蛋白质理化性质、提取纯化与结构分析测定.ppt

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1、第五章 蛋白质提取纯化、理化性质分析与结构测定,本章主要内容：1.蛋白质理化性质与分析方法；2.蛋白质提取、纯化与鉴定的一般步骤；3.重组蛋白提取、纯化与鉴定的注意事项；4.蛋白质技术；5.蛋白质结构测定。,第一节 蛋白质理化性质与分析方法,一、蛋白质的两性解离和等电点二、蛋白质的呈色反应三、蛋白质的紫外吸收四、蛋白质的分子量五、蛋白质的胶体性质六、蛋白质的沉淀七、蛋白质的变性与复性,当蛋白质溶液处于某一pH值时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，净电荷为“O”，此时溶液的pH值称为该蛋白质的等电点(isoelectric point,pI)。由于各种蛋白质所含的碱性氨基酸和酸性氨基酸的数目不

2、同，因而有各自的等电点。蛋白质溶液的pH大于等电点，该蛋白质颗粒带负电荷，反之则带正电荷。蛋白质分子所带电荷的性质决定了它在电场中移动的方向。处于等电点的蛋白质颗粒，在电场中并不移动。人体体液中许多蛋白质的等电点在pH5.0左右，所以在体液中以负离子形式存在。,一、蛋白质的两性解离和等电点,二、蛋白质的呈色反应,(一)茚三酮反应(Ninhydrin Reaction)-氨基酸与水化茚三酮(苯丙环三酮戊烃)作用时，产生蓝色反应。蛋白质是由许多-氨基酸组成的，故也呈此颜色反应。(二)双缩脲反应(Biuret Reaction)蛋白质在碱性溶液中与硫酸铜作用呈现紫红色，称为双缩脲反应。凡分子中含有两

3、个以上CONH键的化合物，都呈此反应。(三)米伦反应(Millon Reaction)蛋白质溶液中加入米伦试剂(亚硝酸汞、硝酸汞及硝酸的混合液)，蛋白质首先沉淀，加热则变为红色沉淀。此外，蛋白质溶液还可与酚试剂、乙醛酸试剂、浓硝酸等发生颜色反应。,三、蛋白质的紫外吸收,因为蛋白质中含有Tyr、Phe、Trp等芳香氨基酸，其紫外吸收最大峰的波长为280nm。而且光吸收值（OD值）与蛋白质的浓度程正相关。测定蛋白质浓度的方法：标准曲线法和经验公式法。标准曲线法:经验公式法：蛋白质浓度（mg/ml）=1.45OD280-0.74OD260注意：在使用该公式时，OD280 应在0.10.7之间，所测值

4、才 比较准确。,四、蛋白质的分子量,蛋白质分子大小通常用道尔顿（Dalton，Da）或千道尔顿（kDa）表示，一般在6103106之间。测定蛋白质的分子量有许多方法，常用的有SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）、凝胶过滤法等。这些方法的误差为5%10%。,Dalton:A unit of mass very nearly equal to that of a hydrogen atom.Named after John Dalton(17661844),who developed the atomic theory of matter.,SDS-PAGE测定蛋白质分子量,蛋白质洗脱体

5、积与分子量的关系,分子筛层析示意图,凝胶过滤法：又称分子筛层析法,将几种已知分子量的蛋白质混合溶液上柱洗脱，记录各种蛋白质的洗脱体积。以分子量的对数为纵坐标，以洗脱体积为横坐标，作标准曲线。待测蛋白质溶液在上述相同的层析条件下分离，记录其洗脱体积，然后根据标准曲线计算其分子量。,五、蛋白质的胶体性质,根据溶质在溶剂中的颗粒大小（分散程度），可以把分散系统分为3类：分散相质点小于1nm的为真溶液，大于100nm的为悬浊液，介于l100nm的为胶体溶液。分散相质点在胶体系统中保持稳定，需具备3个条件：1）分散相质点大小在l100nm范围内，这样大小的质点在动力学上是稳定的，介质分子对这种质点碰撞的

