生物化学第十五章基因技术.ppt

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1、第十五章基因技术,哈尔滨医科大学生物化学与分子生物学教研室 高旭 刘兴汉,1 基因工程 2 分子杂交 3 聚合酶链反应 4 DNA序列测定 5 转基因动物 6 基因剔除技术 7 克隆动物 8 基因诊断和基因治疗,基因操作技术,第一节 基因工程,（Genetic engineering）,一、基因工程的基本概念,（一）重组DNA技术的基本定义（二）基因工程的基本定义（三）克隆的定义,（一）重组DNA技术（recombinant DNA technology）是指在体外按人们的意愿将不同的 DNA分子重组的技术。,是指利用重组DNA技术将目的基因 和载体重组，再导入受体细胞内进行扩 增和表达的过程

2、。,（二）基因工程(Genetic engineering),是指通过无性繁殖过程所产生的 与亲代完全相同的子代群体。基因工程相当于目的基因的无性 繁殖过程，也称其为基因克隆(gene cloning)。,（三）克隆（clone）,(一)工具酶(二)载 体,二、基因工程操作中常用的工具,（一）工具酶,1 限制性内切酶2 T DNA连接酶3 大肠杆菌DNA聚合酶4 逆转录酶5 T4多核苷酸激酶6 碱性磷酸酶7 末端脱氧核苷酸转移酶,1限制性内切酶(restriction endonuclease),定义:一类能识别和切割双链DNA 分子中特定碱基序列的核酸水解酶。,分类:、,作用：与甲基化酶共同

3、构成细菌的限制修饰 系统，限制外源DNA，保护自身DNA。,命 名：第一个字母代表细菌的属名，用大写；第二、三个字母是该细菌种名，用小写；第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序。,EcoR E=Eschrichia属 co=coli种 R=RY13菌株=发现的第一个限制酶,限制性内切核酸酶,型限制酶识别序列特点 回文结构,3 C G A C T T A A G C T C 5,5 G C T G A A T T C G A G 3,EcoR的切割位点,EcoR的识别序列,EcoR Hpa GAATTC GTTAAC CTTAAG CAATTG G CTTAA 粘端切口 平端切口,+,A

4、ATTC,G,GTTCAA,+,AACTTG,切口：粘性切口和平端切口,2.其他相关酶类,T DNA连接酶用于互补粘性末端和 平端DNA分子之间的连接。大肠杆菌DNA聚合酶具有53的聚合 作用，53外切作用和35的外切作用。逆转录酶是以mRNA为模板合成互补DNA即cDNA，用于组建cDNA基因文库。,T多核苷酸激酶能催化ATP的-磷酸 转移到DNA或RNA的5端羟基上。碱性磷酸酶简称AKP，此酶能特异的切除DNA或RNA5端的磷酸产生5端羟基以 防止载体的自身连接。末端脱氧核苷酸转移酶能催化单核苷酸转 移到DNA的3端的羟基上。,（二）载体,是携带目的DNA片段进入受体 细胞进行扩增和表达的

5、工具。常用载体：质粒 噬菌体 粘粒 病毒,1.质粒（plasmid）,特点：能在宿主细胞内独立复制，带有某些遗传信息，会赋予宿主 细胞一些遗传性状。,定义：是染色体外能自我复制的 双链环状小分子DNA。,pUC19质粒的物理图谱,pBR322质粒,基因工程中使用的质粒具备的特点,质粒的复制型 分为松弛型和严谨型两类。质粒的不相容性 作为载体的质粒一般是不相容的。质粒的接合性 用作载体的质粒都是非接合性质粒。多克隆位点 即多种限制性内切酶的单一识别序列。筛选标记 常用双抗生素抗性插入失活筛选标记和 蓝白菌落筛选标记。,2.噬菌体（bacteriophage,phage）,3.粘粒(cosmid)

6、：,由噬菌体的cos区与pBR322质粒组合的杂种载体。粘粒可克隆29-45kb的大片段，常用作建立真核基因组文库的载体。,4.病毒（virus）,病毒载体更多用于真核表达系统，如腺病毒，腺病毒相关病毒、痘病毒，逆转录病毒，猴空泡病毒等。,三、基因工程的操作过程,（一）目的基因的获得（二）目的基因与载体的连接（三）重组体导入受体细胞（四）基因工程菌的筛选（五）外源基因的表达,（一）目的基因的获得,3.人工合成法 要求已知目的基因的核苷酸序列或其产物 的氨基酸序列,1.构建基因组DNA文库,基因组DNA文库(genomic DNA library),2.构建cDNA文库 cDNA文库(cDNA

