蛋白质理化性质、提取纯化与结构分析测定.ppt
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1、第五章 蛋白质提取纯化、理化性质分析与结构测定,本章主要内容:1.蛋白质理化性质与分析方法;2.蛋白质提取、纯化与鉴定的一般步骤;3.重组蛋白提取、纯化与鉴定的注意事项;4.蛋白质技术;5.蛋白质结构测定。,第一节 蛋白质理化性质与分析方法,一、蛋白质的两性解离和等电点二、蛋白质的呈色反应三、蛋白质的紫外吸收四、蛋白质的分子量五、蛋白质的胶体性质六、蛋白质的沉淀七、蛋白质的变性与复性,当蛋白质溶液处于某一pH值时,蛋白质解离成正、负离子的趋势相等,净电荷为“O”,此时溶液的pH值称为该蛋白质的等电点(isoelectric point,pI)。由于各种蛋白质所含的碱性氨基酸和酸性氨基酸的数目不
2、同,因而有各自的等电点。蛋白质溶液的pH大于等电点,该蛋白质颗粒带负电荷,反之则带正电荷。蛋白质分子所带电荷的性质决定了它在电场中移动的方向。处于等电点的蛋白质颗粒,在电场中并不移动。人体体液中许多蛋白质的等电点在pH5.0左右,所以在体液中以负离子形式存在。,一、蛋白质的两性解离和等电点,二、蛋白质的呈色反应,(一)茚三酮反应(Ninhydrin Reaction)-氨基酸与水化茚三酮(苯丙环三酮戊烃)作用时,产生蓝色反应。蛋白质是由许多-氨基酸组成的,故也呈此颜色反应。(二)双缩脲反应(Biuret Reaction)蛋白质在碱性溶液中与硫酸铜作用呈现紫红色,称为双缩脲反应。凡分子中含有两
3、个以上CONH键的化合物,都呈此反应。(三)米伦反应(Millon Reaction)蛋白质溶液中加入米伦试剂(亚硝酸汞、硝酸汞及硝酸的混合液),蛋白质首先沉淀,加热则变为红色沉淀。此外,蛋白质溶液还可与酚试剂、乙醛酸试剂、浓硝酸等发生颜色反应。,三、蛋白质的紫外吸收,因为蛋白质中含有Tyr、Phe、Trp等芳香氨基酸,其紫外吸收最大峰的波长为280nm。而且光吸收值(OD值)与蛋白质的浓度程正相关。测定蛋白质浓度的方法:标准曲线法和经验公式法。标准曲线法:经验公式法:蛋白质浓度(mg/ml)=1.45OD280-0.74OD260注意:在使用该公式时,OD280 应在0.10.7之间,所测值
4、才 比较准确。,四、蛋白质的分子量,蛋白质分子大小通常用道尔顿(Dalton,Da)或千道尔顿(kDa)表示,一般在6103106之间。测定蛋白质的分子量有许多方法,常用的有SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、凝胶过滤法等。这些方法的误差为5%10%。,Dalton:A unit of mass very nearly equal to that of a hydrogen atom.Named after John Dalton(17661844),who developed the atomic theory of matter.,SDS-PAGE测定蛋白质分子量,蛋白质洗脱体
5、积与分子量的关系,分子筛层析示意图,凝胶过滤法:又称分子筛层析法,将几种已知分子量的蛋白质混合溶液上柱洗脱,记录各种蛋白质的洗脱体积。以分子量的对数为纵坐标,以洗脱体积为横坐标,作标准曲线。待测蛋白质溶液在上述相同的层析条件下分离,记录其洗脱体积,然后根据标准曲线计算其分子量。,五、蛋白质的胶体性质,根据溶质在溶剂中的颗粒大小(分散程度),可以把分散系统分为3类:分散相质点小于1nm的为真溶液,大于100nm的为悬浊液,介于l100nm的为胶体溶液。分散相质点在胶体系统中保持稳定,需具备3个条件:1)分散相质点大小在l100nm范围内,这样大小的质点在动力学上是稳定的,介质分子对这种质点碰撞的
