生物大分子的色谱分离和纯化.ppt
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1、复 习,浓差极化浓差极化是指在超滤过程中,由于水透过膜,因而在膜表面的溶质浓度增高,形成梯度,在浓度梯度的作用下,溶质与水以相反方向扩散,在达到平衡状态时,膜表面形成一溶质浓度分布边界层,它对水的透过起着阻碍作用.,复 习,膜的污染膜分离过程中随着操作时间的增加,膜透过流速的迅速下降,溶质的截留率也明显下降,这被称为膜的污染。污染是由膜的劣化和水生物(附生)污垢所引起的。,复 习,防止膜污染的方法(1)预处理法调整供给液的pH值或添加阻氧化剂来防止化学劣化;预先清除供给液中的微生物,以防止生物性劣质等。(2)开发抗污染的膜(3)加大供给液的流速,第七章 生物大分子的色谱分离与纯化,第一节 色谱
2、概论一、色谱的概念色谱(层析)是一个建立在吸附、分配、离子交换、亲和力和分子大小等基础上的分离过程。又称色层分离。二、色谱的特点能够把各个有关的组成成分从复杂的混合物中分离并检测出来。它是利用不同组分在相对运动、相互不相溶的两相中(其中静止的一相为固定相,相对运动的一相为流动相),吸附能力、分配系数、离子交换能力、亲和力和分子大小等性质的微小差别。经过连续多次在两相中的质量交换,从而使不同组分得以分离,这就是色谱法所依据的基本原理。,必要条件,充分条件,2.色谱具有高效、快速和灵敏的特点,色谱分离图示,根据混合物中,溶质在互不相溶的两相之间分配行为的差别,引起溶质移动速度的不同而进行分离的方法
3、。互不相溶的两相分别称为:固定相和流动相。,色谱分离图示,三、层析的分类,根据溶质分子与固定相相互作用的机理不同的分类,凝胶过滤法,分配层析法,离子交换色层分离法,吸附层析法,疏水作用色层分离法,金属螯合色层分离法,共价作用色层分离法,根据实验技术的分类,低压层析技术,中压层析技术,高压层析技术,电泳法,操作压力在0.5MPa-5MPa之间,操作压力在5Mpa-40MPa之间,操作压力小于0.5MPa,靠溶质分子在电场中的移动速度 不同而分离,根据固定相的形状不同的分类:,柱层析法,纸层析法,薄层层析法,根据流动相的物态不同的分类,汽相层析法,液相层析法,操作方式不同的分类,迎头法,顶替法,洗
4、脱分析法,层析分类,吸附色谱与其它色谱法的异同点,三、色谱的分类,1.5 层析剂种类,氧化铝硅胶活性炭琼脂糖 纤维素,现代色谱技术中除了分配色谱、吸附色谱外,生物制药中广泛使用的还有离子交换色谱、凝胶色谱和亲和色谱等。选择的原则:易溶于有机溶剂而难溶于水的样品,选择吸附色谱;水溶液中可解离成离子的水溶性样品,可选用离子交换色谱;样品既溶于水,又溶于有机溶剂,可选用分配色谱。除了平板、纸和薄层色谱外,其余色谱都可以在柱子中进行,因此柱色谱的应用非常广泛。,为何选择色谱作为生物分子纯化方法?,不产生热不产生外力高回收率高分辨率线性放大,可预期可自动化大量成功例子,Principles of Ope
5、ration for Chromatography Techniques,GelFiltration,IonExchange,Hydrophobic Interaction,Affinity,Reversed Phase,1.色谱分离种类,第七章 生物大分子的色谱分离与纯化,2.分离对象:酶、多糖蛋白质核酸等.3.分离类型:分析色谱(10 mg)中等规模制备色谱(10-50mg)制备色谱(0.1-1g)工业生产规模色谱(20g/d),Chromatography,国产气相色谱仪,HP高压液相色谱仪,美国气相色谱仪,4.分离设备,4.分离设备,4.分离设备,制备色谱技术,生产规模制备色谱柱直径1
6、00-800mm,中试规模制备色谱柱直径50-150mm,小量制备,色谱柱直径10-40mm,4.分离设备,制备液相色谱系列,半制备液相色谱,中试规模制备色谱,工业规模制备色谱,制备液相色谱,分析液相色谱,5.色谱法的分类按物理状态分类根据流动相的物态:气相色谱法(GC)和液相色谱法(LC)根据固定相的物态:气-固色谱法、气-液色谱法、液-固色谱法、液-液色谱法按使用的形式分类(1)柱色谱、(2)纸色谱、(3)薄层色谱,按分离机理分类(1)吸附色谱、(2)分配色谱、(3)离子交换色谱、(4)凝胶色谱,6.色谱法的特点(1)高选择性(2)高效能(3)高灵敏度可以分析质量分数为10-610-9数量
