酶的生产与分离纯化.ppt

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1、第二章酶的生产与分离纯化,第一节 酶的发酵生产第二节 酶的纯化第三节 酶纯度的评价第四节 酶的剂型与保存,第二章 酶的生产与分离纯化,第一节 酶的发酵生产,一、产酶菌株的获得二、酶生产的发酵技术,第二章 酶的生产与分离纯化,一、产酶菌株的获得,1.产酶菌株用于发酵生产的细胞需具备条件：酶产量高。通过各种育种。容易培养和管理。培养条件易于实现和控制。产酶稳定性好。不易退化。利于酶的分离纯化。细胞及其他杂质可分离。安全可靠。使用的细胞及其代谢产物安全无毒。,第二章 酶的生产与分离纯化,产酶微生物,第二章 酶的生产与分离纯化,一、产酶菌株的获得,2.产酶菌株的选育微生物发酵的优点（1）种类多，并可根

2、据需求筛选最佳的产酶菌株；（2）繁殖快，利于生产进行；（3）培养易，生产成本经济；（4）可操控，连续化、自动化降低生产成本；（5）能改良，微生物具有很强的适宜能力，可通过遗传变异手段培育新的、更好的菌株，增加产品开发；,第二章 酶的生产与分离纯化,二、酶生产的发酵技术,工艺流程,第二章 酶的生产与分离纯化,二、酶生产的发酵技术,1.培养基制备碳源氮源无机盐生长因子微量元素生产培养基与菌种培养基有很大区别。,第二章 酶的生产与分离纯化,（1）工业上常用的碳源,第二章 酶的生产与分离纯化,（2）有机氮源,来源：工业上常用的有机氮源都是一些廉价的原料，花生饼 粉、黄豆饼粉、棉子饼粉、玉米浆、玉米蛋白

3、粉、蛋 白胨、酵母粉、鱼粉、蚕蛹粉、尿素、废菌丝体和酒 糟。成分复杂：除提供氮源外，有些有机氮源还提供大量的无机 盐及生长因子。例 玉米浆：可溶性蛋白、生长因子（生物素）、苯乙酸 较多的乳酸 硫、磷、等微量元素等,第二章 酶的生产与分离纯化,工业上常用的氮源及含氮量（质量分数）%,第二章 酶的生产与分离纯化,（3）无机盐及微量元素,大量元素：P、S、K、Mg、Ca、Na、Fe等。（微生物生长所需浓度在10-310-4mol/L）微量元素：Cu、Zn、Mn、Mo、Co等。（微生物生长所需浓度在10-610-8mol/L）一般微生物生长所需要的无机盐有：硫酸盐、磷酸盐、氯化物以及含有钠、钾、镁、铁

4、等金属元素的化合物。以上物质作为其生理活性物质的组成和生理活性作用的调节物。,第二章 酶的生产与分离纯化,（4）生长因子,从广义上讲，凡是微生物生长不可缺少的微量的有机物质，如氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素等均称生长因子。功能：构成细胞的组成分，促进生命活动的进行。生长因子不是所有微生物都必需的，对于营养缺陷 型才是必不可少的。有机氮源是这些生长因子的重要来源，多数有机氮源含有较多的B族维生素和微量元素及一些微生物生长不可缺少的生长因子.,第二章 酶的生产与分离纯化,第二章 酶的生产与分离纯化,二、酶生产的发酵技术,2.细胞活化与扩大培养斜面菌种培养摇瓶或茄子瓶培养一级种子的培养二级种子的培养 发

5、酵罐培养,第二章 酶的生产与分离纯化,第二章 酶的生产与分离纯化,二、酶生产的发酵技术,3.发酵工艺调节pH调节首先需要考虑和试验发酵培养基的基础配方，使它们有个适当的配比，使发酵过程中的pH值变化在合适的范围内。（1）调节好基础料的pH。基础料中若含有玉米浆，pH呈酸性，必须调节pH。若要控制消后pH在6.0，消前pH往往要调到6.56.8。,第二章 酶的生产与分离纯化,二、酶生产的发酵技术,（2）在基础料中加入维持pH的物质。如代谢产酸物质：葡萄糖（产酮酸）、（NH4)2SO4 代谢产碱物质：NaNO3、尿素 缓冲剂：CaCO3、磷酸缓冲液等生理酸、碱性物质：(NH4)2SO4 2NH3+

6、2H2SO4 NaNO3+4H2 NH3+2H2O+NaOH,第二章 酶的生产与分离纯化,二、酶生产的发酵技术,（3）、通过补料调节pH在发酵过程中根据糖、氮消耗需要进行补料。在补料与调pH没有矛盾时采用补料调pH如 调节补糖速率；消泡剂(如豆油)的个别情况下，还可采用提高空气流量来加速脂肪酸的代谢，以 调节pH 当NH2-N低，pH低时补氨水；当NH2-N低，pH高时补(NH4)2SO4 当补料与调pH发生矛盾时，加酸 碱调pH,第二章 酶的生产与分离纯化,二、酶生产的发酵技术,3.发酵工艺调节温度调节控制温度对发酵的影响影响微生物的生长影响各种酶的反应速率改变菌体代谢的合成的方向影响发酵液

