,两水相体系发展中的问题,相体系回收(1)环境(2)成本,成相聚合物的回收,(1)压力敏感型两水相(2)热促相分离高聚物EO-PO(3)pH敏感型高聚物（聚两性离子高聚物,多聚电解质)(4)光敏感相分离高聚物,压力诱导相分离,加氨基酸对相图的影响,加氨基酸对相密度的影响,氨基酸的分离配系数,系线长度与分配系数,热诱导相分离,EO-PO-HP-EOPO,高聚物结构式,相体系回收示意图,相 图,盐的分配,蛋白纯化,EOPO-HPEOPO高聚物回收,pH 诱导相分离,Recycling Po

2、lymers Forming Aqueous Two-phase Systems,光敏感聚合物合成,Table 1 Probability of PNBC with different components with varied composition to form aqueous two-phase systems,The number 1,2,3 denotes the initial volume ratio 1:1,2:1,3:2,respectively.All systems were stood for one day at 20.,Fig 1.Phase diagram f

3、or PNBC-Dextran in water solution at 20.,Figure 2.Repeated recovery of polymer in aqueous solution,Figure 3 Recovery comparison of light-sensitive radiation and thermo-sensitive precipitation of PNBC polymer in two-phase systems.The concentration of salts in total phases was 50mM.The initial volume

4、ratio is 3:2(ml/ml).,两水相系统的应用,蛋白质纯化抗生素，氨基酸，天然成分酶相转移催化细胞器分离,光敏感可再生两水相中青霉素酰化酶催化青霉素G为6-APA,图 6APA在系列盐系统中的分配系数K,图6.3 不同系统中PG的酶催化转化率,图6.4 PA浓度变化PG的转化率（未加盐）,图6.5 PA浓度变化PG的转化率（50mM KCl）,配制5%PNBC300000-40%Dextran20000两水相体系45 ml(pH7.8,含0.1M 磷酸盐缓冲液)，上下体积比为8:1，加入固定化酶0.10g（0.2，0.3g）,青霉素G（Na）0.40g,于20振荡反应，每60 mi

5、n测定6-APA浓度,计算青霉素G转化率。,重复批转化反应与上述相体系基本相同，只是另加50mM KCl，加入固定化酶0.3g,PG0.18g,(0.4%),在反应360min后,测定上相中6-APA，之后移出上相，加入与原上相相同的组成的上相及PG，重复进行反应，测定6-APA浓度，计算转化率。,结 论合成一种对光敏感，可回收再利用的两水相成相聚合物光照回收率均在98以上，热敏回收率在95%以上，可以很好地实现聚合物回收 青霉素G转化率达到79.8%，较单水相提高15%尚需寻找另一种可回收高聚物，使得两水相中两种高聚物都能得到回收。,全回用两水相体系,意义：1.合成可再生的聚合物。2.构建两

6、水相体系，使两相均能回收3.较好的分离效果。内容：1.以异丙基丙烯酰胺（NIPA）、乙烯基 吡咯烷酮（NVP）、叶绿酸铜钠（CHL）三单体合成可再生光 敏感聚合物PNNC2.PNNC与另一pH敏感聚合物PADB成相3.应用该可再生两水相体系,合成聚合物PNNC示意图,R1：,2.聚合物PNNC的合成与表征(1)聚合物PNNC的单体比例选择,选取的单体摩尔比为196：8：1,1.聚合物的成相,通过成相实验和相图，确定使用的两水相体系为 PNNC(10%)/PADB(5%),绘制相图,采用 节点检测法,BACK,两水相成相、分相、聚合物回收示意图,1g聚合物沉淀平均所需要的照射时间为266分钟由公

7、式：Q=W*T 1g聚合物沉淀大概所需要吸收的激光能量为4.8kJ1度电能够使750g聚合物沉淀,2.聚合物PNNC光照回收（1）聚合物PNNC的光照条件 采用激光输出功率为300mw，照射点的面积为1.77*10-6m2,（2）单水相PNNC溶液光照回收（3）单水相PNNC溶液重复回收实验,96.8,（4）两水相两聚合物回收实验（5）两水相两聚合物重复回收实验,95.5%,BACK,3.蛋白质在两水相体系中的分配,（1）盐种类对溶菌酶及牛血清白蛋白（BSA）分配的影响（均采用20mM无机盐）,4.氨基酸的分配实验(1)盐种类对氨基酸分配的影响 采用色氨酸（Trp），酪氨酸（Tyr）为试样,1

8、.通过自由基无规聚合，合成了水溶性光敏感聚合物PNNC 粘均分子量约为7.1103。2.选取的成相体系为10（w/w）PNNC与5（w/w）PADB，成相体积比为1：3。两水相中两聚合物多次光回收和pH回收都在95.5到98.7之间，一定程度上解决了聚合物回收率低的问题。3.以氨基酸、蛋白质等生物物质为研究对象，考察该两水相系统的性质。其中Tyr、Trp的最佳分配系数分别为0.12、6.25；溶菌酶、BSA的最佳分配系数分别为0.11、4.2。4.该两水相体系对乳酸小分子的分配系数均接近于1，最大分配系数只有2.30。5.在乳酸的分配模型关联中，朱自强改进的D-H模型 相关性最好，说明在PNN