7、library),4.聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR),将某种生物的基因组DNA切割成一定大小的片段，分别与适合的载体重组后导入宿主细胞，这些重组分子中插入片段的总和可代表该生物全部基因组序列。这种通过重组、克隆方法保存在宿主细胞中的各种DNA重组分子的集合体称为基因组DNA文库。,基因组DNA文库(genomic DNA library),构建基因组DNA文库的过程,（二）目的基因与载体的连接,1.同源粘性末端连接 2.平端连接 3.定向连接,1.同源粘性末端连接,方式：同一限制酶切割位点连接配伍末 端连接,2.平端连接,适用于：限制性内切酶产生的平

8、端切割 粘性未端或切平形成的平端,3.定向连接,适用于：两种不同的粘性末端 一个粘端，一个平端,目的基因与载体的连接,（三）重组体导入受体细胞,1.受体菌的条件：安全宿主菌 限制酶和重组酶缺陷 处于感受态,2.导入方式：转化(transformation)转染(transfection)转导(transduction),（四）基因工程菌的筛选,1.抗药性标记选择2.标志补救：互补3.分子杂交法：原位杂交 Southern印迹4.免疫学方法:如免疫化学方法 酶免检测法,pBR322质粒双抗生素抗性,1.抗药性标记选择,bla=氨苄青霉素抗性基因Ori=复制起始点lacZ=-半乳糖苷酶N端编码序列

9、质粒pUC18-蓝白菌落筛选标记,2.标志补救：互补,3.分子杂交法：,（五）外源基因的表达,1.原核表达体系-大肠杆菌 标准：复制子，筛选标志，多克隆位点 强启动子,SD序列，终止子。,不足：不宜表达真核基因组DNA 不能加工表达的真核蛋白质 表达的蛋白质常形成不溶性包涵体 很难表达大量可浴性蛋白,2.真核表达体系 优点：重组质粒转染的细胞具有遗传的稳定性和可重复性 哺乳动物细胞能对外源基因转录的hnRNA剪切加工 成成熟的mRNA 对表达的蛋白质能进行转录后的加工如糖基化 可将表达产物分泌到培养基中方便下游的提纯,缺点：操作技术难 费时 不经济,基因工程的操作过程,第二节 核酸分子杂交（n

10、ucleic acid hybridization）,以DNA的变性和复性为理论基础。分子杂交是不同来源的单链核酸通过碱基互补形成杂合双链的过程。,核酸分子杂交：,分子杂交的目的：检测DNA和RNA,一、核酸探针（probe）,是分子杂交的技术基础，它是一段与被检测的核酸序列互补的带有标记的核苷酸片段，长度一般为十几到几千个碱基不等。,核酸分子与探针杂交,探针标记方法,（一）放射性同位素标记（二）光敏生物素标记（三）地高辛标记物（四）分子信标,（一）同位素探针：32P:常用，灵敏度高，半衰期短，穿透力强 3H：分辨力高，半衰期长，适合原位杂交 35S:标记蛋白，也可用S取代磷酸中的O,杂交后通

11、过放射自显影检测,(二)光敏物质,光敏物质,生物素,冷光,链酶亲和素,酶标抗体,酶促生物素,（三）酶促生物素,（三）地高辛,（四）分子信标：荧光标记,二、分子杂交的方法,（一）斑点杂交(dot blot hybridization)（二）原位杂交(in situ hybridization)（三）转移印迹技术,提取DNA或RNA，直接点在硝酸纤维素膜上，和探针杂交 检查有没有目的DNA或RNA。,硝酸纤维素膜,1,2,3,4,（一）斑点杂交：,Slot blot,Dot blot,DNA点阵:将多种探针序列成排的点在硝酸纤维素膜上，检测DNA或RNA和那一个探针杂交。待检样品进行标记 一种样品

12、多种探针,基因芯片：将更多的探针排列在硅片上，借助计算机检测未知的DNA或RNA和哪一个探针杂交。,基因芯片,（二）原位杂交 1.组织切片或细胞涂片原位杂交：将DNA或RNA在组织切片和细胞涂片中变性和固定，和探针杂交，确定DNA或RNA在组织和细胞中的定位。2.菌落或噬菌斑原位杂交：基因工程中筛选阳性克隆。,菌落原位杂交示意图,3.转移印迹技术：,先用电泳将DNA或RNA条带分开，再转移到硝酸纤维素膜上，与探针杂交，鉴定待测DNA或RNA。,Southern blotting:检测DNANorthern blotting:检测RNAWestern blotting:检测蛋白质，因要用抗体检测