7、的物理性质,第二章 酶的生产与分离纯化,温度影响微生物的生长,第二章 酶的生产与分离纯化,温度影响反应速率,发酵过程的反应速率实际是酶反应速率，酶反应有一个最适温度。阿累尼乌斯方程式,k-反应速度常数，1/s；A-阿累尼乌斯常数，1/s;R-气体常数（1.987x4.187J/K mol);T-热力学温度，K（0=273K);E-活化能，J/mol;e-2.718,则：随着温度升高酶反应速度增加,第二章 酶的生产与分离纯化,温度对合成的方向的影响,例：四环素发酵中金色链霉菌同时能产生金 霉素。低于30 合成金霉素能力较强。温度提高合成四环素的比例也提高。达到35则只产生四环素而金霉素合成几乎停

8、止。又如：赭曲霉10 20 发酵时，有利于合成青霉素28 时，则有利于合成赭曲霉素。,第二章 酶的生产与分离纯化,温度对发酵液的物理性质产生影响,影响发酵液的黏度氧在发酵液中的溶解度和传递速率某些基质的分解速率进而影响发酵动力学特征和产物的生物合成,第二章 酶的生产与分离纯化,发酵过程中最佳温度的选择,发酵前期：由于菌量少，发酵目的是要尽快达到大量的菌体，取稍 高的温度，促使菌的呼吸与代谢，使菌生长迅速；发酵中期：菌量已达到合成产物的最适量，发酵需要延长中期，从 而提高产量，因此温度要稍低一些，可以推迟衰老。因 为在稍低温度下氨基酸合成蛋白质和核酸的正常途径关 闭得比较严密有利于产物合成。发酵

9、后期：产物合成能力降低，延长发酵周期没有必要需提高温 度，刺激产物合成到放罐。,第二章 酶的生产与分离纯化,发酵热和温度的控制,发酵热Q发酵=Q生物+Q搅拌 Q蒸发 Q辐射产热因素：生物热、搅拌热散热因素：蒸发热、辐射热温度的控制 通过冷却将显热进行热交换，以保持最佳发酵温度 发酵罐的冷却装置：夹套（10M3以下）盘管（蛇管）列管 喷淋,冷媒：冷水 冷盐水 氨建立冷冻站,第二章 酶的生产与分离纯化,二、酶生产的发酵技术,3.发酵工艺调节溶解氧的调节控制p12,p16微生物的需氧氧在水中的溶解度比葡萄糖要小约6000倍左右(氧在水中的饱和度约为0.25mmol/L)。许多发酵的生产能力受到氧利用

10、限制，因此氧成为影响发酵效率的重要因素。,第二章 酶的生产与分离纯化,描述微生物需氧的物理量p12,KO2好氧速率（摄氧率），单位时间内单位 体积的发酵液所需要的氧量；mmol O2/（Lh）。QO2 细胞呼吸强度，单位重量细胞在单位时间耗氧量；mmol O2/（g细胞h）。C0 细胞浓度，单位体积培养液中细胞的量；g细胞/L KO2=QO2.C0,第二章 酶的生产与分离纯化,第二章 酶的生产与分离纯化,临界溶氧浓度,Cr:临界溶氧浓度,指不影响呼吸所允许的最低溶氧浓度。,发酵液中有0.22 mmol/L,第二章 酶的生产与分离纯化,氧饱和度,定义：氧饱和度发酵液中氧的浓度/临界溶氧溶度对于微

11、生物生长，只要控制发酵过程中氧饱和度1问题：一般微生物的临界溶氧浓度很小，是不是发酵过程中氧很容易满足？例：某微生物的摄氧率0.052 mmol/（LS），发酵液中有0.22 mmol/L 0.22/0.052=4.8秒由于产物的形成和菌体最适的生长条件，常常不一样：头孢菌素 卷须霉素生长 5%(相对于饱和浓度）13%产物 13%8%,第二章 酶的生产与分离纯化,溶氧对发酵的影响,例：天冬酰胺酶的发酵前期好气培养，后期转为厌气培养。时机：当溶氧浓度降到45%时，从好气转为厌气，酶活力可提高6倍。,第二章 酶的生产与分离纯化,溶氧曲线,谷氨酸,每种产物发酵的溶氧浓度变化都有自己的规律,第二章 酶

12、的生产与分离纯化,发酵过程中溶氧变化异常原因,（1）污染好气性杂菌，大量溶氧被消耗，反之下降。（2）菌体代谢发生异常，需氧要求增加。（3）搅拌功率变小，搅拌速度变慢或停止。（4）消泡剂加入过多、闷罐等。污染烈性噬菌体：影响最为明显，生产菌尚未裂解前，呼吸已受到抑制，溶氧上升，直到菌体破裂后，完全失去呼吸能力，溶氧直线上升。,第二章 酶的生产与分离纯化,微生物需氧与供氧,需氧KO2好氧速率（摄氧率），单位时间内单位 体积的发酵液所需要的氧量；mmol O2/（Lh）。供氧OTR=kLa(c-c)kLa体积溶氧系数，单位：1/h;或kd经验公式：,第二章 酶的生产与分离纯化,供氧的控制p16,(1