6、合力不等于零，使它能在介质中不断作布朗运动（Brown movement）；2）分散相的质点带有同种电荷，互相排斥，不易聚集成大颗粒而沉淀；3）分散相的质点能与溶剂形成溶剂化层，例如与水形成水化层（hydration mantle），质点有了水化层，相互间不易靠拢而聚集。,六、蛋白质的沉淀,蛋白质分子凝聚并从溶液中析出的现象，称为蛋白质沉淀(precipitation)。变性蛋白质一般易于沉淀，但也可不变性而使蛋白质沉淀，在一定条件下，变性的蛋白质也可不发生沉淀。蛋白质所形成的亲水胶体颗粒具有三种稳定因素：颗粒表面的水化层；电荷；布朗运动。除去前两个稳定因素(如调节溶液pH至等电点和加入脱水剂

7、)，蛋白质便容易凝集析出。,(一)盐析(Salting Out)在蛋白质溶液中加入大量的中性盐以破坏蛋白质的胶体稳定性而使其析出，这种方法称为盐析。常用的中性盐有硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等。(二)重金属盐沉淀蛋白质 蛋白质可以与重金属离子如汞、铅、铜、银等结合成盐沉淀，沉淀的条件以pH稍大于等电点为宜。因为此时蛋白质分子有较多的负离子，易与重金属离子结合成盐。(三)生物碱试剂以及某些酸类沉淀蛋白质 蛋白质又可与生物碱试剂(如苦味酸、钨酸、鞣酸)以及某些酸(如三氯醋酸、过氯酸、硝酸)结合成不溶性的盐沉淀，沉淀的条件应当是pH小于等电点，这样蛋白质带正电荷，易于与酸根负离子结合成盐。,常用的沉淀方法

8、：,(四)有机溶剂沉淀蛋白质 可与水混合的有机溶剂，如酒精、甲醇、丙酮等，对水的亲和力很大，能破坏蛋白质颗粒的水化膜，在等电点时使蛋白质沉淀。在常温下，有机溶剂沉淀蛋白质往往引起变性。例如酒精消毒灭菌就是如此，但若在低温条件下，则变性进行较缓慢，可用于分离制备各种血浆蛋白质。(五)加热凝固 加热蛋白质溶液，可使蛋白质发生凝固(coagulation)而沉淀。加热首先是使蛋白质变性，有规则的空间结构被打开，呈松散状不规则的结构，分子的不对称性增加，疏水基团暴露，进而凝聚成凝胶状的蛋白块。如煮熟的鸡蛋，蛋黄和蛋清都凝固。,七、蛋白质的变性与复性,变性（denaturation）：在变性因素的作用下

9、，蛋白质一级结构不发生变化，空间构象被破坏，生物学功能丧失，理化性质也发生改变的现象。变性蛋白质溶解度降低，粘度增加，结晶性被破坏，易发生沉淀。复性（Renaturation）:在一定条件下，变性的蛋白质从伸展态恢复到折迭态，并恢复其原来的理化性质和生物活性。抗菌肽的提纯；RNase A的配制,第二节 蛋白质提取、纯化与鉴定 一般步骤,一、蛋白质提取、纯化的特点二、蛋白质提取、纯化前的准备三、蛋白质提取、纯化的一般步骤,与化学产品的分离制备相比较，生物大分子的制备有以下主要特点：生物材料的组成极其复杂。所以生物大分子的分离纯化方法差别极大，想找到一种适合各种生物大分子分离制备的标准方法是不可能

10、的。许多生物大分子在生物材料中的含量极微。许多生物大分子一旦离开了生物体内的环境极易失活。生物大分子的制备几乎都是在溶液中进行的，温度、pH值、离子强度等各种参数对溶液中各种组成的综合影响，很难准确估计和判断，因而实验结果常有很大的经验成份，实验的重复性较差，个人的实验技术水平和经验对实验结果会有较大的影响。,一、蛋白质提取、纯化的特点,二、蛋白质提取、纯化前的准备 在进行生物大分子的制备前，通常需要对以下几方面的内容加以确定或预先了解。明确实验目的和要求。科研、开发，还是要发现新的物质。通过文献调研和预备性实验，掌握目的生物大分子的理化性质。如分子大小；溶解度；电荷；吸附性质；热稳定性；对配

