激光扫描共聚焦显微镜技术讲座.ppt

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1、激光扫描共聚焦显微镜,Laser Scanning Confocal Microscope(LSCM),采用激光作为光源，在传统光学显微镜基础上，使用紫外或可见光激发荧光探针，采用共轭聚焦原理和装置，从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像，在亚细胞水平上观察生理信号及细胞形态的变化，并利用计算机对所观察的对象进行数字图象处理的一套集观察、分析和输出为一体系统。它把光学成像的分辨率提高了30%40%，成为形态学，分子生物学，神经科学，药理学，遗传学等领域中新一代的研究工具。,LSCM 的发展1957年 提出了共聚焦显微镜技术的某些基本原理，并获 得了美国的专利。1967年 成功的应用共聚焦显微

2、镜产生了一个光学横面。1970年 牛津和阿姆斯特丹同时向科学界推荐了一种新型 的扫描共聚焦显微镜。1984年 Bio-Rad公司推出了世界第一台共聚焦显微镜品。1987年 White和Amos在英国自然杂志发表了“共聚焦 显微镜时代的到来”一文，标志着LSCM已成为进行 科学研究的重要工具。随后Zeiss、Leica、Meridian等多家公司相继开发出不同型号的共聚焦显微镜。随着技术的不断发展和完善，产品的性能也不断改进和更新，应用的范围也越来越广泛。,Hippocampus neurons expressing GFP,LSCM与普通荧光显微镜的图像质量比较,荧光显微镜,LSCM,显微镜成

3、像清晰度的决定因素:,1.分辨率2.球差3.色差,1、分辨率：指显微镜能将近邻的两个质点分辨清楚的能力,通常是用显微镜所能分辨清楚最近的相邻两点间的距离来表示。,人眼及各类显微镜的分辨率,人眼分辨率：0.20 mm光学显微镜分辨率：0.25 mm共焦显微镜分辨率：0.18 mm电子显微镜分辨率：0.20 nm,2、球差：由主轴上某一物点向光学系统发出的单色圆锥形光束，经该光学系列折射后，不能聚焦成一点,使成像模糊不清,形成一弥散光斑(俗称模糊圈)，则此光学系统的成像误差称为球差。,3、色差：由白色物点向光学系统发出一束白光，经该光学系列折射后，组成该束白光的红、橙、黄、绿、青、蓝、紫等各色光，

4、不能会聚于同一点，即白色物点不能结成白色像点，而结成一彩色像斑的成像误差，称为色差。,LSCM的重要组件,激光光源自动显微镜扫描模块（包括共聚焦光路通道和针孔、扫描镜、检测器）数字信号处理器计算机以及图象输出设备（显示器、彩色打印机）等。,激光器显微镜：物镜 载物台计算机系统：图像分析与控制系统,激光扫描共聚焦显微镜 vs 荧光显微镜,激光扫描共聚焦显微镜,荧光显微镜,激光扫描共聚焦显微镜中常见的激光器,激光器,Ar激光器:458nm,476nm,488nm,514nm HeNe:543nm,633nm 固体激光器(UV):405nm,激光器的特点:1)方向性好:激光基本延直线传播 2)单色性

5、好:=10-8nm 3)高亮度:激光方向性好,其在空间上的能量分布是高 度集中的。4)偏振性:激光为平面偏振光,光纤耦合,显微镜,Leica DM IRBE 倒置荧光显微镜,物镜,LSCM物镜的重要参数 NA,数值孔径又叫做镜口率，简写为N.A。是物镜的主要技术参数，是判断物镜性能高低的重要标志。N.A=n*sin a/2 n：物体与物镜间媒质的折射率 a2：物镜孔径角的一半 溴萘折射率1.66，香柏油1.515，玻璃1.52，水的为1.3，空气为1。香柏油与玻璃折射率相似，故光折射少，透光率高，成像清楚。N.A.越大：放大倍数越大，分辨率越高，N.A.越大：视场宽度与工作距离越小,4x,20

6、 x,10 x,40 x,60 x,100 x,载物台,计算机系统,图像分析与控制系统,分析软件,控制软件,+,激光共聚焦显微镜原理,图1.共聚焦显微镜简化原理图 用于激发荧光的激光束(Laser)透过入射小孔(light source pinhole)被二向色镜(Dichroic mirror)反射，通过显微物镜(Objective lens)汇聚后入射于待观察的标本(specimen)内部焦点(focal point)处。激光照射所产生的荧光(fluorescence light)和少量反射激光一起，被物镜重新收集后送往二向色镜。其中携带图像信息的荧光由于波长比较长，直接通过二向色镜并透过

