微生物工程常用微生物及培养基.ppt

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1、第二节 微生物工程常用微生物及培养基,一 微生物工程常用微生物,1.细菌 细菌(bacteria)是自然界分布最广、数量最多的一类微生物，属单细胞原核生物。,细菌结构图,细菌鞭毛,细菌与人类的关系,工业生产常用的细菌有:乳酸杆菌属：芽抱杆菌属：醋酸杆菌属：大肠杆菌属：,2.酵母菌,酵母菌(yeast)为单细胞真核生物，在自然界中普遍存在，主要分布于含糖较多的酸性环境中，如水果、蔬菜、花蜜和植物叶子上，以及果园土壤中。石油酵母较多地分布在油田周围的土壤中。,工业上用的酵母菌有:啤酒酵母、假丝酵母、类酵母等。,分别用于酿酒、制造面包、生产脂肪酶（Lipase）以及生产可食用、药用和饲料用酵母菌体蛋

2、白等。,3.霉菌,霉菌(mould)不是一个分类学上的名词。凡生长在营养基质上形成绒毛状、网状或絮状菌丝的真菌统称为霉菌。霉菌在自然界分布很广，大量存在于土壤、空气、水和生物体内外等处。它喜欢偏酸性环境。,工业上常用的霉菌有：藻状菌纲的根霉、毛霉、犁头霉，子囊菌纲的红曲霉，半知菌类的曲霉、青霉等。它们可用于生产多种酶制剂、抗生素、有机酸及甾体激素(steriod hormone)-,4.放线菌,放线菌(actinomycetes)是一个原核生物类群，在自然界中分布很广，尤其在含有机质丰富的微碱性土壤中较广。,它的最大经济价值在于能产生多种抗生素(antibiotic)。从微生物中发现的抗生素，

3、有60%以上是放线菌产生的，如链霉素、红霉素、金霉素、庆大霉素等。常用的放线菌主要来自以下几个属:链霉菌属、小单抱菌属和诺卡菌属等。,5.担子菌,所谓担子菌(basidiomycetes)就是人们通常所说的菇类(mushroom)微生物。担子菌资源的利用正引起人们的重视，如多糖、橡胶物质和抗癌药物的开发。,6.藻类,藻类(alga)是自然界分布极广的一类自养微生物资源，许多国家已把它用作人类保健食品和饲料。培养螺旋藻，按干重计算每公顷 可收获60t，而种植大豆每公顷才可收获4t;从蛋白质产率来看，螺旋藻是大豆的28 倍,二 培养基选择和配制的原则,培养基是提供微生物生长繁殖和生物合成各种代谢产

4、物所需要的、按一定比例配制的多种营养物质的混合物。,1、培养基的类型和用途,根据营养成分来源，天然培养基：是采用化学成分不清楚或化学成分不恒定的各种植物、动物组织或微生物的浸出物、水解液等物质(例如牛肉膏、酵母膏、麦芽汁、蛋白炼等)制成的。合成培养基：是使用化学成分和数量完全了解的物质配制而成的。半合成培养基：既含有天然成分又含有纯化学试剂的培养基。,据物理状态分：液体培养基：营养物质是以溶质状态溶 解 于 水中。固体培养基：液体培养基+凝固剂（琼脂、明胶、硅胶）半固体培养基：加入的凝固剂较少。,根据使用目的可分为：增殖培养基（加富培养基）：针对某种微生物的生长特点加入营养物质。鉴别培养基：是

5、培养基中加有能与某一菌的无色代谢物发生显色反应的指示剂，从而用肉眼区别于该菌与其他菌。选择培养基：是根据某种生物的特殊营养要求或其对某化学、物理因素的抗性而设计的培养基。,根据生产工艺的要求可分为孢子培养基：是供制备孢子用的培养基，种子培养基：是满足菌种生长的培养基。发酵培养基：是满足大生产中大量菌体生长和繁殖以及代谢产物积累的营养基质。,2、培养基的选择,（1）根据微生物的特点选择培养基（2）根据发酵方式选择培养基 发酵工业中大多采用液体培养基培养种子和进行发酵，并根据微生物对氧的需求，分别作静止或通风培养。而固体培养基则常用于微生物菌种的保藏、分离、菌落特征鉴定、活细胞数测定等方面。,（3