13、)改变通气速率（增大通气量）氧传递系数kLa是随空气量(空气的线速率)的增加而增大的。在低通气量的情况下，增大通气量对提高溶氧浓度有十分显著的效果。在空气流速已经十分大的情况下，再增加通气速率，作用便不明显，反而此时会产生某些副作用。比如：泡沫的形成、水分的蒸发、罐温的增加以及杂菌几率增加等。(2)改变搅拌速度增大搅拌转速，可以增大（PV），即搅拌功率，可以提高kLa；当搅拌转速增加到一定程度时，将不会增加，若搅拌转速过大，还会由于剪切力作用，打碎菌体，促使菌体自溶，增加泡沫等。,第二章 酶的生产与分离纯化,(3)改变气体组成中的氧分压用通入纯氧方法来改变空气中氧的含量，提高了C*值，因而提高

14、了供氧能力。纯氧成本较高，但对于某些发酵需要时，如溶氧低于临界值时，短时间内加入纯氧是有效而可行的。但有可能造成细胞氧中毒。,供氧的控制,第二章 酶的生产与分离纯化,(4)改变罐压增加罐压实际上就是改变氧的分压pO2来提高C*，从而提高供氧能力，但此法并不十分有效。主要原因是：提高罐压就要相应的增加空气压缩机的出口压 力，也就是增加了动力消耗。发酵罐的强度也要相应增加提高罐压后，产生的CO2溶解量也要增加，会 使培养液的pH值发生变化，这些对菌体生产都 极为不利。,供氧的控制,第二章 酶的生产与分离纯化,(5)改变发酵液的理化性质在发酵过程中,菌体本身的繁殖及代谢可引起发酵液性质不断改变,因而

15、显著地影响到氧的溶解速率，而且由于发酵液中菌丝浓度所引起的表观粘度的增加，可使通气速率下降。如果培养基性质为限制氧传递因素时，就根据具体情况对培养液的某一物理性质所作改造，例如补加无菌水，改变培养基的成分等都可以改善通气效果，以适应菌的正常生长。,供氧的控制,第二章 酶的生产与分离纯化,（6）加入传氧中间介质氧载体向发酵液中加入少量的水不溶性另一相，氧在这一液相中具有比水中高得多的溶解度.如常用的正十二烷，这类物质又称氧载体：作为非连续相，在搅拌的气液体系中被分散成比气泡小得多的微滴，附着在气泡表面并在气泡水界面之间形成一层薄膜，使氧气通过水膜溶入水相主流的推动力（氧浓度差）增大，相应提高了传

16、氧速率。,供氧的控制,第二章 酶的生产与分离纯化,二、酶生产的发酵技术,4.提高酶发酵产量的方法（1）酶的合成调节机制诱导合成调节酶合成的反馈阻遏分解代谢对酶合成的阻遏作用酶合成的细胞膜通透性调节（2）通过育种提高酶产量自然选育诱变育种基因重组（3）其他提高酶产量的方法改变碳氮比添加产酶促进剂添加阻遏物,第二章 酶的生产与分离纯化,（1）酶的合成调节机制p12,1)诱导合成调节乳糖缺乏时乳糖存在时,第二章 酶的生产与分离纯化,1961年，法国科学家莫诺（JLMonod，1910-1976）与雅可布（FJacob）发表“蛋白质合成中的遗传调节机制”一文，提出操纵子学说，开创了基因调控的研究。四年

17、后的1965年，莫诺与雅可布即荣获诺贝尔生理学与医学奖。1969年，贝克维斯（JRBeckwith）从大肠杆菌的DNA中分离出乳糖操纵子，完全证实了雅可布和莫诺的模型。,第二章 酶的生产与分离纯化,乳糖操纵子对指导酶生产应用的实际意义,采用现代诱变技术使细胞中的调节基因发生突变，致使调节基因不能转录翻译产生阻遏蛋白，诱导酶变成组成酶，RNA聚合酶便能起作用、操纵子便能持久地开启，并连续产生-半乳糖苷酶。另一种组成突变体为变异的操纵基因，它不易因阻遏蛋白的作用而失活，从而导致操纵基因开放而连续产生酶。在诱导酶合成时加入诱导物以利于诱导酶的合成，食品工业应用的酶包括淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶、葡萄糖

18、异构酶、-半乳糖苷酶等均属诱导酶，根据上述原理，在合成时最好的诱导物为该酶的作用底物或其结构类似物。,第二章 酶的生产与分离纯化,结构类似物,乳糖的结构类似物1,6-半乳糖异丙基-D-硫代半乳糖苷（IPTG）甲基-D-半乳糖等如：葡萄糖异构酶（或称木糖异构酶），若在培养基中加入0.02%木糖能诱导合成该酶。实际生产上，为降低成本也可采用廉价的玉米芯的降解产物来代替。,第二章 酶的生产与分离纯化,（1）酶的合成调节机制,2）酶合成的反馈阻遏 是指酶作用的终产物对酶合成产生阻遏作用。当有终产物或共阻遏物存在时，使它与立体阻遏物结合并与操纵基因结合，致使RNA聚合酶停止作用，使操纵基因关闭，酶合成受

