高通量测序在生物学的应用.ppt

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1、高通量测序技术在生物学中的应用,主要报告内容,高通量测序简介从头测序及其应用重测序及其应用转录组测序及其应用Small RNA测序及其应用,HGP项目：20世纪90年代美国能源部资助启动人类基因组计划，六个国家的科学家耗资4.37亿，于2000年完成人类基因组工作草图。方法和结果：应用分层shotgun+Sanger测序法，结果预测了31,000个基因，证明基因组的95%是非编码序列。意义：人类基因组测序的完成标志着分子医学时代的到来；此项目也催生了高通量测序技术。,Nature(2001)409:860-921,人类基因组从头测序分析,分层的shotgun测序法,Sanger测序技术,PCR

2、末端终止技术+电泳检测技术单个片段序列测定最高通量：小于4MB/天,基于平板胶的测序技术,96通道毛细管阵列,高通量测序技术,Shot Gun文库构建,簇序列读取反应,图像获得和处理,序列组装和比较,3,T T T T,T G C T,高通量测序技术,主要测序技术平台,Metzker,Nature Reviews Genetics(2010)11:31,主要报告内容,高通量测序简介从头测序及其应用重测序及其应用转录组测序及其应用Small RNA测序及其应用,454技术完成5倍测序深度；GAII技术完成20倍测序深度；Sanger技术完成6倍覆盖度,（Dalloul et al.PLoS Bi

3、ol(2010)8:e1000475）,多种技术平台联合应用完成火鸡基因组从头测序,测序数据统计,火鸡基因组从头测序,结果：覆盖火鸡基因组 90%（0.92/1.1Gb），发现6M SNP，预测 16K个基因。,火鸡和家鸡测序拼接结果,火鸡基因组从头测序,发现了数千个禽类特有的基因，尤其是性染色体基因研究令人兴奋。,禽类中的特有基因,火鸡基因组从头测序,为研究者提供火鸡质量和数量生产性状和抗病候选基因，加速了火鸡育种进展。,与家鸡基因组比较火鸡基因组中20种基因家族的分布情况,三种鸟类基因比对结果,四种禽类不同氨基酸含量情况,意义：第一个完全运用高通量测序技术模式完成的动物基因组从头测序；方法

4、和结果：不同插入片段测序文库双末端测序技术的尝试：包括150bp、500 bp、2 kb、5 kb 和10 kb不同插入片段，测序深度达73倍，覆盖94%的基因组区域；获得2.7M SNP位点，证明大熊猫仍然具备很高的杂合率和较高的遗传多态性；,Li et al.,Nature(2009)463：311-317,大熊猫基因组从头测序和组装,大熊猫基因组从头测序和组装,利用9个Sanger测序的BAC序列评价测序的质量，表明98%的BAC序列可以比对到scaffold上预测大熊猫约有21001个基因,大熊猫与人、狗和鼠的基因进化分析,测序数据与BAC序列比较,基因组从头测序经典策略,从头测序的数

5、据分析和产出,从头测序的覆盖度指标,从头测序主要数据分析,原始数据,比对,组装结果统计,覆盖度、深度评价,基因注释,比较基因组及进化分析,蓝藻 1 Mb,线虫 100 Mb,果蝇100 Mb,人 3,000 Mb,基因和基因组进化,小鼠 3,000 Mb,生物进化谱系树,大鼠、小鼠、狗、大熊猫、牛,家鸡、火鸡,斑马鱼,拟南芥、水稻、杨树、酿酒葡萄、短柄草、黄瓜、高粱、玉米,1535个细菌基因组、49个真菌基因组和78个古细菌,利什曼原虫、椎体虫,四类蓝藻,隐藻,蜜蜂,单分子测序技术及其对从头测序的影响,单分子实时测序，无需PCR扩增运行时间15min或者更短，读长达到5-50K，数据产出100

6、-1000G；使人类基因组测序成本低于1000美元,主要报告内容,高通量测序简介从头测序及其应用重测序及其应用转录组测序及其应用Small RNA测序及其应用,瑞士和美国科学家对8个家鸡品系和1个野生品系进行测序该研究可以用于动物育种及提高家鸡在生物医药研究模式动物中的应用,Rubin et al.,Nature(2010)464:doi:10.1038,通过全基因组重测序分析鸡驯养过程中的位点选择,通过全基因组重测序分析鸡驯养过程中的位点选择,测序完成44.5倍测序深度，测序覆盖度达92%发现7,000,000 SNP位点，约1,300插入/缺失位点研究发现基因功能缺失突变在鸡驯养过程中没有