6、）从生产实践和科学试验的不同要求选择,种子培养基要求营养丰富、完全，氮源、维生素的比例应较高，所用的原料也应是易于被微生物菌体吸收利用。常用葡萄糖、硫酸铵、尿素、玉米浆、酵母膏、麦芽汁、米曲汁等作为原料配制培养基。而发酵培养基除需要维持微生物菌体的正常生长外，主要是要求合成预定的发酵产物，所以，发酵培养基碳源物质的含量往往要高于种子培养基。当然，如果产物是含氮物质，应相应地增加氮源的供应量,（4）从经济效益方面考虑选择生产原料,以价廉、来源丰富、运输方便、就地取材以及没有毒性等为原则选择原料。,3、培养基的配制原则,（1）根据不同微生物的营养需要配制不同的培养基（2）营养成分的恰当配比 C/N

7、：（3）渗透压 在发酵生产过程中，通常趋向在较高浓度下进行发酵，以提高产物产量，并尽可能选择高渗透压的生产菌株。,4、培养基成分配比的选择,培养基的组分(包括这些组分的来源和加人方法)、配比、缓冲能力、黏度、消毒是否彻底、消毒后营养破坏的程度及原料中杂质的含量都对菌体生长和产物形成有影响可考虑用“正交试验设计”等数学方法来确定培养基组分和浓度 还要注意生理酸、碱性盐和pH缓冲剂的加入和搭配,一般发酵工业中碳氮比约为100:(0.2一2.0)，但在氨基酸发酵中，因为产物中含有氮，所以碳氮比就相对高一些。注意快速利用的碳(氮)源和慢速利用的碳(氮源)的相互配合，选用适当的碳氮比。一般发酵工业中碳氮

8、比约为100:(02一20)，但在氨基酸发酵中，因为产物中含有氮，所以碳氮比就相对高一些。如谷氨酸发酵的C:N=100:(15一21)，,第三节 工业发酵培养基,从微生物的营养要求来看，所有的微生物都需要碳源、氮源、无机元素、水、能源和生长物质，如果是好氧微生物则还需要氧气。,一、工业上常用的碳源,在微生物发酵过程中，普遍以碳水化合物作为碳源。使用最广的碳水化合物是玉米淀粉或马铃薯淀粉大麦芽蔗糖等。,大麦经发芽制成麦芽，除了淀粉外，麦芽还含有许多糖分。其碳水化合物组成见下表。碳水化合物 含量(总干重),%淀粉 58一60 蔗糖 3一5 还原糖 3一4 其他糖 2 半纤维素 68 纤维素 5,蔗

9、糖一般来自甘蔗或甜菜，在发酵培养基中常用的甜菜或甘蔗糖蜜是在糖精制作过程中留下的残液。用于生产疫苗的培养基，通常是用牛血清蛋白、牛肉汁等蛋白质作为碳源,二、工业上常用的氮源,无机氮源包括氨水、铵盐或硝酸盐等;有机氮源包括玉米浆、豆饼粉、花生饼粉、棉籽粉、鱼粉、酵母浸出液等。其功能是构成菌体成分，作为酶的组成分或维持酶的活性，调节渗透压、pH值、氧化还原电位等,三、无机盐,无机盐是微生物生命活动所不可缺少的物质。其主要功能是构成菌体成分、作为酶的组成部分、酶的激活剂或抑制剂、调节培养基渗透压、调节pH值和氧化还原电位等。,2硫酸镁 镁是某些细菌的叶绿素的组成分。一般革兰阳性菌对镁的最低要求量是2

10、5mg/L革兰阴性菌为4一5mg/L 硫存在于细胞的蛋白质中，是含硫氨基酸的组成分。硫是构成一些酶的活性基。培养基中的硫已在硫酸镁中供给，不必另加。,1磷酸盐 磷是某些蛋白质和核酸的组成成分。磷酸盐在培养基中还具有缓冲作用。常用K3PO43H2O、K3PO4和Na2HPO412H2O等另外，玉米浆、糖蜜、淀粉水解糖等原料中还有少量的磷。磷含量对谷氨酸发酵影响很大。磷浓度过高时，菌体转向合成缬氨酸;但磷含量过低，菌体生长不好。,3.钾盐 钾不参与细胞结构物质的组成。它是许多酶的激活剂。谷氨酸发酵产物生成所需要的钾盐比菌体生长需要量高。菌体生长需钾量约为01克/L，谷氨酸生成需钾量为02一10克/

11、L钾对谷氨酸发酵有影响，钾盐少长菌体，钾盐足够产谷氨酸。,4.微量元素 还有许多元素，微生物需要量十分微小，但又是不可缺少的，称为微量元素。例如锰是某些酶的激活剂，羧化反应必须有锰参与，铁是细胞色素氧化酶、过氧化氢酶的成分，又是若干酶的激活剂。,四 生长因子,微生物生长不可缺少的微量有机物质，如氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素等均称为生长因子。功能：是构成细胞的组成分，促进生命活动的进行。,1生物素 生物素的作用主要影响谷氨酸产生菌细胞膜的通透性，同时也影响菌体的代谢途径。谷氨酸发酵最适的生物素浓度随菌种、碳源种类和浓度以及供氧条件不同而异，一般为5g/L左右。,2维生素Bl(硫胺素)维生素Bl对某