13、，也叫免疫印迹（Immunoblotting）在众多样品中哪一个是目的DNA、RNA 或目标蛋白质。,三种印迹技术的比较,Southern印迹杂交(Southern blotting)Northern印迹杂交(Northern blotting)Western印迹杂交(Western blotting),第三节 聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction,PCR）,PCR技术是1985年由美国科学家Mullis建立，荣获1993年诺贝尔化学奖。,PCR方法被美国Science杂志编辑部评为1989年的十大科技成就之一，而Taq DNA聚合酶被评选为象征1989年的“年分子

14、”(the molecule of year),一、PCR工作原理,PCR是一种在体外由引物介导的DNA酶促合成反应，也叫基因扩增技术，类似体内的DNA复制过程。主要是利用DNA聚合酶依赖DNA模板的特性，在一对引物间诱发聚合酶反应。PCR具有特异性强，灵敏度高，操作简便，对待检材料质量要求低等特点，能够快速扩增任何目的基因。,PCR反应第一次循环,PCR反应第二次循环,二、PCR体系的基本成分,1xPCR缓冲液模板DNA g水平，或104拷贝特异引物 各0.10.5mol/LTaq DNA聚合酶 0.52.5 单位dNTP 各50200mol/L Mg2 1.52 mol/L,三、PCR的基

15、本反应步骤,（一）DNA的微量分析（二）目的基因的克隆（三）测定基因的表达水平（四）基因的定点突变,四、PCR的主要用途,PCR技术是生命科学领域中的一项革命性创举和里程碑。广泛应用于临床医学、遗传咨询、司法鉴定、考古、工业、农业及分子生物学等各个领域,第四节DNA的序列分析(DNA sequence analysis),DNA序列分析的基本原理,1.双脱氧合成末端终止法(Sanger法)2.化学修饰法(Maxam-Gillbert法),1.双脱氧合成末端终止法测序,2脱氧核糖 2，3双脱氧核糖,2.化学修饰法测序基本原理,第五节 转基因动物、克隆动物 和基因剔除技术(Transgenic,c

16、lone animal and gene knockout technique),一、转基因动物,将外源基因导入动物的受精卵，再将受精卵植入到代孕动物的 输卵管或子宫中培育的动物。,（一）转基因小鼠的技术路线,通过病毒载体导入ES细胞建立,成功转入生长激素基因的转基因鼠,（二）应用,1.能够创造医学研究需要的动物模型 2.改良动物品质 3.培育动物新品种,二、克隆动物,克隆是英语clone的音译，即无性繁殖系。克隆动物是生物体通过体细胞进行的无性繁殖以及由无性繁殖形成的基因型完全相同的后代个体组成的种群。,1.制备成熟的卵细胞 2.细胞核移植，将供体细胞的细胞核与 去核的卵细胞融合成一个杂合细

17、胞 3.将“核质融合”的卵细胞移植到借腹怀 孕动物的子宫发育直到出生,（一）克隆动物技术主要包括三个步骤,三、基因剔除技术,通过DNA定点同源重组，定向地去除基因组中的某一基因，称为基因敲除（gene knockout）或基因剔除。基因剔除技术目前主要在小鼠的胚胎干细胞中进行。,（一）基因剔除的技术路线,1.先将待剔除基因的同源基因片段与质粒载体重组 2.重组质粒转入小鼠的胚胎干细胞(ES cell)3.ES cell注入胚泡，胚泡植入子宫培育嵌合体小鼠4.嵌合体小鼠与野生型小鼠交配产生嵌合体小鼠，证明生殖细胞中的基因已被剔除5.嵌合体小鼠之间交配，得到基因剔除的纯系小鼠,（二）基因敲除的基本

18、原理,第六节 基因诊断与基因治疗(Gene diagnosis and gene therapy),基因诊断,是指利用分子生物学和分子遗传学的技 术方法通过直接检测基因结构是否改变、基因 表达有否异常，对疾病作出诊断。,基因诊断的特点,1.针对性强 2.灵敏度高 3.适用范围广 4.早期诊断,一、基因诊断的常用技术和方法,1.分子杂交 2.PCR 3.DNA序列测定 4.多态性分析,(一)基因突变的诊断方法,1.点突变的诊断方法 2.插入和丢失片段的诊断方法 3.限制性片段长度多态性分析,（二）基因表达异常的诊断（三）外源基因侵入的诊断,二、某些疾病的基因诊断,1.遗传性疾病的基因诊断 2.感

