生物技术概论细胞工程.ppt
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1、第四章 细胞工程 Cell Engineering,主讲教师 魏琴 教授,主要讲授内容:1 细胞工程概述2 植物细胞工程3 动物细胞工程4 微生物细胞工程,本章要求:理解细胞工程的概念;掌握植物组织培养的基本原理和方法;理解植物非试管快繁的基本原理和方法;理解植物细胞培养、人工种子、细胞融合的基本原理和方法;了解植物细胞工程的研究进展与应用前景;理解单克隆抗体技术、细胞核移植与动物克隆、染色体转移、干细胞等研究的基本原理与方法;了解动物细胞工程的研究进展与应用;了解微生物细胞工程的基本原理;了解微生物细胞工程的研究进展与应用。,1 细胞工程概述,作为生物工程重要分支的细胞工程,近年来获得了令人
2、瞩目的迅速发展。这不仅是由于它在理论上具有重要的意义,而且在工农业生产方面也具有广泛的应用前景。,1.1 细胞工程概念,细胞工程:在细胞水平上研究、开发、利用各类细胞的工程,即人们根据科学设计改变细胞的遗传基础,并通过无菌操作,大量培养细胞、组织乃至完整个体的技术(教材P60)。细胞工程:应用细胞学的方法,按照我们人类的需要和预定的设计,有目的、有计划地保存、改变和创造新细胞及其遗传物质,从而产生新的种或者品种的技术。细胞工程:应用细胞生物学和分子生物学的方法,在细胞水平进行的遗传操作。,1 细胞工程概述,细胞工程:是指以细胞为基本单位进行培养、增殖(细胞培养组织培养)或按照人们的意愿改造细胞
3、的某些生物学特性,从而创造新的生物和物种,以获得具有经济价值的生物产品。它主要由两部分构成,其一是上游工程,包含细胞培养、细胞遗传操作和细胞保藏三个步骤。另一个则是下游工程,是将已转化的细胞应用到生产实践中去,以生产生物产品的过程。,1.1 细胞工程 概念,1.2 细胞工程研究的对象,细胞或其组成部分和构成的组织、器官等如染色体、细胞核、原生质体、整个细胞、受精卵、胚胎、组织或器官。,1 细胞工程概述,1.3 细胞工程研究主要内容,细胞与组织培养:细胞、组织和器官培养三层次细胞融合:单克隆抗体染色体工程:染色体的添加、消减、替换胚胎工程:胚胎分割、胚胎融合、核移植、体外受精、性别鉴定、胚胎冷冻
4、细胞遗传工程:克隆、转基因技术,1 细胞工程概述,1.4 细胞工程的优点,细胞工程开辟了基因重组的新途径,它不需要经过分离、提纯、剪切、拼接等基因操作只需将细胞遗传物质直接转移到受体细胞中,就能够形成杂交细胞,因而提高了基因转移的效率。,1 细胞工程概述,1.4.2 细胞工程克服了常规杂交的局限性,使远缘杂交有了新的途径。它不仅可以在植物一植物之间,动物与动物之间,微生物与微生物之间进行远缘杂交,甚至可以在动物与植物、动物与微生物之间进行细胞融合,形成杂交物种。土豆番茄、山绵羊、大豆烟草、芹菜胡萝卜。1.4.3 用细胞工程的技术来改造和创造新生物,比起用基因工程技术来稍为容易些。,1.4 细胞
5、工程 的优点,1.5 细胞工程与其他生物工程的关系,细胞工程与其他生物工程的关系,1 细胞工程概述,1.6 细胞工程的应用,细胞工程作为科学研究的一种手段,已经渗入到生物工程的各个方面,成为必不可少的配套技术。在农林、园艺和医学等领域中,细胞工程正在为人类做出巨大的贡献。,1 细胞工程概述,优质植物快速培育与繁殖动物胚胎工程快速繁殖优良、濒危品种利用动植物细胞培育生产活性产物、药品新型动植物品种的培育供医学器官修复或移植的组织工程转基因动植物的生物反应器工程珍稀动植物资源的保存与保护在遗传学发育学等领域的理论研究在能源、环境保护等领域的应用,1.6 细胞工程的应用,2 植物细胞工程,2.1 植