6、合力不等于零,使它能在介质中不断作布朗运动(Brown movement);2)分散相的质点带有同种电荷,互相排斥,不易聚集成大颗粒而沉淀;3)分散相的质点能与溶剂形成溶剂化层,例如与水形成水化层(hydration mantle),质点有了水化层,相互间不易靠拢而聚集。,六、蛋白质的沉淀,蛋白质分子凝聚并从溶液中析出的现象,称为蛋白质沉淀(precipitation)。变性蛋白质一般易于沉淀,但也可不变性而使蛋白质沉淀,在一定条件下,变性的蛋白质也可不发生沉淀。蛋白质所形成的亲水胶体颗粒具有三种稳定因素:颗粒表面的水化层;电荷;布朗运动。除去前两个稳定因素(如调节溶液pH至等电点和加入脱水剂
7、),蛋白质便容易凝集析出。,(一)盐析(Salting Out)在蛋白质溶液中加入大量的中性盐以破坏蛋白质的胶体稳定性而使其析出,这种方法称为盐析。常用的中性盐有硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等。(二)重金属盐沉淀蛋白质 蛋白质可以与重金属离子如汞、铅、铜、银等结合成盐沉淀,沉淀的条件以pH稍大于等电点为宜。因为此时蛋白质分子有较多的负离子,易与重金属离子结合成盐。(三)生物碱试剂以及某些酸类沉淀蛋白质 蛋白质又可与生物碱试剂(如苦味酸、钨酸、鞣酸)以及某些酸(如三氯醋酸、过氯酸、硝酸)结合成不溶性的盐沉淀,沉淀的条件应当是pH小于等电点,这样蛋白质带正电荷,易于与酸根负离子结合成盐。,常用的沉淀方法
8、:,(四)有机溶剂沉淀蛋白质 可与水混合的有机溶剂,如酒精、甲醇、丙酮等,对水的亲和力很大,能破坏蛋白质颗粒的水化膜,在等电点时使蛋白质沉淀。在常温下,有机溶剂沉淀蛋白质往往引起变性。例如酒精消毒灭菌就是如此,但若在低温条件下,则变性进行较缓慢,可用于分离制备各种血浆蛋白质。(五)加热凝固 加热蛋白质溶液,可使蛋白质发生凝固(coagulation)而沉淀。加热首先是使蛋白质变性,有规则的空间结构被打开,呈松散状不规则的结构,分子的不对称性增加,疏水基团暴露,进而凝聚成凝胶状的蛋白块。如煮熟的鸡蛋,蛋黄和蛋清都凝固。,七、蛋白质的变性与复性,变性(denaturation):在变性因素的作用下
9、,蛋白质一级结构不发生变化,空间构象被破坏,生物学功能丧失,理化性质也发生改变的现象。变性蛋白质溶解度降低,粘度增加,结晶性被破坏,易发生沉淀。复性(Renaturation):在一定条件下,变性的蛋白质从伸展态恢复到折迭态,并恢复其原来的理化性质和生物活性。抗菌肽的提纯;RNase A的配制,第二节 蛋白质提取、纯化与鉴定 一般步骤,一、蛋白质提取、纯化的特点二、蛋白质提取、纯化前的准备三、蛋白质提取、纯化的一般步骤,与化学产品的分离制备相比较,生物大分子的制备有以下主要特点:生物材料的组成极其复杂。所以生物大分子的分离纯化方法差别极大,想找到一种适合各种生物大分子分离制备的标准方法是不可能
10、的。许多生物大分子在生物材料中的含量极微。许多生物大分子一旦离开了生物体内的环境极易失活。生物大分子的制备几乎都是在溶液中进行的,温度、pH值、离子强度等各种参数对溶液中各种组成的综合影响,很难准确估计和判断,因而实验结果常有很大的经验成份,实验的重复性较差,个人的实验技术水平和经验对实验结果会有较大的影响。,一、蛋白质提取、纯化的特点,二、蛋白质提取、纯化前的准备 在进行生物大分子的制备前,通常需要对以下几方面的内容加以确定或预先了解。明确实验目的和要求。科研、开发,还是要发现新的物质。通过文献调研和预备性实验,掌握目的生物大分子的理化性质。如分子大小;溶解度;电荷;吸附性质;热稳定性;对配
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