7、级、检出限量低至10-1l g的物质,适于微量和痕量分析。,7.色谱法的应用(1)色谱分析广泛应用于极为复杂的混合物成分分析;(2)液相色谱法,在糖类、氨基酸、农药、染料、贵金属、有机金属化合物等方面得到了广泛的应用。,(3)色谱分离是一种非常有效的提纯物质的技术,常用于制备分离,得到高纯样品。(4)色谱质谱联用仪已成为研究生物大分子结构 的重要手段。,第一节 基本理论,一计量置换保留理论分析色谱与制备色谱:分析色谱 灵敏度 进样量 毛细管柱色谱 制备色谱 分离与纯化较多的 产品 增加进样量,(2)溶质计量置换吸附理论:当一个溶质被吸附剂吸附时,在溶质分子和吸附剂接触表面处必然会释放出一定数目
8、的溶剂分子。用计量置换这一概念和相同的热力学平衡,将多年来物理化学家和色谱学家各自独立进行研究的液-固吸附机理及溶质在液相色谱中的保留机理统一起来。,第一节 基本理论,二有效柱长和最短柱长 在实际应用中,一般认为色谱柱的长径比为10,是色谱柱较为合适的几何比例。对于生物大分子而言,它的保留主要是由流动相中置换剂的浓度决定的,柱长对生物大分子的分离几乎没有影响,有时会出现短柱较长柱的分离效果还好的情况。,二有效柱长和最短柱长,不同溶质在其迁移速度大于零,但小于流动相的线速度时,溶质在色谱柱上的迁移对分离有贡献,此时溶质迁移所经历的柱长也对分离有贡献;而当不同溶质在其迁移速度等于流动相的线速度时,
9、溶质迁移所经历的柱长对分离无贡献。,二有效柱长和最短柱长 有效柱长(Leff):溶质从开始迁移至其迁移速度等于流动相速度时,溶质在色谱柱上迁移的距离。又叫有效迁移距离。最短柱长(Lmin):混合溶质中使一对最难分离的溶质1和溶质2的分离度Rs=1时所需的最短距离。,分离度,第二节 装置和操作技术,装置包括:流动相供给、进样、色谱柱和检测器4大部分。,1.柱色谱系统的组成,色谱介质有各种各样,但柱式色谱系统的组成基本相似,一般由蠕动泵、色谱柱、检测器、记录仪以及部分收集器等几个部分构成。,柱式层析系统的组成基本相似。由以下几个部分构成:A 蠕动泵B 层析柱C 装柱D 加试样E 洗脱F 检测器G
10、部分收集器,柱层析系统的组成,柱层析装置图,2 纸层析法,2.1 基本原理2.2 操作方法2.3 操作步骤,小实验,当滤纸接触到溶剂时,溶液将上升。滤纸上的小圆点是4种不同的氨基酸的混合物。看看接下来会发生什么事情,可以看出1号氨基酸上升的最高,在滤纸上跑得最快。而4号氨基酸与滤纸的结合最紧,因此跑的速度比其他的氨基酸慢。,1,2,3,4,这就是纸层析法。对照上图,可知道1-4号的各代表什么氨基酸。纸层析法是分离鉴定蛋白质的氨基酸组成的重要工具。,1,2,3,4,甘氨酸,半胱氨酸,组氨酸,缬氨酸,纸层析小实验动画演示,凝胶装置图,色谱峰和分离结果,第二节 装置和操作技术,柱层析法的一般技术,1
11、层析柱 层析柱通常是玻璃的。总的说来,长柱分辨好。但大量物质的处理则用粗的柱比较适宜。层析柱的基本装置如图。,2层析材料的准备 许多材料都可在层析法中使用。在装柱前这些材料要用溶剂平衡,另外还需作一些预处理。例如,凝胶层析材料需要溶胀,吸附剂需要加热或酸处理来活化,离子交换树脂需要用酸碱处理来得到所需的电离形式。,在用溶剂平衡时,先使材料沉淀,用倾泻法除去悬浮的细颗粒,否则由于细颗粒的堵塞,溶剂的流速将显著降低。,3装柱 层析柱的填装是先关闭出口,用溶剂灌注至13体积,并使支持板下的“死体积”不存有气泡,再慢慢地向溶剂中加浆状物,要小心地沿着玻棒倾注以防止气泡存留在柱内。让悬浮液沉淀,并放出过
12、多的溶剂,为了避免分层。最好一次装完,如需分几次填装,则在二次填装前应先在已经沉淀的表面用玻棒搅拌后再倾注,重复这个过程,直至装到需要的高度。用溶剂彻底洗涤层析柱后使液面降到比层析床表面略高一点。最后覆盖一张圆形滤纸或尼龙布,以免加样时扰乱床表面。,4加样 上柱前,先将样品溶解在溶剂里或对洗脱液透析,样品溶液的浓度应该尽可能高些,以减少样品溶液体积,使区带狭窄。将样品仔细加到层析床的表面,打开旋塞至液面与床面齐,然后连接溶剂池,保持一定高度的液面。,4)上样 样品浓度越高越好;上样体积越小,分辨率越高;上样体积一般为床体积的15%;例外:G-25脱盐30%亲和层析为床体积的几倍,5洗脱 用适当
13、的洗脱液把各组分依次从柱上洗脱下来。3)洗脱 影响分离效果的主要因素之一:洗脱流速。要求流速合适而恒定。,洗脱方式 连续洗脱(continual elution):同一种洗脱液洗脱 分步洗脱(stepwise elution):用两种或两种以上不同洗脱液分段洗脱 梯度洗脱(gradient elution):梯度改变洗脱液的pH值、离子强度或极性 梯度洗脱液的制备装置:梯度混合器、梯度三通阀或简易梯度形成装置 梯度形式:直线梯度、阶梯式梯度、凹指数梯度、凸指数梯度以及复合梯度,浓度梯度制造器,6.部分收集及分析 柱的流出液可以用人工的方法收集到一系列试管中或使用部分收集器。这种装置能使每一管按
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