19、染性疾病的基因诊断 3.肿瘤的基因诊断 4.基因诊断在法医学鉴定中的应用,基因治疗,早期-将通过基因转移技术用正常基因 原位置换有缺陷的基因治疗单基 因遗传病叫做基因治疗。目前-广义上来讲,将某种遗传物质转移 到患者细胞内,使其在体内发挥作 用,以达到治疗疾病目的方法，均 称为基因治疗。,一、基因治疗的基本方法 1.基因矫正（gene correction）2.基因置换（gene replacement）3.基因增补（gene augmentation）4.基因失活（gene inactivation）,常见的几种基因失活方法 反义核酸 核酶 基因剔除技术,二、基因治疗的基本程序,治疗基因的选

20、择 基因载体的选择-病毒载体 非病毒载体 靶细胞的选择-体细胞 生殖细胞 基因转移的方法-病毒介导 非病毒介导 外源基因表达的检测-利用在体内的标记基因,基因治疗基本原理,问 题,单 选 题,A在分子水平上的操作，在分子水平上表达B在分子水平上操作，回到细胞水平上表达C在细胞水平上操作，在分子水平上表达D在细胞水平上操作，在细胞水平上表达E在细胞水平上操作，在整体水平上表达,1.基因工程的特点是:,2.实验室常用的连接外源性和载体的酶是:,ATaq酶 B T4 DNA连接酶 CDNA聚合酶IDDNA聚合酶II EDNA聚合酶III,3.不能用作克隆载体的是:,A质粒B噬菌体DNAC细菌基因组D

21、NAD腺病毒E逆转录病毒,4.用来鉴定蛋白质的技术是:,A亲和层析BSouthern印迹杂交CNorthern印迹杂交DWestern印迹杂交E离子交换层析,5.F因子从一个细胞转移到另一个细胞的基因转移过程称为:,A转化B转导C转染D转座E接合,6.用来鉴定RNA的技术是:,A Northern印迹杂交B Southern印迹杂交C Western 印迹杂交 D 离子交换层析E 亲和层析,7.克隆羊多莉的诞生是应用：,A转基因技术B核转移技术C基因剔除技术D基因同源重组技术E基因克隆技术,8.关于基因工程的叙述错误的是:,A根据实验目的选择目的基因B选择一个合适的载体C将目的基因和载体分别用

22、限制性内切酶切DT4连接酶只用于连接目的基因和载体黏性 末端E将重组体转化到细胞中的过程不是绝对的,8.关于基因工程的叙述错误的是:,A根据实验目的选择目的基因B选择一个合适的载体C将目的基因和载体分别用限制性内切酶切DT4连接酶只用于连接目的基因和载体黏性 末端E将重组体转化到细胞中的过程不是绝对的,9.下列哪项不是限制性内切酶的特点？,A仅存在原核细胞中B是一种水解酶C能识别双链中的特定碱基顺序D具有一定外切酶的活性E酶切辨认的碱基顺序一般具有回文结构,10.互补筛选法属于：,A抗药性标志筛选B酶联免疫筛选C标志补救筛选D原位杂交筛选E免疫化学筛选,11.下列哪项不适合作cDNA文库探针?

23、,A基因外显子B基因内含子CcDNA D RNA E 寡核苷酸,12.重组DNA技术常用的限制性内切核酸酶为:,A类酶 B类酶C类酶D类酶E类酶,13.下列哪种染料不是核酸电泳的染色剂?,A溴乙锭B银试剂C考马斯亮蓝D丫啶橙E亚甲蓝,14.重组的连接方式不包括：,A粘性末端连接B平头末端连接C粘性末端与平头末端连接DDNA连接子技术EDNA适配子技术,15.可识别并切割特异序列的称为,A限制性核酸外切酶B限制性核酸内切酶CDNA酶D非限制性核酸外切酶E非限制性核酸内切酶,16.下列哪项不是限制性内切酶的作用特点?,A特异性很高B常由个核苷酸组成C限制性内切酶识别的位点一般具有回文结构D少数内切