7、出射小孔(Detection pinhole)到达光电探测器(Detector)（通常是光电倍增管（PMT）或是雪崩光电二极管（APD），变成电信号后送入计算机。而由于二向色镜的分光作用，残余的激光则被二向色镜反射，不会被探测到。,共轭,图2.探测针孔的作用示意图（解释了出射小孔所起到的作用）只有焦平面上的点所发出的光才能透过出射小孔；焦平面以外的点所发出的光线在出射小孔平面是离焦的，绝大部分无法通过中心的小孔。因此，焦平面上的观察目标点呈现亮色，而非观察点则作为背景呈现黑色，反差增加，图像清晰。在成像过程中，出射小孔的位置始终与显微物镜的焦点(focal point)是一一对应的关系（共轭c

8、onjugate）,因而被称为共聚焦（con-focal）显微技术。,普通光学显微镜与激光共聚焦显微镜的区别,LSCM扫描图像方式,单一光学切片扫描(single optical section,x-y)时程活细胞扫描(time lapse live cell imaging,x-y-t)三维扫描及重构(3-D reconstruction,x-y-z)四维扫描(4-D imaging,x-y-z-t),Z,X,Y,XY平面,单一光学切片扫描(single optical section,x-y),Optical sections collected simultaneously at thr

9、ee different excitation wavelengths(488,568,and 647 nanometers).The specimen is the fruit fly third instar wing imaginal disk.,X,Y,XY平面,时程活细胞扫描(time lapse live cell imaging,x-y-t),X,Y,XY平面,time,Time-lapse imaging of a living fruit fly embryo injected with calcium green is presented in Figure 2.The s

10、eries of images shows the change in distribution of the fluorescent probe over time.,0 s,10 s,20 s,30 s,三维扫描及重构(3-D reconstruction,x-y-z),Peripheral nervous system of a fruit fly embryo,Z,X,Y,XY平面,三维扫描及重构(3-D reconstruction,x-y-z),一种高分辨率的显微成像技术,1 用激光做光源，激光单色性好，光源波长相同，从根本上消除了色差。2 采用共聚焦技术在物镜的焦平面上放置了一个

11、带有小孔的挡板，将焦平面以外的杂散光挡住，消除了球差，并进一步消除了色差。显微图象的清晰度和细节分辨能力。3 采用点扫描技术将样品分成无数个点，用十分细小的激光束逐点逐行扫描成像，再通过电脑组合成一个整体。传统的光镜在场光源下一次成像，标本上每一点都会受到相邻点的衍射光和散射光的干扰。这两种图像的清晰度和精密度是无法相比的。,4 用计算机采集和处理光信号，并利用光电倍增管放大信号，它代替了人眼和照相机进行观察，摄像，得到的图像是数字化的，可以在电脑中进行处理，进一步提高图像的清晰度。5观察活细胞、活组织：在不损伤细胞的前提下,对活组织、活细胞进行观察和测量，这不仅省去了繁琐的样品前期处理过程(

12、如脱水、脱蜡、染色等);而且观察过的样品还可以继续用于其他的研究。这种功能对于细胞培养、转基因研究尤为重要。这可以说是最大的优势。,6 生化成分精确定位观察配合专用的分子探针,对于要检测的成分不仅可以定位到细胞水平,还可以定位到亚细胞水平和分子水平。7 动态观察在同一样品平面上随时间进行连续扫描,就可分析细胞结构、内含、和标记等动力学变化。目前在这方面做得最多的是使用观察心肌或平滑肌细胞内游离钙、钠、钾离子浓度或的动态变化。8 定量测量：首先应用专一的荧光探针对样品进行染色,样品的荧光强度和所测成分的含量呈正比,如果其余条件固定,通过对比各组样品之间的荧光强度值,可得出特定成分的含量比。,应用