11、体分子的生物学亲和力等。建立相应的可靠的分析测定方法，这是制备生物大分子的关键。确定可能的技术路线和实验方案，这是最困难的过程。,三、蛋白质提取、纯化的一般步骤 1）选材：制备生物大分子，首先要选择适当的生物材料。原则：原材料来源充足；目标蛋白含量丰富；易于处理和提取。2）生物材料的破碎和预处理：常用的方法有组织匀浆法、研磨、反复冻融、溶菌酶、高压破碎。目的：将目标蛋白以可溶态充分暴露出来，并与其他成分分离。3）粗分离：将绝大多数杂质去掉的过程。方法多为离心、盐析、有机溶剂沉淀、吸附、等电点、超滤等。,4）纯化：将粗提物中的杂质进一步去除的过程，又称为精制。方法为各种层析技术，特别是亲和层析技

12、术。5）鉴定：包括3方面的内容：含量；纯度；活性。贯穿于提取、纯化的每一步。含量：凯氏定氮法、Folin-酚试剂法（Lowry法）和紫外吸收法等。纯度：生物大分子制备物的均一性（即纯度）的鉴定，要求达到一维电泳一条带，二维电泳一个点，或HPLC和毛细管电泳都是一个峰。末端AA测定。活性：比活或生物活性鉴定。6）产物的浓缩、干燥和保存。,第三节 重组蛋白质提取、纯化与鉴定的一般步骤及注意事项,主要内容：一、重组蛋白质提取、纯化与鉴定的特点；二、重组蛋白质提取、纯化与鉴定的一般步骤；三、重组蛋白质提取、纯化与鉴定的注意事项。,一、重组蛋白质提取、纯化与鉴定的特点,与提取纯化天然蛋白质相比，重组蛋白

13、质的提取纯化具有以下特点：1.细菌、酵母、传代细胞等表达体系组成背景清楚，用它们表达的重组蛋白的提取纯化简单、容易；2.分泌表达的蛋白更易提取纯化，且不被细胞内蛋白污染，特别是利用无血清培养时。3.同一种蛋白质，应用不同的表达系统表达，其提取纯化的策略可能完全不同。4.可根据不同的表达系统特点，设计易于提取纯化目的蛋白的表达策略。,二、重组蛋白质提取、纯化与鉴定的一般步骤,1.细胞（菌体）与培养基的分离。常用离心法（大量生产可用连续离心机）。根据目的蛋白存在的部位，收集细胞或培养基。2.细胞破碎。常用的方法有超声破碎、高压破碎和反复冻融等。目的：将目标蛋白以可溶态充分暴露出来，并与其他成分分离

14、。若为分泌表达，本步骤可省略。3.粗提。将绝大多数杂质去掉的过程。方法多为离心、盐析、有机溶剂沉淀、吸附、等电点、超滤等。,4.精制：将粗提物中的杂质进一步去除。方法主要为各种层析技术，特别是亲和层析技术。基因工程包涵体在纯化之前，需要可逆性的变性、复性处理。5.鉴定：包括3方面的内容：含量；纯度；活性。贯穿于提取、纯化的每一步。含量：凯氏定氮法、Folin-酚法（Lowry法）和紫外吸收法等。纯度：生物大分子制备物的均一性（即纯度）的鉴定。要求：一维电泳一条带，二维电泳一个点，或HPLC和毛细管电泳都是一个峰。末端氨基酸测定。活性：比活或生物活性鉴定。6.产物的浓缩、干燥和保存。,三、重组蛋

15、白质提取、纯化与鉴定的注意事项,防止目的蛋白的降解是关键。措施如下：1.对宿主细胞或目的蛋白进行基因操作，防止蛋白水解。如利用蛋白酶缺失的宿主菌或细胞；融合表达等。2.从重组蛋白溶液中除去蛋白酶。3.抑制蛋白酶活性。如抑制剂（EDTA、PMSF），降低操作温度等。4.迅速将表达的目的蛋白脱离表达体系。注意：应同时联合应用几种方法。,第三节 蛋白质技术,1.蛋白质提取纯化技术；2.蛋白质含量（纯度）、活性及结构测定技术；3.免疫化学技术；4.蛋白质的化学合成与修饰技术；5.蛋白质组研究技术（2-DE）。,蛋白质含量（纯度）测定技术,蛋白质定量测定技术是生物化学研究中最常用、最基本的分析技术之一。