7、显著性作用,缺失影响编码区的基因,测序数据统计,筛选到两个基因GHR（以前验证）和SH3RF2在育种中具有功能在400个F8群体中分析SH3RF2的缺失对鸡体重的影响表明SH3RF2是筛选不同鸡品系的一个重要指标,通过全基因组重测序分析鸡驯养过程中的位点选择,分析SH3RF2基因,中科院上海生命科学院、北京基因组所 等六家科研机构对150个水稻RIL系进行测序利用Illumina GA，每16个样一个道，以3个碱基为标签，测序读长为36碱基，每个样的测序深度约0.02倍第一次利用全基因组重测序筛选SNP位点，对群体进行表型分析,利用全基因组重测序分析表型差异,利用全基因组重测序分析表型差异,分

8、析两个亲本的基因组差异发现1,226,791 SNP位点，即3.2 SNPs/kb分析150个RILs发现了1,493,461 SNP位点，即1 SNP/40kb,实验设计,与以前的该RILs的重组图谱比较分析，在150个RILs中鉴定出2334个重组框，平均每个框的大小约164 kb利用sliding window方法分析SNP位点与表型间的关系与重组位点,利用全基因组重测序分析表型差异,Sliding window方法,分析株高，共鉴定出4个QTL，其中贡献率最强的1个QTL位点含有一个sd1基因，该基因在2002年已被报道。表明利用全基因组重测序可以进行精确的QTL定位及基因定位,利用全

9、基因组重测序分析表型差异,重测序生物信息学分析内容,Genetech公司（已被罗氏制药收购）生物信息学与计算机生物学部，与Complete Genomics公司合作对一名烟龄超过15年，平均每天吸烟25根的原发性肺部肿瘤患者进行分析，将这名患者的癌细胞和相邻正常组织的基因组进行测序对癌细胞完成了60倍的测序深度，相邻正常组织完成了46倍的测序深度。,(Lee et al.Nature(2010)465:473),肺癌组织的比较基因组学研究,测序数据统计,肺癌组织比较基因组研究,发现了超过5万个基因点突变，其中530个得到确认，它们当中392个在编码区域，包括以前已知的变异，如KRAS“原致癌基

10、因”突变和放大,体细胞单核苷酸突变趋势和模式统计,MAPK信号通路中多个基因的突变的作用模式,肺癌组织比较基因组研究,表明遗传上复杂的肿瘤可能包含很多部分冗余的突变，而且要识别复发性致癌“驱动突变”（driver mutation），将需要对很多尚未测序的样本进行测序。这些癌基因的发现对于未来研究肺癌靶向治疗，以及基因突变具有重要的意义,犹他大学（University of utah），Complete Genomics公司，华盛顿大学等对一对夫妻和他们的两个孩子进行了全基因组测序。这家的两个孩子都患有米勒综合征和原发性纤毛运动障碍，这两种疾病都是常染色体隐性遗传病测序深度分别为父亲 88倍，

11、母亲51 倍，儿子52 倍，女儿54 倍,Coach et al.,Science(2010)328(597):636 639,应用全基因组测序技术在家系中分析遗传力,父母和子女的测序覆盖度分别达到91%、85%、92%和91%与参考序列相比，96%序列至少在一个家系成员中被检测到，81%序列在家系四个成员中都检测到,应用全基因组测序技术在家系中分析遗传力,测序数据与NCBI参考基因组序列比较分析,测序数据统计,通过比较两代之间的基因组序列，科学家们对儿童基因组描绘出精确的重组图谱。这让他们校正了70%的测序错误，使测序准确率达99.999%。使研究人员精确确定了重组位点和稀有的单核苷酸多态性

12、。在他们最终的分析中，只保留了四个候选基因的突变，包括已知在纤毛运动障碍中突变的基因以及导致米勒综合征的变异体,应用全基因组测序技术在家系中分析遗传力,重组图谱,SNP分析,这些结果暗示对任何简单的单基因遗传病，一个或两个家庭的全基因组测序就有可能鉴定出致病突变 研究人员还第一次估算出两代人之间的遗传突变率，即基因组从一代人到下一代人的遗传过程中会发生多大程度的改变，约为1.110-8。结果发现，从父母到孩子的基因变异率仅为之前医学界预期的一半。,应用全基因组测序技术在家系中分析遗传力,哈佛医学院计算遗传中心主任George Church提出PGP目标是创建一个包含100,000人、公众可以公

13、开访问的在线基因库，帮助科学家了解基因之间的联系和遗传特征现已公布了1000人的基因组序列个人基因组测序是个性化医疗保健的基础,个人基因组计划（PGP）,George Church 和他的研究团队,重测序意义,在个体或群体水平进行差异性分析辅助分子育种，能够快速的进行种质资源普查筛选遗传进化分析及重要性状候选基因预测遗传疾病分析,主要报告内容,高通量测序简介从头测序及其应用重测序及其应用转录组测序及其应用Small RNA测序及其应用,RNA是遗传信息的载体,应用RNA-seq分析葡萄浆果发育过程中转录组,意大利维罗纳大学Vitis vinifera（葡萄）浆果发育三个阶段中（开花后5周、10