6、物组织培养2.2 植物细胞培养2.3 植物非试管快繁2.4 植物原生质体培养与融合2.5 人工种子的研制2.6 植物细胞工程研究进展(综述),2.1 植物组织培养(Plant tissue culture),2.1.1 几个重要概念2.1.2 对植物组织培养实验室的要求2.1.3 植物组织培养的步骤2.1.4 主要植物组织培养技术,2 植物细胞工程,几个重要概念,植物细胞全能性(CellTotipotency):指任何具有完整的细胞核的植物细胞(不管性细胞还是体细胞),都拥有形成一个完整植株所必需的全部遗传信息,在特定的环境下能进行表达,产生一个独立完整的个体。满足两个条件:离体;给予适当的刺
7、激 经历两个过程:脱分化;再分化,2.1 植物组织培养,脱分化 再分化 外植体 愈伤组织 生长点 幼茎、根 小植株,植物组织培养:在 无菌条件下,将离体的植物器官(根尖、茎尖、叶、花、果实、种子等)、组织(花药、胚乳、皮层、髓组织等)、细胞(体细胞、生殖细胞等)、胚胎(成熟或未成熟的胚)、原生质体等培养在人工配制的培养基上,给予适当的培养条件,诱发产生愈伤组织、丛生芽或长成新的完整的植株的一种实验技术。由于在试管内培养,且培养的是脱离植株母体的培养物,所以也叫“离体培养”(Culture in vitro)或“试管培养”(In test-tube culture)。,2.1.1 几个重 要概念
8、,外植体(Explant):植物组织培养中用来进行离体无菌培养的离体材料,可以是器官、组织、细胞和原生质体等。愈伤组织(Callus):外植体产生的排列疏松而无规则且没有发生分化的薄壁细胞。脱分化(dedifferentiation):原来已经分化,并且具有一定功能的体细胞(或性细胞),丧失了原有的结构和功能,又重新恢复了分裂功能,就叫做植物细胞的脱分化。,2.1.1 几个重要概念,2.1.2 对植物组织培养实验室的要求,化学实验室或培养基配制室洗涤室或消煮室菌室或接种室培养室观察与鉴定室温室或苗圃 贮存室,接种室,培养室,2.1.2 对植物组织培养 实验室的要求,观察与鉴定室,大棚,2.1.
9、2 对植物组织培养 实验室的要求,2.1.3 植物组织培养的步骤(http:/,2.1.3.1 培养基配制2.1.3.2 灭菌2.1.3.3 接种2.1.3.4 培养 2.1.3.5 试管苗驯化移栽 2.1.3.6 试管苗增殖率的估算 2.1.3.7 快速繁殖工作的计划安排,2.1 植物组织培养,2.1.3.1 培养基(Culture medium)的配制,一个完善的培养基成分:无机营养成分 大量元素:浓度大于0.5毫摩尔/升;包括H、O、N、P、K、Ca、Mg、S等元素(配成母液)微量元素:其浓度小于0.5毫摩尔/升;微量元素包括Cu、Mo、Zn、Na、Mn、CoB和I等(配成母液)铁盐采用
10、硫酸亚铁和乙二胺四乙酸二钠结合成螯合铁配置而成(配成母液),2.1.3 植物组 织培养 的步骤,有机营养成分:(配成母液)碳水化合物:蔗糖和葡萄糖,白糖节约成本一般的使用浓度为2%4%。植物生长调节物质(常称为激素):配成母液 生长素:NAA、IAA、IBA、2,4D;细胞分裂素:KT(激动素)、6-BA(6-苄基腺嘌呤)、ZT(玉米素)、2iP(2异戊烯腺嘌呤)、4PU、CPPU(吡效隆)和TDZ(噻重氮苯基脲)。其它:赤霉素(GA3);脱落酸(ABA);多效唑(PP333)水:,一个完善的培养基成分,培养基的种类:按培养基组成特点分类第一类为含盐量高的培养基,如MS、LS、BL、ER。第二