13、范围细胞生物学：细胞结构、细胞骨架、细胞膜结构、流动 性、受体、细胞器结构和分布变化生物化学：酶、核酸、FISH（荧光原位杂交）、受体分析药理学：药物对细胞的作用及其动力学生理学：膜受体、离子通道、细胞内离子含量、分布动态神经生物学：神经细胞结构、神经递质的成分、运输和传递、递质受体、离子内外流、神经组织结构、细胞分布微生物学和寄生虫学：细菌、寄生虫形态结构病理学及临床应用：活检标本诊断、肿瘤诊断、自身免疫性疾病诊断、HIV等遗传学和组胚学：细胞生长、分化、成熟变化、细胞的三维结构、染色体分析、基因表达、基因诊断,LSCM在生物学上的应用,荧光组织化学动态荧光测量(细胞内钙测量、细胞内pH测量

14、、细胞膜流动性测量、膜电位测定)细胞间隙连接的细胞间通讯,荧光探针的选择,合适的荧光探针是有效地进行实验并获取理想实验结果的保障。(1)现有仪器所采用的激光器(2)荧光探针的光稳定性和光漂白性(3)荧光的定性或定量 定性:单波长激发探针 定量:双波长激发比率探针(4)荧光探针的特异性和毒性。(5)荧光探针适用的pH,*不同的荧光探针在不同标本的效果常有差异，故除综合考虑以上因素以外，有条件者应进行染料的筛选，以找出最适的荧光探针。*许多荧光探针是疏水性的，很难或不能进入细胞，需使荧光探针与AM（乙酰羟甲基酯）结合后变成不带电荷的亲脂性化合物方易于通过质膜进入细胞，在细胞内荧光探针上的AM被非特

15、异性酯酶水解，去掉AM后的荧光探针不仅可与细胞内的靶结构或靶分子结合且不易透出质膜，从而能有效的发挥作用。,常见应用及其荧光探针,1细胞内游离钙 共聚焦激光扫描显微镜常用的有Fluo-3、Fluo-4、Rhod-1、Rhod-2、Indo-1、Fura-2等，前四者为单波长荧光探针，利用其单波长激发特点可直接测量细胞内Ca2+动态变化，为钙定性探针；后两者为双波长激发探针，利用其双波长激发特点和比率技术，能定量细胞内钙，为钙定量探针。,Fura-2：激发峰为340/380nm，发射波长在505-520nm之间。Fura-2可以和钙离子结合，结合钙离子后在330-350nm激发光下可以产生较强的

16、荧光，而在380nm激发光下则会导致荧光减弱。这样就可以使用340nm和380nm这两个荧光的比值来检测细胞内的钙离子浓度，可以消除不同细胞样品间荧光探针装载效率的差异，荧光探针的渗漏，细胞厚度差异等一些误差因素。,2 DNA和RNA核酸的荧光探针 AO(吖啶橙)：与DNA结合，发射波长525nm，显 绿色;与RNA结合，发射波长650nm，显红色。PI：既可标记DNA又可标记RNA，如为获得单独的DNA或RNA分布，染色前可用RNA酶或DNA酶处理细胞。PI不能进入完整的细胞膜，故不能标记活细胞内的DNA和RNA。DAPI：与双链DNA结合荧光增强20倍，与单链DNA结合无荧光增强。荧光强度

17、比Hoechst低，光稳定性强于Hoechst。,3 膜电位 共聚焦激光扫描显微镜则可利用荧光探针在细胞膜内外分布的差异测出膜电位，不但可以观察细胞膜电位的变化结果，更重要的是可以用于连续监测膜电位的迅速变化。DiBAC4(3)：带负电荷慢反应染料。本身无荧光，当进入细胞与胞浆内的蛋白质结合后才发出荧光，测量时要求细胞浸在荧光染料中。当细胞内荧光强度增加即膜电位；反之，即膜电位降低。Rhodamine 123：主要用于线粒体膜电位测量。是一种亲脂性阳离子荧光探针，当线粒体膜内侧负电荷增多时，荧光强度增加，与DiBAC4(3)的表示形式相反。,4 细胞内活性氧基：活性氧(active oxyge

18、n species)可影响细胞代谢，与蛋白质、核酸、脂类等发生反应，有些反应是有害的，因此测量活性氧在毒理学研究中有一定的意义。常用荧光探针有Dichlorodihydrofluorescein diacetate(2，7-二氯二氢荧光素乙酰乙酸、H2DCFDA)，其原理是不发荧光的H2DCFDA进入细胞后能被存在的过氧化物、过氧化氢等氧化分解为二氯荧光黄（dichlorofluorescein，DCF)而产生荧光。,5 细胞间通讯：荧光光漂白恢复(fluorescence recovery after photobleading，FRAP)技术可用于检测细胞缝隙连接通讯。该方法的原理是一个细