19、阻。,第二章 酶的生产与分离纯化,反馈阻遏机制实践意义,设法从培养基中除去终产物，以消除反馈阻遏。如:生产蛋白酶的枯草芽孢杆菌培养基中含有氨基酸时产生很少量的蛋白酶，除去氨基酸，便可大大提高蛋白酶的产量。此外，限制培养基中氨的含量或限制末端产物在细胞内的积累，也可增加酶的产量。向培养基中加入代谢途径的某个抑制因子切断代谢途径通路。例：组氨酸对组氨酸合成途径中的10种酶的生物合成均起反馈作用。如果加入抑制物-噻唑丙氨酸，便能使酶合成产量提高30倍。,第二章 酶的生产与分离纯化,（1）酶的合成调节机制,3）分解代谢对酶合成的阻遏作用（中间产物阻遏）指被菌体迅速利用的底物或其分解产物对许多酶（降解酶

20、、合成酶）合成的抑制作用。根据分解产物的不同，又分为碳分解产物阻遏和氮分解产物阻遏，如“葡萄糖效应”和“铵阻遏”。,第二章 酶的生产与分离纯化,葡萄糖效应,葡萄糖和乳糖同时存在，细菌便会自动优先利用葡萄糖。启动基因由环腺苷酸启动，而环腺苷酸能被葡萄糖所抑制。RNA聚合酶-环腺苷酸结合不到位点上，使无法转录。由此可知，结构基因同时受两个开关基因操纵基因与启动基因的调控。只有当这两个开关都处于开启状态时，结构基因才能活化。,第二章 酶的生产与分离纯化,降解物,活化蛋白,第二章 酶的生产与分离纯化,葡萄糖的大量存在，降低了胞内 cAMP 浓度：葡萄糖抑制腺苷酸环化酶活性，降低 cAMP 生成：ATP

21、 cAMP+Pii？葡萄糖降解物引起 消耗胞内 cAMP：cAMP+H2O ADP AMP结果，启动子上没有cAMPCRP复合物结合，使得RNA聚合酶也无法结合到启动子的位点上，结构基因不能转录和表达。,第二章 酶的生产与分离纯化,铵阻遏,氮分解产物的调节作用指的是被菌体迅速利用的氮源（特别是铵）能阻抑某些参与含氮化合物代谢的酶的合成。如：在初级代谢中，它能阻遏许多芽孢杆菌的蛋白酶的合成通常受到 NH4+阻遏的酶有：亚硝酸还原酶、硝酸还原酶、固氮酶、乙酰胺酶、脲酶、黄嘌呤脱氢酶、组氨酸酶、天冬酰胺酶等。,第二章 酶的生产与分离纯化,（1）酶的合成调节机制,诱导型操纵子；阻遏型操纵子；阻遏型操纵

22、子形式末端产物或终产物阻遏；分解代谢产物阻遏（中间产物）；,第二章 酶的生产与分离纯化,（1）酶的合成调节机制,4）酶合成的细胞膜通透性调节微生物的细胞膜对于细胞内外物质的运输具有高度选择性。采取生理学或遗传学方法，可以改变细胞膜的透性，使细胞内的代谢产物迅速渗漏到细胞外，这种解除末端产物反馈抑制作用的菌株，可以提高发酵产物的产量。a.生物素亚适量机制：生物素是合成脂肪酸的关键酶-乙酰CoA 羧化酶的辅酶，亚适量的生物素直接抑制膜的合成或使膜缺损。,第二章 酶的生产与分离纯化,b.油酸缺陷型、甘油缺陷型油酸是一种含有一个双键的不饱和脂肪酸（C18），是细胞膜磷脂中的重要脂肪酸。油酸缺陷型因不能

23、合成油酸而使细胞膜缺损，细胞膜的通透性加大。甘油缺陷型菌株的细胞膜中磷脂含量比野生型菌株低，易造成谷氨酸大量渗漏。即使是在生物素或油酸过量的情况下，也可以获得大量谷氨酸。c.控制细胞壁如：加青霉素，抑制细胞壁肽聚糖合成中肽链的交联，从而改变细胞壁的通透性。,第二章 酶的生产与分离纯化,二、酶生产的发酵技术,4.提高酶发酵产量的方法（1）酶的合成调节机制诱导合成调节酶合成的反馈阻遏分解代谢对酶合成的阻遏作用酶合成的细胞膜通透性调节（2）通过育种提高酶产量自然选育诱变育种基因重组（3）其他提高酶产量的方法改变碳氮比添加产酶促进剂添加阻遏物,第二章 酶的生产与分离纯化,4.提高酶发酵产量的方法,（2