24、酶的识别位点中的碱基可以有规律 地替换E限制性内切酶的切口均为粘性末端,17.下列哪种条件不适合用于核酸的分离提取?,ADNA溶液的pH值是410B因所有溶液内均含有EDTA，故实验所用的器 皿和溶液不需灭菌处理C避免强烈高速的振荡D尽量简化操作步骤E避免将细胞突然置于低渗溶液中,18.在重组技术中催化形成重组分子的是:,A DNA聚合酶B DNA解链酶C DNA连接酶D 拓扑酶E DNA内切酶,19.基因重组不包括:,A转化B转换C整合D转导E转位,20.关于原位杂交的叙述，正确的是：,A 在DNA芯片上进行杂交B 直接在组织切片上或细胞涂片上杂交C 将核酸点在NC膜上直接进行杂交D 即DN

25、A点阵法E 在凝胶中进行杂交,多 选 题,1.载体和目的基因的连接效率最高而且是定向连接的是：A 两种不同限制性内切酶产生的粘性末端B 一种限制性内切酶产生的粘性末端C 一个粘性末端和一个平端D 两个酶切产生的平端E 两个由粘性末端补平产生的平端,2.RNA诊断常用的方法：,A RNA点杂交B Northern印迹分析C Southern印迹分析D 定量逆转录PCRE Western印迹分析,3.基因诊断的方法包括：,A 核酸分子杂交B PCRC ASO法D 基因测序E 基因芯片,4.基因治疗的基本过程包括：,A 治疗性基因的选择B 载体的选择C 靶细胞的选择D 基因转移E 回输体内,5.关于

26、DNA链末端合成终止法的叙述，正确的是：,A 以ddNTP和dNTP作原料 B 以32P、35S或荧光染料标记DNAC 反应开始即加入ddNTPD ddNTP和dNTP比例要适合E 需将待测DNA克隆入质粒或噬菌体,B 型 题,A.基因、载体的切割B.重组DNA分子导入受体细胞C.外源基因与载体连接D.表达目的基因编码的蛋白质E.筛选、繁殖含有重组分子的受体细胞1.()产生重组分子2.()需要限制性内切核酸酶3.()获得DNA克隆4.()应用转化、转染技术,答 案,1.基因工程的特点是（B）在分子水平对DNA进行人为切割与重组，在细胞、整体水平进行表达是基因工程技术的基本特点。,2.实验室常用

27、的连接外源性和载体的酶是（B）T4 DNA连接酶连接的效率高，而且即可以连接黏性末端，也可以连接平末端。,单选题答案,3.不能用作克隆载体的是（C）细菌基因组DNA不具备载体DNA可进出细胞、并进行外源DNA连接、克隆等特性。,4.用来鉴定蛋白质的技术是（D）Western 印迹杂交是利用抗原与抗体特异性结合反应而对蛋白质进行鉴定的技术。,5.F因子从一个细胞转移到另一个细胞的基因转移过程称为(E）较大的F质粒通过结合作用进行细胞间的转移过程。,6.用来鉴定RNA的技术是（A）Northern blotting 技术是将RNA分子转移到固相支持物上进行探针检测的技术。常用于基因表达的特异性分析

28、和定量分析。,7.克隆羊多莉的诞生是应用：（B)克隆动物即将成年动物的体细胞核与去核的卵细胞质融合，转入另一个动物子宫去发育繁殖。克隆羊多莉就是第一只成功诞生的克隆动物。,8.关于基因工程的叙述错误的是（D）T4 DNA连接酶可以连接黏性DNA末端，也可以连接平头DNA末端，是基因工程技术中常用的DNA连接酶。,9.下列哪项不是限制性内切酶的特点？（D）限制性核酸内切酶是识别DNA分子中特异性位点、并进行切割磷酸二酯键的酶，不具外切酶的活性。,10.互补筛选法属于：（C）pUC系列等质粒上有LacZ基因片段，LacZ基因片段编码-半乳糖苷酶的氨基端片段。此片段能与宿主细胞所编码的缺陷型-半乳糖

29、苷酶基因内互补，形成完整的-半乳糖苷酶。此酶分解X-Gel，产生蓝色菌落。LacZ基因片段内有多克隆位点，插入外源基因后不能合成完整的-半乳糖苷酶来分解 X-Gel，产生白色菌落。此法既为互补筛选法，属于标志补救筛选。,11.下列哪项不适合作cDNA文库探针（B）cDNA 是成熟mRNA经逆转得到的互补DNA，已经切除了内含子，用内含子做成的探针是不能进行检测的。,12.重组DNA技术常用的限制性内切核酸酶为:（B)型限制酶能识别双链DNA的特异序列并在该序列内将DNA切断。基因工程操作中常用型限制性内切酶。,13.下列哪种染料不是核酸电泳的染色剂（C）考马斯亮蓝，三苯基甲烷，分子中含偏酸性基

