酶工程第二章微生物发酵产酶.ppt
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1、第二章 微生物发酵产酶,酶的发酵生产,定义:经过预先设计,通过人工操作,利用微生物的生命活动获得所需的酶的技术过程,称为酶的发酵生产。酶的发酵是当今生产大多数酶的主要方法。原因:微生物的研究历史长种类多繁殖快易培养代谢能力强,优良的产酶微生物应当具备的条件,优良的产酶微生物应当具备下列条件:酶的产量高产酶稳定性好容易培养和分离利于酶的分离纯化安全可靠、无毒性等,酶的发酵生产的分类,根据微生物培养方式的不同,酶的发酵生产的可以分为:固体培养发酵液体深层发酵固定化微生物细胞发酵固定化微生物原生质体发酵等,固体培养发酵,培养基:固体或半固体,主要材料为麸皮、米糠等。举例:酒曲、酱油曲的生产目的:获得
2、淀粉酶类和蛋白酶类,以催化淀粉和蛋白质的水解优点:设备简单,操作方便缺点:劳动强度较大,原料利用率较低,生产周期较长。,举例:大曲酒的酿制全国十大名酒:贵州茅台;山西汾酒;四川泸州老窖特曲酒;陕西西凤酒;四川五粮液;四川全兴大曲酒;安徽古井贡酒;贵州遵义董酒;郎酒;剑南春。,1.霉菌 白酒生产常见的霉菌菌种:曲霉、根霉、念珠霉、青霉、链孢霉等。2.酵母菌 常见的酵母菌菌种:酒精酵母、产酯酵母、假丝酵母和白地霉等。3.细菌:常见的细菌菌种:乳酸菌、醋酸菌、丁酸菌、己酸菌。,参与白酒生产中的微生物,大曲酒生产工艺,大曲酒是采用大曲作为糖化、发酵剂,以含淀粉物质为原料,经固态发酵和蒸馏而成的一种饮料
3、酒。它的最显著特点是采用酒醅固态发酵和固态蒸馏,从而形成了中国蒸馏酒的典型风格。国外著名的白兰地、威士忌等蒸馏酒的生产,一般采用液态发酵和液态蒸馏的生产工艺。,1 大曲,大曲是以小麦、大麦和豌豆等为原料,经破碎、加水拌料、压成砖块状的曲坯后,在人工控制的温、湿度下培养而成。大曲含有霉菌、酵母、细菌等多种微生物及它们产生的各种酶,是一种多菌种的混合粗酶制剂。在酿酒过程中可形成多种多样的代谢产物,组成了各种风味成分。我国绝大部分名、优白酒都使用传统的大曲法酿制。,大曲分类(按微生物来源),传统大曲,菌种来源于大自然。强化大曲,人工接入某些特殊菌种,使大曲在糖化力、发酵力或产香方面更加突出。纯种大曲
4、,采用多菌纯种培养大曲,该大曲出酒率高,是今后发展方向。,大曲分类(按制曲温度分),高温大曲,培养制曲的最高温度在60以上,酱香型和部分浓香型大曲酒,采用此大曲。偏高温大曲,培养温度在5060之间,主要生产浓香型大曲酒。中温大曲,培养最高温度不超过50,主要生产清香型大曲酒。,大麦、豌豆(6:4),粉碎,高温润糁,粗麦粉,踩曲,曲坯,堆积培养,风干,贮存,成品,2 中温大曲生产工艺,大曲的生产工艺(Production of Daqu),水,粉碎,成型,人工踩制(By feet),机制成型(By machine),踩曲(曲坯成型)用压曲机压成砖状形(2-3kg松而不散)。,培曲阶段 Incub
5、ation of Daqu,卧曲Woqu,1.上霉Shangmei,2.晾霉Liangmei,3.潮火Chaohuo,4.大火 Dahuo,5.后火Houhuo,6.养曲Yangqu,贮 曲 Storage of Daqu,堆 曲,培 养,翻 曲 后 排 成“人”字 型,成曲贮存3个月后才能使用,3 大曲酒发酵特点,采用固态配醅发酵,发酵物料的含水量较低,常控制在55%65%;在较低温度下边糖化边发酵,保证酶和酵母的活性,有利于香味物质的形成和累积;多种微生物混合发酵,保证有益微生物正常生长繁殖和发酵代谢;固态甑桶蒸馏提取成品酒。大曲酒酿造分为清渣法和续渣法两种。,液体深层发酵,培养基:液体,
6、在生物反应器中优点:适用范围广机械化程度较高,技术管理较严格,酶的产率较高,质量较稳定,产品回收率较高。是目前发酵生产的主要方式。,固定化微生物细胞发酵固定化原生质体发酵,(后面详细介绍),一、酶生物合成的基本过程(已学多次,自学),第一节 微生物细胞中酶生物合成的调节,第一节 微生物细胞中酶生物合成的调节,二、酶生物合成的调节组成酶(constitutive enzyme):在细胞中的量比较恒定,环境因素对这些酶的合成速率影响不大。如:DNA聚合酶、RNA聚合酶、糖酵解途径的各种酶等。适应型酶(adaptive enzyme)(调节型酶 regulated enzyme):在细胞中的含量变化