24、）通过基因突变（育种）提高酶产量A.自然选育B.诱变育种C.基因重组D.其他方法,第二章 酶的生产与分离纯化,A.自然选育与诱变育种,a.自然选育根据菌种的自发突变而进行菌种筛选过程。突变频率低。b.诱变选育通过诱变剂处理，突变频率提高，随机性大，如果 筛选方法得当，也有可能获得好的变异株。目的：提高产量 提高质量 增加品种 改善工艺条件,第二章 酶的生产与分离纯化,自然选育,确定出发菌株 菌种的纯化选优 出发菌株的性能鉴定同步培养 制备单细胞（或单孢子）悬液 活菌浓度测定诱变剂的选择与确定诱变剂量的预试验 诱变处理 计形态变异的菌落数，计算突变率 平板分离 挑取疑似突变菌落纯培养 突变体的初

25、步筛选 用简单快捷的方法重复筛选 摇瓶发酵试验选出突变体（根据情况进行生产试验或重复诱变处理）,诱变育种,第二章 酶的生产与分离纯化,诱变剂,物理诱变剂,化学诱变剂,烷化剂碱基类似物吖啶化合物,紫外线X射线射线快中子激光射线,诱变剂的种类及选择,诱变剂处理方式可分为:单因子处理和复因子处理，复因子处理一般先用弱诱变因子，后用强诱变因子,第二章 酶的生产与分离纯化,第二章 酶的生产与分离纯化,1）高产突变株的选育,出发菌株,绝大多数个体死亡,少数存活,多数未变少数突变,多数负变少数正变,多数变幅小少数变幅大,多数不宜投产少数宜投产,存活率 突变率 正变率 高产率 投产率,诱变,平板分离,纯培养,

26、初筛,重筛,变异幅度广 产量高的出发菌株 对诱变剂敏感性大,第二章 酶的生产与分离纯化,产酶高产菌初筛,透明圈法显色圈法摇瓶培养,第二章 酶的生产与分离纯化,透明圈法,在平板培养基中加入溶解性较差的底物，使培养基混浊。能分解底物的微生物会在菌落周围产生透明圈。该法在分离水解酶产生菌时采用较多，产有机酸菌也可用。如：脂肪酶、淀粉酶、蛋白酶、核酸酶产生菌都会在含有底物的选择性培养基平板上形成透明圈。圈的大小初步反应该菌株利用底物的能力。,第二章 酶的生产与分离纯化,-淀粉酶的筛选,第二章 酶的生产与分离纯化,应用含酪蛋白的培养基,第二章 酶的生产与分离纯化,筛选半纤维素酶 划线产透明圈的细菌点种,

27、第二章 酶的生产与分离纯化,变色圈法,对于一些不易产生透明圈产物的产生菌，可在底物平板中加入指示剂或显色剂，使所需微生物能被快速鉴别出来。如：筛选果胶酶生产菌时，用含有0.2%果胶为唯一碳源的培养基平板，待菌落长成后，加入0.2%刚果红染色液4h，具有分解果胶能力的菌落周围便会出现绛红色水解圈。刚果红的变色范围为pH35。在pH5时，它以磺酸钠形式存在，显红色；在pH3时，它以邻醌式内盐的结构存在，显蓝色。果胶酶水解果胶形成游离的半乳糖醛酸,第二章 酶的生产与分离纯化,第二章 酶的生产与分离纯化,产酶高产菌复筛,经初筛后可简便快速淘汰8590%不符合要求的微生物，剩下较好菌株进行摇瓶复筛。通常

28、一株要重复35个瓶，培养后的发酵液采用精确分析方法测定：蛋白酶用分光光度计；脂肪酶用NaOH滴定等。最后选出23株。,第二章 酶的生产与分离纯化,第二章 酶的生产与分离纯化,2）组成型突变株的选育,组成型突变株：是指操纵基因或调节基因突变引起酶合成诱导机制失灵。菌株不经诱导也能合成酶；或不受终产物阻遏的调节突变型。突变株特性：有的是调节基因突变，致使不能形成活性化的阻抑物；有的是操纵基因突变，丧失了和阻抑物结合的亲和力。目的：可以利用一些易同化碳源或价廉易得的碳源为基质，生产所需的诱导酶类。,第二章 酶的生产与分离纯化,组成型选育方法：,a.限量诱导物恒化培养野生型的菌种经诱变后移接到低浓度诱

29、导物的恒化器中连续培养。由于该培养基中底物浓度低到对野生型菌株不发生诱导作用，所以诱导型的野生型菌株不能生长，而突变株由于不经诱导就可以产生诱导酶而利用底物，因而很快得以生长成为组成型菌株。培养过程正确控制培养时间，使组成型突变株得以繁殖，而诱导型菌株则被淘汰。例如在低浓度乳糖恒化器上连续培养大肠杆菌，其中组成型突变株不要加诱导物也能合成-半乳糖苷酶。,第二章 酶的生产与分离纯化,组成型选育方法：,b.循环培养要解除诱导的菌株，移接到含有诱导物和不含诱导物的培养基上交替连续循环培养。由于组成型突变株在两个培养基上都能产酶，生长逐渐占优势。例如把诱导型的野生菌株经诱变剂处理后，先移接到含葡萄糖培