30、团与蛋白质碱性基团结合，可作为蛋白质染料，一般不做核酸电泳的染色剂。,14.重组的连接方式不包括（C）重组DNA技术中常用的连接方式是黏性末端连接、平头末端连接。适配子、人工接头连接也不进行黏性末端与平头末端的连接。,15.可识别并切割特异序列的称为（B）限制性核酸内切酶的特点是识别、切割DNA分子内部的特异序列。是细菌体内存在的保护性酶类，已被人类进行改造，成为基因工程技术中常用的工具酶。,16.下列哪项不是限制性内切酶的作用特点（E）限制性内切酶作用的结果还可产生平头末端。,17.下列哪种条件不适合用于核酸的分离提取（B）EDTA 不是灭菌剂，故在无菌试验中，器皿、溶液需要消毒、灭菌。,1

31、8.在重组技术中催化形成重组分子的是(C)DNA连接酶可催化两个DNA片段之间形成磷酸二酯键进行共价连接完成重组过程。,20.关于原位杂交的叙述，正确的是（B）原位杂交是用核酸探针与细胞和组织切片中的核酸进行杂交并对其进行检测的方法。分为细胞原位杂交和组织切片原位杂交。,19.基因重组不包括（B）转换是DNA损伤的一种形式，一种嘧啶被另一种嘧啶、一种嘌呤被另一种嘌呤取代所致，不属于基因重组的内容。,多选题答案,1.载体和目的基因的连接效率最高而且是定向连接的是：（AC）粘性末端的连接效率高于平端，平端和一个酶产生的粘性末端连接不能保证定向连接2.RNA诊断常用的方法：（ABD）Southern

32、印迹分析是用来检测DNA样品的；而Western印迹分析是用来检测蛋白质样品的。剩余三项均是检测RNA的。,3.基因诊断的方法包括：（ABCDE）4.基因治疗的基本过程包括：（ABCDE）5.关于DNA链末端合成终止法的叙述，正确的是：(ABDE)需先反应一段时间，合成一定长度的片段，再加入ddNTP，否则只有短片段，没有长片段。,B型题答案,1.(C)产生重组分子2.(A)需要限制性内切核酸酶3.(E)获得DNA克隆4.(B)应用转化、转染技术 基本的重组DNA技术操作过程可归纳为“分、切、接、转、筛”，即分离目的基因，限制酶切目的基因与载体，拼接重组体、转入受体菌、筛选重组体。,科学家的故

33、事,Dulbecco和Temin从1958年起，对当时劳斯分离的鸡肉瘤病毒（RSV）的同类病毒-多瘤病毒进行分子生物学的研究，几年后又分离到一种猿猴病毒SV40。这些发现促使他们认识到癌与病毒的关系。他们的第一项发现是，SV40病毒的DNA是一种原病毒，它和宿主细胞的DNA形成永久性双链结合。第二项发现是，病毒在细胞里的增殖激发了细胞染色体DNA的复制。第三项发现是，激发染色体DNA复制的早熟型病毒基因也控制着伴随癌变而发生的细胞表面的变化。,Dulbecco、Temin与逆转录酶,Temin于1960年在研究RSV并提出转化假说的基础上，正式创立原病毒假说：有感染力的RSV的RNA的作用是病

34、毒DNA(即原病毒)合成的模板，而原病毒则是子代RSV的RNA合成的信息。他的假说很久未被注意，亦未被实验证实。1969年他用实验证实RSV含有一种DNA的聚合酶，这种酶的活性是“内源性RNA引导的DNA聚合酶活性”，该酶以后被称为“RNA依赖性的DNA聚合酶”或“逆转录酶”。这个发现补充了原来人们无怀疑的“中心法则”。,The Nobel Prize in Physiologyor Medicine 1975 for their discoveries concerning the interaction between tumour viruses and the genetic mate

35、rial of the cell,David Baltimore 1/3 of the prize USA Massachusetts Institute of Technology(MIT)Cambridge,MA,USA b.1938,Howard Martin Temin 1/3 of the prize University of Wisconsin Madison,WI,USA b.1934d.1994,The Nobel Prize in Physiologyor Medicine 1975 for their discoveries concerning the interact

36、ion between tumour viruses and the genetic material of the cell,Renato Dulbecco 1/3 of the prize USA Imperial Cancer Research Fund Laboratory London,United Kingdom b.1914(in Catanzaro,Italy),The Nobel Prize in Physiologyor Medicine 1975 for their discoveries concerning the interaction between tumour