19、胞内的荧光分子被激光漂白或淬灭，失去发光能力。而临近未被漂白细胞中的荧光分子可通过缝隙连接扩散到已被漂白的细胞中，荧光可以逐渐恢复。由于光漂白过程是不可逆的，因此可通过观察已发生荧光漂白细胞其荧光恢复过程的变化量来判断细胞缝隙连接的通讯功能。,6 细胞膜流动性：荧光光漂白恢复(FRAP)技术。利用NBD-C6-HPC标记膜磷脂，然后用高强度的激光束照射活细胞膜表面的某一区域(12m)，使该区域的荧光淬灭或漂白，再用较弱的激光束照射该区域。可检测到细胞膜上其他地方未被漂白的荧光探针流动到漂白区域时的荧光重新分布情况。荧光恢复的速率和程度可提供有关的信息。,7 细胞亚微结构(细胞器探针）共聚焦激光

20、扫描显微镜可获得较高分辨率的细胞内线粒体、高尔基复合体、内质网、溶酶体等细胞器图像，同时还可动态观察活细胞状态下细胞器的形态学变化情况，此外还可通过光学切片即断层扫描技术进行三维重建，显示细胞器的空间关系及其变化。适用于线粒体的荧光探针较多，如Mitotracker、DA SPMI、DA SPEI、JC-1、罗丹明 123等。高尔基复合体常用的荧光探针有NBD 酰基鞘氨醇（ceramide）、BODIPY 酰基鞘氨醇。内质网主要用Dil、DiOC6(3)。溶酶体的荧光探针有DAMP、neutral red。,8.pH值 正常细胞胞浆内的pH一般在6.87.4的范围，而某些细胞器如溶酶体的pH则

21、在4.56.0之间。根据检测对象pH的不同将荧光探针分为用于偏中性和酸性两类。常用于偏中性pH即细胞胞浆pH检测的荧光探针有SNARF类(SNARF-1、SNARF-calcein)、SNAFL类(SNAFL-1、SNAFL-calcein)、BCECF等，这些探针均为疏水性探针，须使用其AM形式。FITC-dextran则适用于pH范围46之间，如溶酶体pH的检测，该探针也不能透过质膜，但可通过细胞胞饮作用进入溶酶体，因此应选择分子量稍小的Dextran(葡聚糖)。,9 标记抗体、配体等常用的荧光探针 共聚焦激光扫描显微镜不仅可用免疫荧光分析固定的细胞或组织切片，还可用于分析活细胞，得到特异

22、性抗体或其他荧光免疫探针识别靶分子的表达、定位、分布变化等信息。,10.F-肌动蛋白荧光探针：鬼笔环肽：特异性地与F-肌动蛋白荧光探针结合，纳摩尔浓度下也可标记,11 检测酶活性的荧光探针 共聚焦激光扫描显微镜在检测活细胞酶活性动态变化方面有着无可比拟的优势。通过对细胞施予不同的处理因素可检测细胞内相应的酶被激活或灭活的动态变化过程。有的酶荧光探针是自身就可发出荧光、有的是与酶结合后发出荧光、有的则是被酶分解后发出荧光。,实例1 测定爪蟾卵母细胞内钙变化,手术分离卵母细胞胶原酶消化中和消化液，停止消化18C静止细胞4小时，以备后用,Xenopus oocytes,卵母细胞微注射,Calcium

23、 green,用细胞内液稀释Calcium green导入微注射器以20nL/oocyte注射卵母细胞18C避光放置40分钟共聚焦显微镜观察,IP3引起的卵母细胞内钙升高,实例2 Fluo-4测定HEK293细胞内钙变化,前一天HEK293消化传代Fluo-4 AM孵育液的配制Fluo-4AM 5 uM+20%F127避光孵育HEK细胞15分钟DMEM+10%FBS冲洗细胞2次在细胞外液中避光静置30分钟移入共聚焦显微镜载物台，进行观察,实例3 细胞膜磷脂PIP2的动态测定,HEK293 cells expressing PLC-PH-GFP,PLC-PH-GFP+H1 receptor LipofactAMINE2000,混合20分钟,混合物孵育细胞 4-6小时,洗掉转染液，加入正常培养液，培养24h,LSCM观察,Control,Histamine,washout,实例3 细胞膜磷脂PIP2的动态测定,HEK293 cells expressing PLC-PH-GFP,A,