生物大分子的分离与纯化.ppt

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1、生物大分子的分离、纯化与鉴定,实验目的,1.学习科学课题研究的基本程序。2.培养创新意识、独立思考、分析和综合问题的能力。启发学生查阅文献，自己设计试验方案和步骤 3.正确设计从生物样品中分离纯化生物大分子的技术路线和正确实施设计方案,过氧化氢酶,过氧化氢酶,过氧化氢酶(Catalase)是一种广泛存在于需氧动植物及微生物细胞中的氧化还原酶,结构上由4个具有相同多肽链的亚基组成,生物学功能是催化细胞内H2O2 分解,防止过多H2O2对细胞的危害。现今过氧化氢酶已广泛应用于农业、纺织业、食品与乳制品业、纸浆和造纸业以及农业环保产业中,其制备的研究越来越受到人们的重视。目前已有从牛肝,猪肝,动物血

2、液、贻贝以及人胎盘等中分离纯化过氧化氢酶方法的报道,但不同程度上存在制备效率不理想、成本昂贵、技术要求高等问题。,实验原理,1.离子交换层析原理:固定相为离子交换剂，是利用离子交换剂对各种离子有不同的亲和力，来分离混合物中各种离子的层析技术。2.凝胶过滤层析原理:也称分子筛层析、排阻层析。是利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，根据被分离物质的分子大小不同来进行分离。,3.电泳法的基本原理:电泳（electrophoresis）是指带电荷的溶质或粒子在电场中向着与其本身所带电荷相反的电极移动的现象。物质分子在正常情况下一般不带电，即所带正负电荷量相等，故不显示带电性。但是在一定的物理作用或化学反

3、应条件下，某些物质分子会成为带电的离子（或粒子）。不同的物质，由于其带电性质、颗粒形状和大小不同，因而在一定的电场中它们的移动方向和移动速度也不同，因此可使它们分离。,实验材料与试剂,1.家鸭肝脏取自健康活鸭2.试剂：0.05 mol/L 的磷酸缓冲液(pH=7.2)，硫酸铵，01 mol/LNaCl，正丁醇,实验仪器,1.电泳仪、垂直板电泳槽。2.微量加样器3.烧杯、吸量管、滴管、微量加样器4.离心机、蠕动泵5.玻璃层析柱、螺旋夹、铁架台、试管,实验步骤,1.粗酶液的制备：1）称取新鲜鸭肝100 g,用自来水洗净,再用消毒双蒸水漂洗干净.按1:5 的比例加入预冷的0.05 mol/L 的磷酸

4、缓冲液(p H 7.2),用高速组织捣碎机捣碎,置于4 冰箱抽提2 h;离心(6 000 r/min,4,30 min),收集上清液。2）盐析法粗提过氧化氢酶:加入硫酸铵至40%饱和度,离心(6 000 r/min,4,30 min)去沉淀,上清中再加硫酸铵至60%饱和度,离心收集沉淀。,3）透析法纯化过氧化氢酶:将沉淀重溶于0.05mol/L的磷酸缓冲液(pH=7.2)中,4 透析过夜,然后按11的比例向透析液中加入预冷的正丁醇进行脱脂,4静置过夜.然后6000r/min离心,弃去沉淀以及正丁醇层,重复2次,得粗酶液.,2.DEAE2Sep haro se 离子交换层析：用磷酸缓冲液(0.0

5、5 mol/L,p H=7.2)平衡至少4 倍柱体积(20 mL),上样5 mL.用01 mol/LNaCl溶液(含0.05 mol/L,p H=7.2 的磷酸缓冲液)进行梯度洗脱,流速30 mL/h,每管收集5 mL,紫外监测波长为280 nm;测定各管过氧化氢酶活性和蛋白含量;收集活性较高的各管酶液,4 透析过夜,冷冻干燥后进行凝胶过滤.,3.Sep hacryl S2200 凝胶过滤柱层析 Sephacryl S2200 凝胶柱按产品说明书要求处理,装柱(16 mm 835 mm)后,用磷酸缓冲液(0.05 mol/L,pH=7.2)冲洗一定体积,上样2 mL.用磷酸缓冲液(0.05 m

6、ol/L,pH7.2)进行洗脱,流速18 mL/h,每管收集3 mL;测定每管过氧化氢酶活性和蛋白含量;收集活性较高的各管酶液,4 透析、冷冻干燥,得到过氧化氢酶纯品.,4.电泳分析 分离纯化过程中,采用12%分离胶的SDS-PAGE分离蛋白,用考马斯亮兰R-250 显色,观察各阶段产物的纯度变化,分析纯化效果,并鉴定纯化产物的大小。,实验结果预期,Sep hacryl S2200 凝胶层析测得鸭肝过氧化的全分子量为250 KD,SDS2PA GE 法测其多肽链分子量为6215 KD,表明鸭肝过氧化氢酶由4 条相同的多肽链组成.,注意事项,1.过氧化氢酶的最适温度与热稳定性 鸭肝过氧化氢酶的最适温度为40 左右，2040 具有较好的热稳定性,保温60 min 活性保留原有活性的90%以上.该酶60 保温60 min 活性丧失50%以上,65 保温10 min 活性损失殆尽。2.过氧化氢酶的最适pH与pH稳定性 鸭肝过氧化氢酶在p H 710 左右时活性最强,p H 510715 活力较高,超出其范围活力较低。鸭肝过氧化氢酶在p H 38 的范围内是比较稳定的,在p H58 的范围内活性基本保留原有活性的90%以上,p H 910 时,残余酶活力不到60%,谢谢！,