14、周和15周，即着果期、转色期和成熟期三种发育阶段中）的转录组研究数据量超过59M的36至44bp读长，82%的测序序列能够比对到基因组上 第一次使用RNA-seq分析葡萄浆果发育过程中的基因转录差异,有参考序列,分析92,051剪切点，大约0.8%剪切点参与385个基因的可变剪切与葡萄参考基因组（Pinot Noir 40024）比较，检测到85870个eSNP,应用RNA-seq分析葡萄浆果发育转录组,分析基因的可变剪切,鉴定了浆果发育过程中的17324个基因，其中的6695的基因是以时期特异性方式表达的分析浆果发育过程中的marker基因，表明RNA-seq分析的准确性,应用RNA-seq

15、分析葡萄浆果发育转录组,中科院上海生命科学院、北京基因组 所和上海交通大学对一个japonica(Nipp)和两个 indica(Gla4 and 93-11)发芽两周的样品进行转录组测序每个样本两个生物学重复，每个样本测三次，240碱基测两次和276碱基测一次第一次运用高通量测序分析转录组以鉴定外显子剪切位点,运用RNA-seq对水稻转录组进行功能注释,有参考序列,与参考序列比较，约38.8%57.3%能够比对到基因组的一个位置上共鉴定了15708个新的TARs（transcriptional active regions）,运用RNA-seq对水稻转录组进行功能注释,测序数据统计,新的TA

16、R统计,约48%的水稻基因具有可变剪切，这远远高于以前预测的频率检测到参考基因注释中的83.1%基因6228个基因的5和/或3末端至少比预测的延长50bp,运用RNA-seq对水稻转录组进行功能注释,浙江大学对白粉虱的虫卵、幼虫、蛹和成虫进行转录组测序用1个flow cell进行测序，可用数据约43M，读长为75bp,无参考序列,从头分析白粉虱转录组,从头分析白粉虱转录组,拼接完成4,274,766 contigs，170,115 scaffolds利用TGICL软件分析产生168,900个unique序列（平均长度=266bp)由于unique序列较短，83.8%unique序列无法进行基因

17、功能注释与NCBI数据比对成功的序列97%序列长度超过2000bp,GO分析能够把7,330 unigene序列归类到52个有功能群中COG分析归类7790 unigene序列到25类中KEGG通路分析能够将11,104个unigene序列归类到214个通路中,从头分析白粉虱转录组,列入研究白粉虱对杀虫剂具有很高的抗性昆虫基因组中约有1011个烟酰胺乙酰胆碱受体亚基基因检测到28个烟酰胺乙酰胆碱受体相关的序列，分析共鉴定9个不同的受体序列,从头分析白粉虱转录组,转录组测序生物信息学分析内容,转录组测序应用领域,转录本结构研究：UTR鉴定、Intron边界鉴定、可变剪切研究、Start codo

18、n鉴定等基因转录水平研究全新转录区域研究Non-coding RNA研究,主要报告内容,高通量测序简介从头测序及其应用重测序及其应用转录组测序及其应用Small RNA测序及其应用,miRNA是调控基因表达的一种普遍方式,俄克拉荷马州立大学，生物化学与分子生物学系对逆境条件干旱、高盐和正常条件下的水稻4周幼苗进行miRNA测序三种处理分别得到102,876、54,016 和174,530 测序序列(43003、80990和58781个miRNAs),利用高通量测序鉴定水稻miRNA,目前水稻中公布的miRNA家族为53个，鉴定了23种新的miRNA6种新的miRNA为单子叶植物特有的miRNA

19、预测了40个候选miRNA,利用高通量测序技术鉴定水稻miRNA,单子叶植物特有的miRNA,预测了9种新发现miRNA的20个靶点分析miRNA的表达模式，发现特异性表达的miRNA，而保守的miRNA是最容易检测到的,利用高通量测序技术鉴定水稻miRNA,山东农科院对正常培养两周的花生苗的根、茎、叶进行small RNA分析测序共获得6005941条测序序列,利用高通量测序技术鉴定花生miRNA,small RNA的长度主要为24bp鉴定了14个花生特有的新的miRNA和75个预测的miRNA特有的miRNA表达量低于保守miRNA，其表达具有组织特异性或者只在特定的发育阶段表达。,利用高

20、通量测序技术鉴定花生miRNA,Small RNA长度分布,保守的miRNA家族,Small RNA的生物信息学分析和应用领域,分类鉴定：miRNA,siRNA和piRNA和其它Small RNA注释新的miRNA预测miRNA表达模式分析共有和特有Small RNA分析miRNA的表达模式聚类分析miRNA靶基因预测已知miRNA的家族分析,Small RNA的系统识别和鉴定Small RNA的进化分析Small RNA参与细胞分化和发育的功能分析Small RNA药物、biomarker及药物靶点的研究Small RNA参与生命调节的研究Small RNA与疾病发生的关系,高通量测序在组学中的应用,从头测序,基因组重测序,转录组测序,Small RNA测序,Lister et al.Current Opinion in Plant Biology(2009)12:107,感谢您的选择与支持,