9、C浓度8.012.0范围内，该模型对乳酸在PNNC/PADB两水相体系中分配系数关联最为准确。,结论,pH敏感型可回收丙烯酸类两性高聚物的合成及其在两水相中应用,意义：1 构建两种成相聚合物均可回收的新两水相体系（PNBC/PADB）2 较高的回收率（95）3 操作条件相对温和,采用丙烯酸（AA），甲基丙烯酸二甲氨基乙酯（DMAEMA），甲基丙烯酸丁酯（BMA）,PADB反应示意图：,通过1H NMR中单体上特征氢，计算得到三种单体摩尔比为AA：DMAEMA：BMA27.7：9.2：1；投料比为19.7：7.24：1,4.聚合物成相实验,选择由pH敏感型聚合物PADB和光敏感聚合物PNBC组成

10、两种成相聚合物均可回收的两水相体系。,5.相图,PADB浓度,PNBC浓度,T,B,M,C,选择由10%(w/w)PNBC/5%(w/w)PADB组成两水相体系，,2.无机盐种类及浓度对聚合物PADB单水相回收影响,未加无机盐,2.NaCl；3.KCl；4.Na2SO4；5.（NH4）2SO4；6.Na3PO4；7.Na4P2O7,3.单水相聚合物PADB多次循环使用的得率,96.7,98.6,4.无机盐种类对两水相PNBC/PADB聚合物回收影响,1.NaCl；2.KCl；3.Na2SO4；4.（NH4）2SO4；5.Na3PO4；6.NaClO4,98.7,96.8,5.无机盐浓度对两水相

11、PNBC/PADB聚合物回收影响,Na3PO4浓度(mM),98.6,98.2,6.多次回收对两水相PNBC/PADB聚合物回收影响,97.8,96.7,3.无机盐种类及浓度对分配系数的影响,27.5,1.没加无机盐；2.NaCl；3.KCl；4.KBr；5.NaHSO3；6.Na2SO4；7.Na3PO4；8.Na4P2O7,结 论,1.通过自由基无规聚合，合成了pH敏感型的可回收丙烯酸类两性聚合物PADB，其粘均分子量约为3.7104，聚合物中三种单体摩尔比为AA：DMAEMA：BMA27.7：9.2：1；2.由10（w/w）PNBC/5（w/w）PADB组成两种成相聚合物均可回收的两水相

12、体系，成相体积比为1：2。经过五次循环使用后聚合物PNBC的回收率为97.8；PADB的回收率96.7；3.该两水相体系对大分子有较好的分离效果，其中BSA最大分配系数可达27.5；溶菌酶的最大分配系数可达0.49；,Phase transfer bioconversion of penicillin G into 6-APA by immobilized penicillin acylase in recycling aqueous two-phase systems with light-pH sensitive copolymers,enzyme,enzyme,enzyme,enzyme

13、,enzyme,Enzymetic reaction,substrate,product,enzyme,enzyme,enzyme,Enzymetic reaction with ATPS,Relation between 6-APA partition coefficient and inorganic salts,Partition coefficients change of substrate and products during,Conc.Change of phenylacetic acid and 6-APA during bioconversios,Conc.Change o

14、f 6-APA in top and bottom phase,Conc.Change of Phenylacetic acid in top bottom phase,Total yield of 6-APA in top and bottom phase,小 结,1 Immobilized penicillin acylase was used for bioconversion of penicillin G into 6-APA in ATPS with PNBC and PADB.2 K6-APA 5.78(containing1%NaCl).Reaction time at 7h

15、or so.The 6-APA mole yields 85.3%(pH 7.8,and 20)3 K 6-APA and K phenylacetate acid was significantly changeable during reaction.4 PNBCcould be recovered by laser radiation at 488 nm or filtrated 450 nm light,PADB could be recovered by isoelectric point(pH 4.1).The recovery of the two copolymers was

16、96-99%.5 The bioconversion could be performed at 20 C due PNBC phase separation.,表面活性剂水胶束两水相体系,概述：表面活性自组装成分子多聚体（胶束），疏水基向内形成胶 核，亲水基向外，当温度在浊点以上时，发生分相。与传统两水相的比较：产生两水相只需要表面活性剂与水 通过控制温度，表面活性剂浓度，盐等可改变胶束大小与形状提供两亲性环境，一般更适合憎水性生物分子通过引进亲和配基或电性基团，增加选择分离效果 通过过滤等手段可方便地将胶束与生物分子分离。,组成两水相的表面活剂,Trixton-X 100,114CiEOj

17、,阴阳离子表面活性剂组成的两水相,概述：当阴，阳两种离子性表面活剂在临界胶束浓度（CMC）以上混合时形成两水相，上相富含表面活性剂，下相则很少性质：（1）能提供两亲性环境，适合水不溶性蛋白萃取（2）胶束的大小与形状可控（3）胶束表面电荷可控，增加电荷选择性（4）通过稀释或温度变化形成沉淀回收表面活性剂（5）易于操作（低浓度，低粘度，快速分相）,表面活性剂,（1）辛基三甲基溴化铵(OTAB)与辛基硫酸钠(SOS)（2）溴化十二烷基三乙胺(C 12 NE)十二烷基磺酸钠（SDS）（3）辛基三甲基溴化铵(OTAB)十或十二烷基磺酸钠（C10S,或 C12S),思考题,1 两水相萃取应用中最突出的问题是什么？如何解决？2 两水相有几类？如何形成两水相？3 当前两水相体系的回用有哪些方法？其原理是什么?,