聚丙烯酰胺凝胶电泳原理步骤详细.ppt

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1、,李莉,聚丙烯酰胺凝胶电泳 Polyacrylamide Gel Electrophoresis，PAGE,上海交通大学医学院,小 结,1.掌握（不连续）PAGE的原理2.掌握影响PAGE迁移率的因素3.掌握PAGE的操作注意点、试剂作用4.熟悉PAG的聚合,上海交通大学医学院,思 考 题,名词解释1.凝胶总浓度2.交联度问答题1.与CAME相比，PAGE有哪些特点。2.试比较CAME与PAGE操作的区别。3.简述不连续PAGE的原理。,上海交通大学医学院,讲课内容,上海交通大学医学院,一、PAG 的 组成,PAG是由丙烯酰胺（acrylamide，Acr）单体和N，N-亚甲双丙烯酰胺（N，N

2、，N，N-methylene bisacrylamide，Bis）交联剂通过自由基（free radicals）聚合而成的一种多孔三维网状结构。Acr+Bis-porous matrix,上海交通大学医学院,（1）丙烯酰胺（acrylamide，Acr）结构式,上海交通大学医学院,（2）亚甲双丙烯酰胺（N，N，N，N-methylene bisacrylamide，Bis）,上海交通大学医学院,上海交通大学医学院,讲课内容,上海交通大学医学院,二、PAG的聚合polymerization of PAG,需要催化剂(catalyzer)氧化还原系统作用，使Acr单体带有游离基(Free radi

3、cals)，从而与Bis进行聚合,上海交通大学医学院,（一）化学聚合：AP-TEMED系统,过硫酸胺(NH4)2S2O8（Ammonium persulfate，AP）作为催化剂，四甲基乙二胺（-N,N,N,N-tetramethylethylene diamine,TEMED）为加速剂。,上海交通大学医学院,AP在水溶液中能产生游离基SO42-.，使丙烯酰胺单体的双键打开，活化形成自由基丙烯酰胺，然后游离Acr和Bis作用就能聚合形成凝胶TEMED的游离碱基能促进AP形成SO42-.注意：TEMED量多少都会影响催化作用，须在碱性条件下聚合 分子氧存在，聚合不完全，须去除分子氧，隔绝氧 升高

4、温度能提高聚合，降低温度能延迟聚合,上海交通大学医学院,（二）光聚合：核黄素-TEMED系统,有痕迹氧存在下，核黄素（riboflavin）在光照下（可见光或紫外光）分解，其黄素部分被还原成无色型，但在有氧条件下无色型又被氧化成带有游离基的黄素，其也能使Acr和Bis聚合形成凝胶。注意：分离胶的合成一般采用化学聚合。因为若用光聚合，凝胶的孔径受光照强度与时间的影响，导致孔径大小不同，从而影响蛋白质的分离。,上海交通大学医学院,讲课内容,上海交通大学医学院,三、PAG的浓度与孔径的关系,the initial concentrations of acrylamide and BIS contro

5、l the hardness and degree of crosslinking of the gel.PAG孔径的大小主要由Acr和Bis这两种物质的浓度决定。可以根据要分离物质分子的大小，选择合适的单体浓度。Acr/Bis：2040 完全透明且有弹性 10 很脆，易碎，不透明 100 糊状不成形，易破碎,上海交通大学医学院,凝胶总浓度T100ml凝胶溶液中含有Acr和 Bis的总克数。T=（a+b）/m100%T越大，凝胶孔径越小，适用于分离分子量较小的物质。T越小，凝胶孔径越大，适用于分离分子量较大的物质。,上海交通大学医学院,交联度CBis占单体与交联剂总量的百分比。C=b/（a+b

6、）100%当T固定时，Bis浓度在5%时孔径最小。,上海交通大学医学院,讲课内容,上海交通大学医学院,四、不 连 续 PAGE(Discontinuous PAGE),按具体操作分 垂直板形电泳 圆盘电泳,按凝胶系统的均匀性分 continuous PAGE discontinuous PAGE,上海交通大学医学院,Schematic of discontinous electrophoresis technique,上海交通大学医学院,Disc-PAGE,电极槽缓冲液通常为pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液,上海交通大学医学院,Disc-PAGE,上海交通大学医学院,Disc-PAGE,上海

7、交通大学医学院,分 离 原 理,1.浓缩效应1）凝胶层的不连续性 两层凝胶T与C不同孔径不同 浓缩胶孔径大，分离胶孔径小，蛋白质在大孔径浓缩胶中移动，受阻力小，移动速度快。,上海交通大学医学院,2）缓冲液离子成分的不连续性甘氨酸（pI=6.0）在pH8.3带负电，朝正极移动，进入浓缩胶（pH6.7），甘氨酸解离度（）很小，有效迁移率（M）很低，移动速度较慢，称为慢离子。HCl 是强电解质，=1，Cl-有效迁移率大，移动速度快，称快离子。蛋白质（pI6.0）带负电荷，有效迁移率介于两者之间。,上海交通大学医学院,pH8.3 Tris-Glycine buffer,甘氨酸,HCl,蛋白质,样品胶,

8、浓缩胶,分离胶,样品,低电导区,上海交通大学医学院,3）pH值的不连续性 为了控制慢离子的解离度，从而控制其有效迁移率，必须使浓缩胶与分离胶之间pH值有所区别。,上海交通大学医学院,3.分子筛效应与电荷效应 进入分离胶后，Gly-成为快离子 分离胶只有电荷效应和分子筛效应，根据各蛋白质所带电荷不同、分子大小不同而分离,上海交通大学医学院,上海交通大学医学院,上海交通大学医学院,Load a sample into a polyacrylamide gel electrophoresis well,上海交通大学医学院,上海交通大学医学院,上海交通大学医学院,讲课内容,上海交通大学医学院,五、PAGE 的 特 点,1.具有分子筛效应，分辨率高2.样品不易扩散，用量少，灵敏度可达10-6g3.化学性质稳定，分子结构中富含酰胺基具有稳定的亲水基团4.凝胶不带电荷，消除了电渗现象5.机械强度好，有弹性，在一定浓度范围内无色透明6.网孔可调节,上海交通大学医学院,小 结,1.掌握（不连续）PAGE的原理2.掌握影响PAGE迁移率的因素3.掌握PAGE的操作注意点、试剂作用4.熟悉PAG的聚合,上海交通大学医学院,思 考 题,名词解释1.凝胶总浓度2.交联度问答题1.与CAME相比，PAGE有哪些特点。2.试比较CAME与PAGE操作的区别。3.简述不连续PAGE的原理。,