11、类为硝酸钾含量高的培养基,如B5、N6、SH。第三类是无机盐中等含量培养基,如H和Nitsch培养基。第四类为低盐含量基本培养基,如White、WS和HE培养基。按培养基的功能分类脱分化培养基 初代培养基分化培养基壮苗培养基 生根培养基 继代培养基,.1.3.1 培养基的配制,外植体,愈伤组织(脱分化培养基),丛生芽(再分化培养基),再生根(生根培养基),再分化,脱分化,壮苗(壮苗培养基),接种,2.1.3.1 培养基的配制,怎样选取最佳培养基方案(例:MS+6BA0.5mg/L+NAA1mg/L+Su3%+Agar0.6%)对于某个待培养的目的植物来讲:查资料-预备性试验-观察培养物的反映-
12、调整:单因子试验,多因子试验和正交设计-逐步添加和逐步排除基本培养基的选择激素的选择:激素种类、浓度、激素配比糖的选择:糖的种类、浓度的选择琼脂的选择:主要是浓度的选择附加物的选择:香蕉汁、活性炭、椰子汁等,培养基的配制方法(药品室进行)MS+6-BA0.5+NAA1+Su3%+Agar0.6%500 mL水+母液:激素或其他成分:如活性碳等 糖类:一般30g/L 琼脂:一般68g/L加热溶化:pH值调整:定容:分注、封口:灭菌:,2.1.3.1 培养基的配制,2.1.3.2 灭菌,湿热灭菌:培养基及布制品的灭菌几种排气的方法:时间与体积的关系:放气方法:,2.1.3 植物组织培养的步骤,灼烧
13、灭菌:用于无菌操作的器械95%的酒精+酒精灯火焰上灼烧接种器杀菌器:如图过滤灭菌:不耐热的物质,2.1.3.2 灭菌,干热灭菌:玻璃器皿及耐热用具等紫外线和熏蒸灭菌:空间灭菌所用(培养室、接种室等)一些物体表面用药剂喷雾灭菌,2.1.3.2 灭菌,消毒剂表面灭菌:植物材料(超净工作台上,接种室)消毒剂因素 材料采集的因素 老嫩因素 部位因素 天气因素 季节因素 时间因素 外植体消毒步骤,2.1.3.2 灭菌,消毒剂因素,2.1.3.2 灭菌,外植体消毒步骤,材料自来水蒸馏水75%酒精3060 S 无菌水34次10%次氯酸钠或次氯酸钙饱和液或0.10.2%升汞(吐温)515 min 无菌水洗58
14、次。,2.1.3.2 灭菌,.1.3.接种(接种室),2.1.3 植物组织培养的步骤,2.1.3.培养 Culture(培养室),培养方法 固体培养法液体培养法 培养步骤 初代培养:愈伤组织;原球茎;顶芽和腋芽的发育;不定芽的发育;体细胞胚状体的发生与发育;初代培养外植体的褐变 继代培养:切割茎段、分离芽丛、分离胚状体、分离原球茎等 生根培养:,2.1.3 植物组织培养的步骤,培养条件:环境培养条件:温度(Light)、湿度(Humidity)、光照光质(Light wave)、光强(Light intensity)、光周期(Light period)化学环境条件:渗透压(Penetratin
15、g pressure)、气体(Gas),1.3.培养,2.1.3.5 试管苗驯化移栽,试管苗与大田苗在生理、形态等方面的差异 异养型 自养型 无菌 有菌 管理:保持小苗的水分供需平衡。防止菌类滋生。一定的温、光条件。保持基质适当的通气性。,2.1.3 植物组织培养的步骤,2.1.3.6 试管苗增殖率的估算,基本数据的统计每一周期(从接种当天到再次可供接种的当天)需要多少天每一周期每一瓶能接种多少瓶每瓶有多少苗,基本数据的统计每一周期(从接种当天到再次可供接种的当天)需要多少天每一周期每一瓶能接种多少瓶每瓶有多少苗,2.1.3 植物组织培养的步骤,计算出年增殖率的理论值 年增殖率:Y;每周期增殖