30、养基中进行培养。这时，野生型菌株和组成型突变体都能生长。将此培养物移接到含诱导物培养基中培养，此时组成型菌株立即开始生长，而诱导型野生菌株须经一段停留时间(诱导酶合成时间)才开始生长，只要细心控制在含诱导物培养基中培养时间，反复交替培养，组成型逐渐占优势，诱导型却被淘汰。,第二章 酶的生产与分离纯化,组成型选育方法：,c.鉴别性培养基的利用如将诱变孢子悬液涂布在甘油作惟一碳源的平板上，培养后长出菌落。然后在菌落上喷上O-硝基苯酚-D半乳糖苷(ONPG)，组成型成黄色，诱导型呈白色。这是由于组成突变株在没有诱导底物存在时仍能产生-半乳糖苷酶，将无色试剂水解，放出O-硝基苯酚，因而很容易挑选。此方

31、法为目测法，可免去上述几种方法的浓缩富集过程。,第二章 酶的生产与分离纯化,组成型选育方法：,d.筛选经诱变剂处理后的菌体移接到含有诱导能力低，但能作为良好碳源的诱导物的培养基中培养，突变体能良好生长，野生型不能生长。例如利用苯-半乳糖(PG)筛选-半乳糖苷酶组成型突变株。,第二章 酶的生产与分离纯化,3）抗分解代谢阻遏突变株的筛选,a.循环培养法将诱变剂处理后的微生物移接到快速利用的碳源和慢速利用的碳源培养基上进行交替培养，然后筛选需要的突变株。例如，将大肠杆菌先在葡萄糖培养基中培养，后又转移到乳糖等慢速利用的碳源培养基上培养，出现一个生长的延缓期，此时由于突变株解除了阻遏现象，在葡萄糖培养

32、基上生长时已合成乳糖分解酶，故在含乳糖培养基上很快就能形成菌落，而野生型菌株转接到乳糖培养基中，需要花去一定时间去合成分解乳糖酶，其生成速度比突变株慢得多，控制培养时间，可以筛选到目的变株,第二章 酶的生产与分离纯化,3）抗分解代谢阻遏突变株的筛选,b.鉴别性培养基假若筛选抗乳糖分解阻遇的菌株，把诱变后的菌体分离在含有葡萄糖的琼脂平板上，长成菌落后，喷上ONPG，抗分解阻遏的菌落呈显黄色，野生型是白色。,第二章 酶的生产与分离纯化,3）抗分解代谢阻遏突变株的筛选,c.特殊氮源用葡萄糖为碳源，受阻遏酶的底物作为惟一氮源配制成培养基，连续移接诱变后的产气杆菌(Aerobacters aerogen

33、es)，可以选出不受葡萄糖阻遏的组氨酸酶突变株。由于野生型菌株合成组氨酸酶被葡萄糖阻遏，而突变株则可产生组氨酸酶，能迅速生长形成菌落。,第二章 酶的生产与分离纯化,3）抗分解代谢阻遏突变株的筛选,d葡萄糖结构类似物用于筛选抗分解阻遏突变体的葡萄糖结构类似物有2-脱氧葡萄糖(以下称2-dG)和3-O-甲基葡萄糖(以下称3mG),第二章 酶的生产与分离纯化,3）抗分解代谢阻遏突变株的筛选,2-dG和3-mG具有以下特性：结构与葡萄糖类似，既不被微生物同化，也不能作为微生物生长的碳源；它们不被微生物代谢，也不阻抑微生物生长，在葡萄糖培养基中添加低浓度2-dG或3-mG，微生物可以正常地生长；由于它们

34、的结构类似葡萄糖，和葡萄糖一样会阻遏诱导酶的合成，其阻遏作用甚至比葡萄糖还要强。正因为2-dG和3-mG既不被微生物代谢又具有分解阻遏作用，因此应用含2-dG或3-mG的琼脂培养基平板可筛选抗分解阻遏的突变株。,第二章 酶的生产与分离纯化,例如淀粉诱导桔林油脂酵母(Lipomyces kononenkoae)合成淀粉酶，由于2-dG会阻遏此酶的诱导合成，故将酵母涂布在含玉米淀粉、酵母膏、蛋白胨及含有0012-dG的琼脂平板上。培养后野生型菌株不能合成-淀粉酶，也就不能分解利用淀粉，因而在这种平板上不能产生菌落，仅抗2-dG突变株才能形成菌落并在其周围形成透明圈。,第二章 酶的生产与分离纯化,又

35、如：纤维素诱导木霉合成纤维素酶，将木霉涂布在含酸膨胀纤维素、蛋白胨、无机盐、胆汁、Phosphon-D(防菌落扩张剂)及一定量2-dG的琼脂平板上。野生型菌株不能合成纤维素酶，不能分解纤维素，因而不能形成菌落，仅抗2-dG才能形成菌落并在其周围形成透明圈。,第二章 酶的生产与分离纯化,(4)无孢子突变株的筛选,细菌-淀粉酶、-淀粉酶以及蛋白酶的生物合成与芽孢的形成有密切关系，筛选无孢子突变株有可能增加这些酶的合成与分泌。方法：用氯仿熏蒸、斜面培养或镜检来确证。如：将生成的菌落用氯仿熏蒸，凡无孢子的菌株经过处理后会死亡，因而可从对照平板上选出无孢子突变株。,第二章 酶的生产与分离纯化,（5）药物