37、 viruses and the genetic material of the cell,Nathans从事猿猴病毒SV40研究时，收到科学家Smith的一封信，通报他分离内切酶成功。Nathans将史密斯的成果与其研究进行比较，他观察到，当噬菌体从细菌染色体上切割下来时，有时会发生错误，使异常的基因组从宿主基因组上得到一个片段；并且基因组也丢失一个片段，这个片段有噬菌体增殖所必不可少的基因。他运用演绎推理,提出一种推测，认为修饰的机理可能在于DNA限制性内切酶的存在。以后通过若干试验，进一步做出判断：限制作用与噬菌体DNA降解相关联。1965年他完整的提出一个假说：可能存在一种位点专一的限

38、制性内切酶。但1968年他分离到的却是位点并不专一的限制酶。,限制性内切酶,1968年初正在研究流感嗜血杆菌Rb株遗传重组的Smith，在实验中偶然选用了噬菌体P22标记DNA,又偶然地遇到了无法从细菌细胞中回收外源DNA这样一个实验结果。当时他得到Arber已经分离到内切酶的消息，便联想到自己的工作，意识到手中的噬菌体DNA可能受到了限制作用。于是他立刻放下这一研究课题，应用自己设计的粘度计，全力以赴分离和研究预想中的限制酶。1970年终于分离到真正位点专一的限制性内切酶，从而使Arber的假说变为一种科学学说。,The Nobel Prize in Physiology or Medici

39、ne 1978 for the discovery of restriction enzymes and their application to problems of molecular genetics,Werner Arber 1/3 of the prize Switzerland Biozentrum der Universit Basel,Switzerland b.1929,Daniel Nathans 1/3 of the prize Johns Hopkins University School of Medicine Baltimore,MD,USA b.1928d.19

40、99,The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1978 for the discovery of restriction enzymes and their application to problems of molecular genetics,The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1978 for the discovery of restriction enzymes and their application to problems of molecular genetics,Hamilton

41、O.Smith 1/3 of the prize Johns Hopkins University School of Medicine Baltimore,MD,USA b.1931,1943年人们已知胰岛素是由51个氨基酸构成的,Sanger用特殊的化学试剂以及电泳、色谱等方法，逐段对其分解测定，经过十年努力,终于在1953年精确测定了胰岛素的一级结构。它是由分别含有21个30个氨基酸残基的两条链通过其中两个半胱氨酸的两个SH,氧化后以-S-S-联结起来的。这是人们第一次精确测定蛋白质的结构,为以后测定更复杂的蛋白质结构打下了良好的基础。Sanger为此荣获了1958年的诺贝尔化学奖。,S

42、anger测定胰岛素一级结构并发明DNA测序法,20世纪60年代以后，Sanger的研究方向转向了测定核酸中核苷酸的连接顺序，又获得了1980年诺贝尔化学奖。至目前为止，Sanger是唯一一位两次获得诺贝尔化学奖的科学家。,1971年Berg研究小组用限制性内切酶打开了肿瘤病毒SV40的DNA,然后把噬菌体的一段DNA切割下来，装到被打开的SV40的DNA上，成功获得了SV40-新的杂种,也就是产生了新的生命。由于政府和科学家担心引起不良后果，进一步的工作在1975年才开展。他们把许多基因接到SV40上，并把杂种SV40引入细胞或细菌中。,Berg与基因工程,这就导致了现代“基因工程”的诞生。

43、人们可以把一段能产生某种蛋白质的基因植入某种细菌的DNA中，当细菌繁殖时，这段基因就不断产生这种蛋白质。例如，干扰素、肿瘤坏死因子就是这样产生出来的。Berg作为“基因工程”的开拓者荣获了1980年诺贝尔化学奖的一半。,Berg与基因工程,本年度化学奖的另一半为Gillbert和Sanger获得。作为物理学家的Gillbert受科学交流的启发，使用硫酸二甲酯处理DNA，使DNA中有腺嘌呤和鸟嘌呤的地方断开，从而获得到一系列不同长度的脱氧核苷酸片断。分别测定各个片断，最后就能确定整个DNA中全部脱氧核苷酸的排列顺序。,Berg与基因工程,如果说物理学家Gillbert是用化学方法测定DNA中脱氧