7、很大,合成速率明显受到环境因素的影响。如大肠杆菌分解乳糖的酶。调节对象:适应型酶(调节型酶),二、酶生物合成的调节,调节环节:转录水平的调节转录产物的加工调节翻译水平的调节翻译产物的加工调节酶降解的调节其中,转录水平的调节对酶的生物合成是最重要的调节。,转录水平的调节操纵子学说,转录水平的调节机制1、分解代谢物阻遏作用是指某些物质(主要是指葡萄糖和其他容易利用的碳源等)经过分解代谢产生的物质阻遏某些酶(主要是诱导酶)生物合成的现象。例如:葡萄糖阻遏 半乳糖苷酶的生物合成。,转录水平的调节操纵子学说,转录水平的调节机制2、酶生物合成的诱导作用加入某些物质使酶的生物合成开始或加速进行的现象,成为酶
8、生物合成的诱导作用,简称为诱导作用。如:乳糖诱导分解乳糖相关酶的产生。,转录水平的调节机制3、酶生物合成的反馈阻遏作用又称为产物阻遏作用,是指酶催化反应的产物或代谢途径的末端产物使该酶的生物合成受到阻遏的现象。如:色氨酸对色氨酸合成途径的反馈阻遏现象。,转录水平的调节操纵子学说,三、酶生物合成的模式,微生物细胞在一定条件下培养生长,其生长过程一般经历以下四个阶段:调整期生长期平衡期衰退期根据细胞生长与酶产生的关系,可以把酶生物合成的模式分为4种类型,即:同步合成型延续合成型中期合成型滞后合成型,酶生物合成的模式,细胞在一定条件下培养生长,其生长过程一般经历调整期、生长期、平衡期和衰退期等4个阶
9、段,通过分析比较细胞生长与酶产生的关系,可以把酶生物合成的模式分为4种类型。即同步合成型,延续合成型,中期合成型和滞后合成型。,1、同步合成型,酶的生物合成与细胞生长同步进行的一种酶生物合成模式。该类型酶的生物合成速度与细胞生长速度紧密联系,又称为生长偶联型。属于该合成型的酶,其生物合成伴随着细胞的生长而开始;在细胞进入旺盛生长期时,酶大量生成;当细胞生长进入平衡期后,酶的合成随着停止。大部分组成酶的生物合成属于同步合成型,有部分诱导酶也按照此种模式进行生物合成。例如米曲霉在含有单宁或者没食子酸的培养基中生长,在单宁或没食子酸的诱导作用下,合成单宁酶(tanase)。,细胞浓度mg/ml,酶浓
10、度U/ml,1、同步合成型,特点:该类型酶的生物合成可以由其诱导物诱导生成,但是不受分解代谢物的阻遏作用,也不受产物的反馈阻遏作用。该类型酶所对应的mRNA很不稳定,其寿命一般只有几十分钟。在细胞进入生长平衡期后,新的mRNA不再生成,原有的mRNA被降解后,酶的生物合成随即停止。,2、延续合成型,酶的生物合成在细胞的生长阶段开始,在细胞生长进入平衡期后,酶还可以延续合成一段较长时间。属于该类型的酶可以是组成酶,也可以是诱导酶。例如,在黑曲霉在以半乳糖醛酸或果胶为单一碳源的培养基中培养,可以诱导聚半乳糖醛酸酶(Polygalacturonase,)的生物合成。,细胞浓度mg/ml,酶浓度U/m
11、l,细胞浓度mg/ml,酶浓度U/ml,以半乳糖醛酸为诱导物,以含有葡萄糖的果胶为诱导物,2、延续合成型,特点:延续合成型的酶其生物合成可以受诱导物的诱导,一般不受分解代谢物阻遏。mRNA相当稳定。,3、滞后合成型,此类型酶是在细胞生长一段时间或者进入平衡期以后才开始其生物合成并大量积累。又称为非生长偶联型。许多水解酶的生物合成都属于这一类型。属于滞后合成型的酶,之所以要在细胞生长一段时间甚至进入平衡期以后才开始合成,主要原因是由于受到培养基中存在的阻遏物的阻遏作用。只有随着细胞的生长,阻遏物几乎被细胞用完而使阻遏解除后,酶才开始大量合成。若培养基中不存在阻遏物,该酶的合成可以转为延续合成型。