16、的倍数:X;全年可增殖的周期数:n=365/每一周期的天数;Y=Xn,2.1.3.6 试管苗增殖率的估算,仙茅(石蒜科),葡萄(葡萄科),茶树(山茶科),麻疯树(大戟科),油樟(樟科),生姜(姜科),兰草(兰科),芦荟,兰 草,麻疯树,移栽,2.1.3.7 快速繁殖工作的计划安排,人工的配置安排实验启动的时间安排增殖瓶数的控制污染的估测,2.1.3 植物组织培养的步骤,2.1.4 植物主要的组织培养技术,2.1.4.1 植物脱毒与快繁技术2.1.4.2 花药及花粉培养2.1.4.3 植物胚胎培养,2.1 植物组织培养,2.1.4.1 植物脱毒与快繁技术,2.1.4 植物主要的组织培养技术,意义
17、快速繁殖,保持优良品质生产无毒苗,提高苗木品质节约土地,快速繁殖:一片树叶能变一座森林一年内可从一个兰花茎尖繁殖出400万株遗传性状均一的健康植株;花叶芋:常规繁殖:几倍几十倍 组培繁殖:几万数百万倍月季、菊花、牡丹、山茶等。脱毒花卉:去病毒后,植株生长势强,花朵变大,色泽鲜艳,抗逆能力提高,产花数量上升。预计在21世纪,这一技术的应用将更为广泛。如:兰花、大丽花、水仙、天竺葵菊花等。脱毒马铃薯:增产40-200%(2000-2500kg/亩)。红薯:增产30%以上。草莓:增产500-1000千克/亩,2.1.4.1 植物脱毒与快繁技术,2.1.4.1 植物脱毒与快繁技术,植物脱毒技术为什么植
18、物需要脱毒?脱毒方式:热处理脱毒病毒钝化(寄主植物很少或不会受到伤害)温汤浸渍处理:在50左右的温水中浸渍 10分钟至数小时。缺点:易使材料受伤。热空气处理:35-40,几十分钟,长可达数月温热治疗室(箱)内。缺点:缺陷是并非能脱除所有病毒热处理需与其他方法配合应用才可获得良好的效果。,生长点(约0.1-1MM区域)几乎不含或含病毒很少.分生区域内无维管束,病毒只能通过胞间连丝传递,赶不上细胞不断分裂和活跃的生长速度。,茎尖培养脱毒,2.1.4.1 植物脱毒与快繁技术,其他途径脱毒 愈伤组织培养脱毒仅有部分单个细胞含有病毒病毒的复制速度赶不上细胞的增殖速度或有些细胞通过突变获得了抗病毒的抗性。
19、缺陷植株遗传性不稳定,可能会产生变异植株,并且一些作物的愈伤组织尚不能产生再生植株。化学疗法脱毒 许多化学药品(包括嘌呤、嘧啶类似物、氨基酸、抗菌素等)对离体组织和原生质体具有脱毒效果。,2.1.4.1 植物脱毒与快繁技术,脱毒效果检测抗血清(antiserum)鉴定:已知植物病毒核蛋白(抗原)制备抗体;抗血清+未知的病毒植物可见的沉淀(试管)酶联免疫吸收鉴定(ELISA):已知植物病毒(抗原)+一抗(已制备)二抗(酶)酶的显色底物溶液 酶标仪检测电子显微镜(electric microscope)检查法:直接观察病毒 的有无或种类指示植物法(indicating plant):被鉴定植物 的
20、汁液接种指示植物或嫁接接种法(指示植物作为砧木,被鉴定植物作接穗),指示植物是指具有能够辨别某种病毒的专化性症状的寄主植物。,2.1.4.1 植物脱毒与快繁技术,2.1.4.2 花药及花粉培养,概念与意义花药培养:花药培养是把花粉发育到一定阶段的花药接种到培养基上,来改变花粉的发育程序,使其分裂形成细胞团,进而分化成胚状体,产生再生植株,或形成愈伤组织,由愈伤组织再分化成植株。属器官培养还是细胞培养?花粉培养:花粉培养是指把花粉从花药中分离出来,以单个花粉粒作为外植体进行离体培养的技术。由于花粉已是单倍体细胞,诱发它经愈伤组织或胚状体发育成的植株都是单倍体植株。优点:不受花药的药隔,药壁、花丝