12、些谷氨酸菌种的发酵有促进作用。,3提供生长因子的农副产品原料(1)玉米浆：一般用量为04%一0.8%。(2)麸皮水解液 可以代替玉米浆，但蛋白质、氨基酸等营养成分比玉米浆少。用量一般为1%左右(3)糖蜜 甘蔗糖蜜和甜菜糖蜜均可代替玉米浆。但氨基酸等有机氮含量较低。甘蔗糖蜜用量为0.1%一04%。(4)酵母 可用酵母膏、酵母浸出液或直接用酵母粉。,五、前体物质和促进剂,1、前体物质：某些化合物加到发酵培养基中，能直接被微生物在生物合成过程结合到产物分子中去，而自身的结构并没有多大变化，但产物的量却因加人而有较大的提高。,第四节 发酵工艺控制,一、温度对发酵的影响及共调节控制温度的影响是多方面的，

13、可以影响各种发酵条件，最终影响微生物的生长和产物形成,（一）、温度对发酵的影响 温度对发酵的影响主要表现在对细胞生长、产物形成、发酵液的物理性质和生物合成方向等方面。1、温度对微生物细胞生长的影响 最适温度：,2、温度影响发酵液的物理性质 温度对氧在发酵液中的溶解度就有很大的影响，随着温度的升高，气体在溶液中的溶解度减小，氧的传递速率也会改变。另外温度还影响基质的分解速率，例如，菌体对硫酸盐的吸收在25时最小。3、温度影响生物合成的方向 例如，在四环类抗生素发酵中，金色链丝菌能同时产生四环素和金霉素，在低于30C时，它合成金霉素的能力较强。随着温度的提高，合成四环素的比例提高。当温度超过35C

14、时，金霉素的合成几乎停止，只产生四环素。,（二）、影晌发酵温度的因素 发酵热：发酵过程中释放出来的净热量。（三）、最适温度的选择与发酵温度控制1、选择最适温度主要应考虑两方面：A、微生物生长的最适温度B、产物合成的最适温度 乳酸链球菌的最适生长温度是34C，而产酸的最适温度不超过30C。因此需要在不同的发酵阶段选择不同的最适温度。2、选择最适温度要考虑培养条件培养基成分和浓度、菌体生长阶段等。,（一）、pH对发酵的影晌 1、pH影晌微生物生长和产物形成几种抗生素发酵的最适pH范围产 品 菌生长最适pH范围 产物形成最适pH范围青霉素 6.57.2 6.26.8 链霉素 6.36.9 6.77.

15、3四环素 6.16.6 5.96.3土霉素 6.06.6 5.86.1红霉素 6.67.0 6.87.3灰黄霉素 6.47.0 6.26.5,二、pH 对发酵的影响及控制,1、pH还会影响菌体的形态。2、pH还影响细胞膜的电荷状态，引起膜的渗透性发生改变，进而影响菌体对营养物质的吸收和代谢产物的形成。4、pH对某些生物合成途径有显著影响。黑曲霉在pH=23时产生柠檬酸，pH近中性时，积累草酸和葡萄糖酸。,（二）、影响发酵pH的因素1、取决于培养基的成分和微生物的代谢特性。例如，以花生饼粉为培养基进行土霉素发酵，最初将pH分别调到5.0、6.0和7.0，发酵24h后，这三种培养基的pH已经不相上

16、下，都在65一70之间。生理碱性物质：被微生物利用后会提高pH的物质。如有机氮源、硝酸盐、有机酸等。生理酸性物质：被微生物利用后会降低pH的物质，如，糖类、脂肪。2、通气条件的变化，菌体自溶或杂菌污染都可能引起发酵液pH的变化。,（三）、最适pH的选择和调节 选择最适pH的原则是既有利于菌体的生长繁殖，又可以最大限度地获得高的产量。一般最适pH是根据实验结果来确定的。pH的控制,（一）、氧对发酵的影响1、只有充足的氧，微生物才能进行正常的呼吸代谢。2、提高通气效率的方法（二）、CO2对发酵的影响1、CO2的来源及对发酵的影响2、CO2的浓度控制,三、氧、CO2、泡沫对发酵的影响,（三）、泡沫对发酵的影响1、泡沫产生的原因2、泡沫对发酵的危害3、泡沫的消长规律4、泡沫的消除与防止,