12、该类型酶所对应的mRNA稳定性很好,可以在细胞生长进入平衡期后的相当长的一段时间内,继续进行酶的生物合成。,黑曲霉羧基蛋白酶生物合成,放线菌素D 对产酶的影响,细胞浓度mg/ml,酶浓度U/ml,酶浓度U/ml,酶浓度U/ml,30,22,不加,加入,不加,加入,4、中期合成型,该类型的酶在细胞生长一段时间以后才开始,而在细胞生长进入平衡期以后,酶的生物合成也随着停止。例如,枯草杆菌碱性磷酸酶(Alkaline phophatase,EC 3.1.3.1)的生物合成模式属于中期合成型。这是由于该酶的合成受到其反应产物无机磷酸的反馈阻遏,而磷又是细胞生长所必不可缺的营养物质,培养基中必须有磷的存
13、在。这样,在细胞生长的开始阶段,培养基中的磷阻遏碱性磷酸酶的合成,只有当细胞生长一段时间,培养基中的磷几乎被细胞用完(低于0.01mmol/L)以后,该酶才开始大量生成。又由于碱性磷酸酶所对应的mRNA不稳定,其寿命只有30 min左右,所以当细胞进入平衡期后,酶的生物合成随着停止。,细胞浓度mg/ml,酶浓度U/ml,理想的酶合成模式,酶所对应的mRNA的稳定性以及培养基中阻遏物的存在是影响酶生物合成模式的主要因素。在酶的发酵生产中,为了提高产酶率和缩短发酵周期,最理想的合成模式应是延续合成型。因为属于延续合成型的酶,在发酵过程中没有生长期和产酶期的明显差别。细胞一开始生长就有酶产生,直至细
14、胞生长进入平衡期以后,酶还可以继续合成一段较长的时间。,理想的酶合成模式,对于其他合成模式的酶,可以通过基因工程细胞工程等先进技术,选育得到优良的菌株,并通过工艺条件的优化控制,使他们的生物合成模式更加接近于延续合成型。对于同步合成型的酶,要尽量提高其对应的mRNA的稳定性,为此适当降低发酵温度是可取的措施;对于滞后合成型的酶,要设法降低培养基中阻遏物的浓度,尽量减少甚至解除产物阻遏或分解代谢物阻遏作用,使酶的生物合成提早开始;而对于中期合成型的酶,则要在提高mRNA的稳定性以及解除阻遏两方面下功夫,使其生物合成的开始时间提前,并尽量延迟其生物合成停止的时间。,第二节 产酶微生物的特点,基本要
15、求:酶的产量高容易培养和管理产酶稳定性好:不易变异退化利于酶的分离纯化安全可靠,无毒性:凡从可食部分或食品加工中传统使用的微生物生产的酶,安全!由非致病微生物制取的酶,需作短期毒性实验。非常见微生物制取的酶,需做广泛的毒性实验,包括慢性中毒实验。,(1)大肠埃希氏杆菌,简称为大肠杆菌,是最为著名的原核生物。,形态:短杆或长杆状,0.51.01.03.0 um,革兰氏阴性,运动(周毛)或不运动,无芽孢,一般无荚膜。菌落呈白色至黄白色,扩展,光滑,闪光。Escherich属菌株和大多数大肠杆菌是无害,但也有些大肠杆菌是致病的,会引起腹泻和尿路感染。大肠杆菌的名声主要因它易于在实验室操作、生长迅速,
16、而且营养要求低。应用:大肠杆菌能作为宿主供大量的细菌病毒生长繁殖大肠杆菌也是最早用作基因工程的宿主菌工业上生产谷氨酸脱羧酶、天冬酰胺酶和 制备天冬氨酸、苏氨酸及缬氨酸等,(2)醋酸杆菌(Acetobacter),菌体从椭圆至杆状,单个、成对或成链,革兰氏阴性,运动(周毛)或不运动,不生芽孢。好气。含糖、乙醇和酵母膏的培养基上生长良好。应用:有机酸(食醋等)、葡萄糖异构酶(高果糖浆)、山梨糖(维C中间体),(3)枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),直状、近直状的杆菌,周生或侧生鞭毛,革兰氏阳性,无荚膜,芽孢0.51.51.8m,中生或近中生。枯草芽孢杆菌是工业发酵的重要菌种之一。
17、生产淀粉酶、蛋白酶、5-核苷酸酶、某些氨基酸及核苷。(常作为饲料添加剂),(4)根霉(Rhizopus),分类学上属于藻状菌纲,毛霉目,根霉属。根霉因有假根(Rhizoid)而得名(假根的功能是在培养基上固着,并吸收营养)。分布于土壤、空气中,常见于淀粉食品上,可引起霉腐变质和水果、蔬菜的腐烂。代表种:米根霉(R.oryzae)黑根霉(R.nigrican)等。应用:根霉能产生一些酶类,如淀粉酶、果胶酶、脂肪酶等,是生产这些酶类的菌种。在酿酒工业上常用做糖化菌。有些根霉还能产生乳酸、延胡索酸等有机酸。,(6)曲霉(Aspergillus),分类:多数属于子囊菌亚门,少数属于半知菌亚门。分布:广
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