36、抗性突变株的筛选,某些抗生素可干扰细胞壁的合成，抗性株的细胞结构可能发生变化，抗药性和产酶能力之间可能存在着某些联系。例如：枯草杆菌衣霉素抗性突变株、其-淀粉酶产量可提高5倍。地衣芽孢杆菌还丝氨酸抗性突变株、其产酶能力提高200倍。筛选利福平抗性的蜡状芽孢杆菌突变可得到-淀粉酶的高产菌种。,第二章 酶的生产与分离纯化,4.提高酶发酵产量的方法,C.基因重组提高产酶产量基因工程是在分子水平上，通过人工方法将外源基因引入细胞而获得具有新遗传性状细胞的技术。基因工程又称克隆技术或种族DNA技术。广泛应用于酶制剂、食品添加剂、抗生素、维生素、氨基酸和各种药物的生产。,第二章 酶的生产与分离纯化,基因工

37、程操作,目的基因分离；载体分离；限制性内切酶的应用；基因重组；细胞转化和基因表达。,第二章 酶的生产与分离纯化,如：Palav等人采用PVB10载体，将液化淀粉芽孢杆菌（B.amyloliquefaciens）的-淀粉酶基因克隆到枯草杆菌中，获得抗卡那霉素转化株，其淀粉酶活力比野生型原始菌株高500倍。20世纪80年代，将制造干酪的凝乳酶是把小牛胃中的凝乳酶基因克隆至细菌或真菌中进行表达，此技术在20实际80年代初就已成功。1990年美国FDA批准该凝乳酶上市，为世界干酪生产解决了酶源问题。,第二章 酶的生产与分离纯化,生产面包的酵母（Saccharomycescerevisiae）也是采用基

38、因克隆技术改造的。其方法：把具有优良特性的酶基因克隆至该酵母中，从而使该酵母含有的麦芽糖透性酶和麦芽糖酶的活力比原始面包酵母高，是面包加工中产生的气体增加，面包发酵膨发性增加，成品特别松软可口，也可延长产品的货架期。基因工程应用于改良产酶菌株性能已较为普遍，其他方法（如细胞融合技术等）也得到应用。,第二章 酶的生产与分离纯化,D.其他提高酶产量的方法,添加产酶促进剂促进剂对发酵起一定促进作用的物质，既不属于营养物质又不是前体，但加入后却能提高产量的添加剂。,第二章 酶的生产与分离纯化,促进剂,有些促进剂本身是酶的诱导物；有些促进剂是表面活性剂，可改善细胞的透性，改善细胞与氧的接触从而促进酶的分

39、泌与生产；有些促进剂的作用是沉淀或螯合有害的重金属离子。,第二章 酶的生产与分离纯化,三、食品用酶发酵生产举例,淀粉酶糖化酶蛋白酶（酸性、中性、碱性）脂肪酶果胶酶,第二章 酶的生产与分离纯化,三、食品用酶发酵生产举例,淀粉酶分为四大类p22：1.-淀粉酶2.-淀粉酶3.葡萄糖淀粉酶4.解枝酶（异淀粉酶）此外：环化糊精生产酶C4、C6生成酶-葡萄糖苷酶（葡萄糖苷转移酶）,第二章 酶的生产与分离纯化,三、食品用酶发酵生产举例,-淀粉酶中国淀粉糖工业使用的液化酶BF-7658、美国的Tenase等都属于枯草杆菌。地衣芽孢杆菌ATCC9789，用射线、亚硝基胍（NTG）、紫外线单独或交叉处理7次后，用

40、其生产耐热性-淀粉酶活性增加25倍，适于工业化大生产。枯草杆菌BF-7658所产的淀粉酶是中国产量最大、用于最广的一种液化型-淀粉酶。经多次诱变，酶活提高50%。,第二章 酶的生产与分离纯化,1.-淀粉酶的生产,枯草杆菌BF-7658培养工艺条件：培养基：,第二章 酶的生产与分离纯化,1.-淀粉酶的生产,工艺条件发酵罐：3000L；标准冷却夹套；二档圆盘弯叶涡轮；三块挡板：T：37PH：6.5r：300r/min P：0.50.8atm(1atm=101325Pa）通风量：010h:13.5m3/h;1014h:17.5m3/h 补料：基础料与补料体积比：3:1；,第二章 酶的生产与分离纯化,

41、1.-淀粉酶的生产,为了利于菌体生长产酶，避免原料中淀粉降解生成的糖过量积累而引起分解代谢阻遏，采用低浓度发酵高浓度补料。补料中豆饼粉、玉米粉的含量高达30%，为基础培养基的3.8倍。提取：盐析、有机溶剂沉淀、淀粉吸附三种方法。最常用的是用硫酸铵盐析。硫酸铵溶解度较大。,第二章 酶的生产与分离纯化,2.糖化酶的生产,1）菌种：主要为根霉、曲霉。2）糖化酶工艺斜面培养基：察氏琼脂培养基，麸皮，31，取孢子。种子培养：玉米粉4%，豆饼粉3%，麸皮1%等。自然pH。发酵培养：玉米粉10%，豆饼粉3%，麸皮1%等。T：3032PH：4.0r：180r/min P：0.5atm通风比：012h:0.5V