16、蛋白质定量测定的方法很多，基本上都是根据蛋白质的物理、化学或生物学特性建立的。目前，常用的方法有：定氮法，比色法（Folin酚试剂法(Lowry法）、考马斯亮蓝法（Bradford法）、紫外吸收法和双缩脲法(Biuret法)。其中Lowry法和Bradford法灵敏度最高，比紫外吸收法灵敏1020倍，比Biuret法灵敏100倍以上。定氮法虽然比较复杂，但较准确，往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。,微量凯氏（Kjeldahl）定氮法 蛋白质的元素组成中，氮的含量较为恒定，平均为16，即1g氮相当于6.25g蛋白质。而生物样品中非蛋白含氮化合物的量通常较小，故只要从生物样品中测定

17、出总含氮量减去非蛋白含氮量，即可推算出样品中蛋白质含量。定氮法比较复杂，但较准确，往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。,实验原理:样品与浓硫酸共热，含氮有机物即分解产生氨；氨与硫酸作用，变成硫酸氨；经强碱碱化又分解释放氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。计算所得结果为样品总氮量，如欲求得样品中蛋白氮含量，须将总氮量减去非蛋白氮。样品中蛋白质的含量，用样品中蛋白氮含量6.25即得。,双缩脲法（Biuret法）,实验借助于蛋白质分子中肽键与双缩脲试剂特殊的颜色反应，通过分光光度计测定待测蛋白质在540nm处的光密度值。以已知标准蛋白的光密度值为纵坐标

18、，标准蛋白浓度为横坐标制作浓度-光密度标准曲线，利用该标准曲线法求出待测蛋白质含量。,实验原理：,双缩脲（NH3CONHCONH3）是两个分子脲经180左右加热，放出一分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个以上肽键的化合物都有双缩脲反应。紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。测定范围为110mg/mL蛋白质溶液。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等。,紫色络合物,Folin酚法（Lowry法）此法是在双缩脲反应的基础上发展起来的，Folin

19、酚试剂法最早由Lowry建立，是最灵敏的测定方法之一。此法的显色原理与双缩脲方法是相同的，只是加入了第二种试剂，即Folin酚试剂，以增加显色量，从而提高了检测蛋白质的灵敏度。方法的灵敏度好于双缩脲法，是目前教学、科研常用的蛋白质含量测定方法。本实验用Folin酚试剂和未知蛋白质反应产生蓝色反应，通过分光光度计测定其在700nm处的光密度值，以已知标准蛋白的光密度值为纵坐标，标准蛋白浓度为横坐标制作浓度-光密度标准曲线，利用该标准曲线法求出待测蛋白质含量。,实验原理：显色反应产生深兰色的原因是：在碱性条件下，蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物，并使肽链展开，其中的酪氨酸和色氨酸残基充分暴露出来；

20、Folin酚试剂中的磷钼酸盐磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和色氨酸残基还原，产生深兰色（钼兰和钨兰的混合物）。在一定的条件下，兰色的深浅与蛋白质的含量成正比。本方法的优点是灵敏度高，比双缩脲法灵敏得多，可检测的最低蛋白质量达5g，通常测定范围是20250g。,考马斯亮兰法（Bradford法）由Bradford在1976年建立的考马斯亮兰法，又称Bradford法，是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。但此法所用样品不能回收，不适合需回收样品蛋白的浓度测定。但此法所用样品量较少，在生产和科研中仍然较多使用。,实验原理：

21、考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质通过范德华引力结合，使染料的最大吸收峰的位置（max）由455nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质的颜色符合比尔定律，与蛋白质浓度成正比。干扰此法测定的主要物质有：去污剂、Triton X-100、十二烷基硫酸钠（SDS）和0.1mol/L的NaOH。,紫外分光光度法：利用紫外吸收法测定蛋白质含量的优点是迅速、简便、不消耗样品，低浓度盐类不干扰测定。因此在蛋白质和酶的生化制备中（特别是在柱层析分离中）广泛应用。,实验原理：蛋白质分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，使蛋白质具有吸收紫外光的性质，吸收高峰在280nm处。在该波长附近，吸光度（OD值）与蛋白质含量（0.1mg/ml1.0mg/ml）成正比。根据这一特性，可以进行蛋白质含量的测定。,