21、等体细胞的干扰;缺点是较比花粉培养难度大。属器官培养还是细胞培养?为何更多的要花药培养?(药壁提供营养)共同的目的:花粉细胞单倍体(haploid)细胞单倍体植株(但不是最终目的但具应用潜力,为什么?)经染色体加倍正常结实二倍体植株。,2.1.4 植物主要的组织培养技术,2.1.4.2 花药及花粉培养,单倍体植物三个明显的特点:体细胞染色体数减半;生长发育弱,体形小、各器官明显减小;雌雄配子严重败育,有的甚至不能进入有性世代。单倍体的应用潜力:迅速获得纯合型材料,缩短育种年限 获得育种中间材料 与诱变育种相结合可以提高诱变频率 与细胞融合相结合,使这一育种途径更具有实际应用意义 作为遗传工程受
22、体更为有效(当代表达)用作基础遗传研究的各个领域加倍后的二倍体特点:属于真正的纯系。和常规多代自交纯化方法相比,可节省大量的时间和劳力。,2.1.4.2 花药及 花粉培养,2.1.4.2 花药及 花粉培养,花药培养的基本程序是:外植体选择外植体(花蕾)预处理外植体消毒剥取花药接种诱导培养分化培养,花药培养前给予一定的低温处理是十分必要的。烟草、茄子 35 72小时 水稻 10 1014天 柑橘 3 510天 马铃薯 4 48小时低温处理的作用:可以激发花粉母细胞产生两个相等核:一个营养核一个生 殖核;保持高比例的强生活力花粉,同时延缓体细胞组织的衰老;激发花粉产生原胚;促使细胞同步分裂。,2.
23、1.4.2 花药及 花粉培养,花药培养中单倍体形成的途径营养细胞发育途径:生殖核退化,营养核发育生殖细胞发育途径:营养核退化,生殖核发育营养细胞和生殖细胞同时发育的途径:花粉均等分裂途径:,2.1.4.2 花药及 花粉培养,形成胚状体或愈伤组织,花粉及小孢子培养花粉培养的基本程序是:取材时期的确定外植体(花蕾)预处理外植体消毒花粉或小孢子的分离接种培养取材时期的确定四分体单核早期单核晚期双核早期双核晚期三核期预处理有利于改变正常的发育途径,而且还可以促进花粉植株的形成 花粉或小孢子的分离:花药小烧杯(有基本培养基)挤压花药(注射器内管)花粉释放过滤(尼龙筛)低速离心(100-160r/min)
24、吸管吸掉碎片加入新鲜培养基连续进行两次过滤,到每毫升含103-104个花粉/mL培养方法 花药看护培养花粉悬浮培养(微室培养),2.1.4.2 花药及 花粉培养,单倍体植株的鉴定与二倍化鉴定方法:形态学鉴定 染色体分析单倍体植株的二倍化:继代加倍 创伤法加倍 秋水仙素处理加倍,2.1.4.2 花药及 花粉培养,2.1.4.3 植物胚胎培养植物胚胎培养包括胚培养、胚珠培养、子房培养、胚乳培养。植物胚培养(embryo culture of plants)克服杂交育种中杂种胚的早期夭折胚培养包括成熟胚(mature embryo)培养;幼胚(immature embryo)培养,幼胚培养中,常见的
25、生长方式有三种:(1)、胚性发育(embryonal development)幼胚接种到培养基上以后,仍然按照在活体内的发育方式发育,最后形成成熟胚(有时甚至可能类似种子),然后再按种子萌发途径出苗形成完整植株,这种途径发育的幼胚一般一个幼胚将来就是一个植株。(2)、早熟萌发(early mature sprouting)幼胚接种后,离体胚不继续胚性生长,而是在培养基上迅速萌发成幼苗,通常称之为早熟萌发。在大多数情况下,一个幼胚萌发成一个植株,但有时会由于细胞分裂产生大量的胚性细胞,以后形成许多胚状体,从而可以形成许多植株,这种现象就是所谓的丛生胚现象。(3)、愈伤组织(callus)在许多情
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