42、Vm;1224h:0.8VVm;2484h:1VVm;84h后:0.8VVm,第二章 酶的生产与分离纯化,2.糖化酶的生产,有关pH的控制随着黑曲霉的生长，pH逐步下降。1640h原料淀粉均转化成还原糖并逐渐形成柠檬酸使pH下降。当pH低于3时，菌体生长缓慢。当pH高于5时，菌体易自溶。控制pH在4.0（左右），也是原料糖化的适宜条件，即使得原料充分糖化，又有利于菌体繁殖。酶活性比没有pH控制的增加46.7%。,第二章 酶的生产与分离纯化,2.糖化酶的生产,有关补料的控制为了提高溶氧，可提高搅拌速度和加大通风量，但在实际生产中不易改变。中间补料的方法可间接提高溶氧。实际操作：基础料与补料总体积

43、比3:1，豆饼粉和玉米粉基础料与补料比为5:1。接种后1648h之间，视发酵液中pH和菌体生长情况进行23次补料。由于补料操作，使通风量相对增大。,第二章 酶的生产与分离纯化,3.蛋白酶的生产,蛋白酶分类工业生产上应用的蛋白酶，主要是内肽酶。,按降解方式,按作用的最适pH,按其活性中心,端肽酶,内肽酶,酸性蛋白酶,碱性蛋白酶,中性蛋白酶,丝氨酸蛋白酶,金属蛋白酶,巯基蛋白酶,天冬氨酸蛋白酶,第二章 酶的生产与分离纯化,蛋白酶,酸性蛋白酶的最适PH从2左右(胃蛋白酶)到4左右.从酶的活力-PH曲线分析,在酶的活性部位中含有一个或更多的羧基.这一类蛋白酶中研究最彻底的是胃蛋白酶.碱性蛋白酶是由选育

44、的地衣芽孢杆菌发酵而得，主要成分为枯草杆菌蛋白酶，是一种内切酶，催化部位为丝氨酸，分子量约为27300。碱性蛋白酶外观为褐色粉末，有酵曲的特殊臭味，适宜于在40-55、PH9-11的碱性条件下使用，超出以上范围酶的活力下降。重金属离子和阳离子表面活性剂对其活力有抑制作用，中性蛋白酶水解温度 35 55 PH 值：6.0 7.5,第二章 酶的生产与分离纯化,3.蛋白酶的生产,酸性蛋白酶生产菌种以曲霉为主，另有青霉、毛霉等酸性蛋白酶是生产历史较长，工艺比较成熟并为较典型的一种蛋白酶。酸性蛋白酶可用作消化剂、消炎剂、啤酒澄清剂，也可供毛皮软化工业等应用。黑曲霉AS 3.350酸性蛋白酶的生产工艺,第

45、二章 酶的生产与分离纯化,3.蛋白酶的生产,茄子瓶斜面菌种种子罐发酵罐盐析55%(NH4)2SO4滤袋压榨硫酸铵废液作农肥装盘烘干磨粉包装AS 3.350酸性蛋白酶生产工艺,第二章 酶的生产与分离纯化,3.蛋白酶的生产,发酵工艺种子和发酵培养基豆饼粉3.65、玉米粉0.625、鱼粉0.625、NH4C1 1、CaC12 0.5、Na2HPO40.2，豆饼粉或蚕蛹粉水解液10，初始pH 5.5，发酵温度均为为311，种子罐通气量为1:0.3，培养时间为26h。发酵通气量024h 1:0.25、24h48h 1:0.5、48h发酵结束1:1.0，发酵周期72h，酶活性一般可达2500一3200u/

46、mL。豆饼粉或蚕蛹粉水解液制备，取豆饼粉或蚕蛹粉100份、石灰6份和水600份，在9.8104Pa表压下，加热水解1h。,第二章 酶的生产与分离纯化,3.蛋白酶的生产,提取培养物滤去菌体，盐酸调pH至4.0以下，加硫酸铵使浓度达55，静置过夜，倾去上清，将沉淀通过压滤除去母液，于40干燥24h，烘干后进行磨粉与包装，即可得工业用粗酶制品。盐析收率在94%以上，干燥后总收率在60以上，每克酶活力为20万单位左右。在发酵液滤去菌体后用薄膜蒸发器于40浓缩3-4倍，直接作为液体酶制剂。,第二章 酶的生产与分离纯化,3.蛋白酶的生产,精制作为医用或啤酒工业用酶，则需进一步精制压滤所得的酶泥溶于pH3.6的0.005 mo1/L乳酸缓冲液中，用脱色树脂脱色(收率93)，用真空薄膜蒸发器于40浓缩2倍以上（收率90%）离子交换树脂（732、701树脂混合床）脱盐（收率90%）、喷雾干燥或冷冻干燥、磨粉，可得淡黄色乃至乳白色的粉状酶制品，酶活性为每克40-60万单位。丹宁沉淀法取也可得到具有同样酶活性的制品。,