44、核苷酸的顺序，那么化学家Sanger则是用生物学中酶的切割作用把RNA切割成小的片段，来测定核苷酸的排列顺序。他又把DNA双螺旋用酶切割成互补的许多小片段，在进行特殊的电泳分离测定，从而得知DNA中脱氧核苷酸的排列顺序。,Berg与基因工程,生物体中的DNA会不断进行自我复制。但在生物体外,怎样使少量的DNA片段扩增至原来的成千上万倍，甚至几百万倍呢？作为化学家的Mullis在1983年深夜驾车开过绕山的螺旋形公路时，冒出了一个极妙的想法，并在1985年成功的付诸实践,这就是“多聚酶链式反应”，即PCR技术。,Mullis发明PCR技术,这个技术首先根据待扩增的DNA片段两端的脱氧核苷酸序列。

45、化学合成出两条互补的寡聚脱氧核苷酸引物，引物的作用是使DNA片段扩增。然后将过量的合成引物、四种脱氧核苷酸、DNA合成酶和待扩增的DNA片段混合，先高温变性（使DNA片段双螺旋解开），再进行低温退火（使两种引物各与一条DNA链相连接），和中温延伸（引物加DNA的两条链分别都1变2,2变4,以2n倍速扩增，每一循环才几分钟，几十分钟后就可以使原来的DNA片段扩大几万、几十万甚至一百多万倍，为人类进行微量遗传物质的分析研究提供了极为有效的方法。,Mullis发明PCR技术,Smith是在喝咖啡时，与同事的讨论中想到了一个进行定点诱变的好主意。这个主意付诸实践就是：先把有待突变的DNA 克隆到M13

46、噬菌体上。使之感染细菌，在细菌体内感染繁殖复制，提取出单链的DNA，加入突变的引物（合成的寡聚脱氧核糖核苷酸），使之与带有目的DNA单链的M13噬菌体杂交，在加入DNA聚合酶和四种脱氧核苷酸，使杂交后的突变引物延伸，经处理后去感染细菌，从中筛选出带突变DNA序列的突变体。这就是聚核苷酸定点诱变技术,可以用来对任意已知的DNA序列进行改变。这项技术改变了过去盲目诱导突变的方法（如用X光照射）。,Smith建立定点诱变技术,The Nobel Prize in Chemistry 1993,for contributions to the developments of methods withi

47、n DNA-based chemistry,Michael Smith(1932 2000),La Jolla,CA,USA,Kary B.Mullis(1944-),University of British Columbia Vancouver Canada,for his invention of the polymerase chain reaction(PCR)method,for his fundamental contributions to the establishment of oligonucleotide-based,site-directed mutagenesis

48、and its development for protein studies,1973年，美国加利福尼亚大学旧金山分校H.Boyer教授和斯坦福大学的S.Cohen教授共同完成了一项著名的实验。他们将两个质粒载体分别用同样的限制性内切酶切成线性分子，然后用DNA连接酶将这两个线性DNA分子连接起来，从而获得了一个新的重组DNA分子。这是人类历史上第一次有目的的基因重组的尝试。并由此提出了“基因克隆”的策略，世界上各国的生物学家立刻意识到这种对DNA进行重组的技术的重大作用和深远意义，在很短的时间内就开发了大量分离、鉴定、克隆基因的方法。,第一个重组质粒,第一个克隆动物,1997年2月23日，

49、苏格兰罗斯林研究所的Ian Wilmut及其团队宣布克隆了多莉羊。全世界和科学家都被该消息震惊。苏格兰科学家将未受精的卵细胞的核去除，将其与成年绵羊细胞的核融合。培养融合卵，然后移植到替代母亲中。这是首次报道从成年动物的DNA克隆动物。1981年，剑桥大学的Martin Evans，Matthew Kaufman和加州大学旧金山分校的Gail Martin分别独立从培养的母细胞中获得了小鼠胚胎干细胞。这些来自发育中的母细胞内层的未分化细胞为多功能干细胞。这些细胞能够发育分化为多种组织和细胞。,基因打靶技术,1987年，犹他大学的Mario Capecchi和北卡罗来纳大学的Oliver Smi

50、thies分别独立开发了基因打靶技术。该技术可以使特定基因精确导入小鼠ES细胞。它们来源于减数分裂过程中，姊妹染色体交叉交换同源区域的重组机制。生殖细胞中同源重组比较常见，但是在体细胞中比较罕见。这样，外源DNA序列往往随即整合到宿主基因组，偶尔也整合到同源序列。Smithies和Capecchi首创了选择和富集因同源重组而缺失了特定基因的细胞（基因敲除）或者敲入工程化改造基因的细胞（基因导入）的方法。他们也因“基因靶向”技术与英国科学家Martin J.Evans分享了2007年诺贝尔生理医学奖。,The Nobel Prize in Physiology or Medicine 2007,