生物化学核酸的化学.ppt

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1、第四章 核酸的化学,第一节 概述,一、核酸的发现和研究简史,二、核酸的分类和分布,一、核酸的发现和研究简史,1869 Miescher从脓细胞的细胞核中分离出了一 种含磷酸的有机物，当时称为核素（nuclein）,后称为核酸（nucleic acid）；此后几十年内，弄清了核酸的组成及在细胞中的分布。,1944 Avery 等成功进行肺炎球菌转化试验；1952年Hershey等的实验表明32P-DNA可进入噬菌体内，证明DNA是遗传物质。,1953 Watson和Crick建立了DNA结构的双螺旋模型，说明了基因的结构、信息和功能三者间的关系，推动了分子生物学的迅猛发展。,1958 Crick

2、提出遗传信息传递的中心法则，60年代 RNA研究取得大发展（操纵子学说，遗传密码，逆转录酶）。,70年代 建立DNA重组技术，改变了分子生物学的面貌，并导致生物技术的兴起。80年代 RNA研究出现第二次高潮：ribozyme、反义RNA、“RNA世界”假说等等。,90年代以后 实施人类基因组计划（HGP）,开辟了生命科学新纪元。生命科学进入后基因时代：功能基因组学 蛋白质组学 结构基因组学 RNA组学或核糖核酸组学,二、核酸的分类和分布,脱氧核糖核酸（DNA）:遗传信息的贮存和携带者，生物的主要遗传物质。在真核细胞中，DNA主要集中在细胞核内，线粒体和叶绿体中均有各自的DNA。原核细胞没有明显

3、的细胞核结构，DNA存在于称为类核的结构区。每个原核细胞只有一个染色体，每个染色体含一个双链环状DNA。,核糖核酸（RNA）：主要参与遗传信息的传递和表达过程，细胞内的RNA主要存在于细胞质中，少量存在于细胞核中，病毒中RNA本身就是遗传信息的储存者。另外在植物中还发现了一类比病毒还小得多的侵染性致病因子称为类病毒，它是不含蛋白质的游离的RNA分子，还发现有些RNA具生物催化作用（ribozyme）。,第二节 核酸的组成,一、核酸的元素组成,组成核酸的基本元素：C、H、O、N、P；其中P 的含量比较稳定，占9%-10%，通过测定P 的含量来推算核酸的含量（定磷法）。DNA平均含磷量为9.9%，

4、RNA为9.4%。任何核酸都含磷酸，所以核酸呈酸性。,二、核酸的基本组成单位-核苷酸,核酸,核苷酸,磷酸,核苷,碱基,戊糖,核糖,嘌呤,嘧啶,1.核酸完全水解产物,（1）嘌呤碱（purine,Pu）,腺嘌呤（A）,鸟嘌呤（G）,（2）嘧啶碱（purine,Pu）,胞嘧啶（C）,胸腺嘧啶（T）,尿嘧啶（U）,碱基的胺式与亚胺式互变异构,碱基的酮式与烯醇式互变异构,（3）核糖,两类核酸分子组成的比较,2.核苷,3.核苷酸,腺嘌呤核苷酸（AMP）,脱氧腺嘌呤核苷酸（dAMP）,OH,H,腺嘌呤核苷酸（AMP）,鸟嘌呤核苷酸（GMP）,尿嘧啶核苷酸（UMP）,胞嘧啶核苷酸（CMP）,脱氧腺嘌呤核苷酸（

5、dAMP）,脱氧鸟嘌呤核苷酸（dGMP）,脱氧胸腺嘧啶核苷酸（dTMP）,脱氧胞嘧啶核苷酸（dCMP）,稀有碱基,核苷酸衍生物,ATP 分子的最显著特点是含有两个高能磷酸键。ATP水解时,可以释放出大量自由能。ATP 是生物体内最重要的能量转换中间体。ATP 水解释放出来的能量用于推动生物体内各种需能的生化反应。ATP 也是一种很好的磷酰化剂。磷酰化反应的底物可以是普通的有机分子，也可以是酶。磷酰化的底物分子具有较高的能量（活化分子），是许多生物化学反应的激活步骤。,第三节 DNA的结构,一、核酸分子中的共价键二、DNA 一级结构 三、DNA碱基组成的Chargaff规则四、DNA的二级结构五

6、、DNA的三级结构 六、DNA与蛋白质复合物的结构,3-5 磷酸二酯键,核酸分子中核苷酸之间的共价键,DNA 一级结构,一级结构指其核苷酸的排列顺序。由于核苷酸间的差异主要是碱基不同，也称碱基序列。DNA：四种脱氧核苷酸按一定顺序以磷酸二酯键相连形成的聚脱氧核苷酸链。,多聚核苷酸链一端的C5带有一个自由磷酸基，称为5-磷酸端（常用5-P表示）；另一端C3 带有自由的羟基，称为3-羟基端（常用3-OH表示）。多聚核苷酸链具有方向性，当表示一个多聚核苷酸链时，必须注明它的方向是53或是35。规定DNA的书写顺序是5 3。,一级结构的表示法：,线条式,字母式,DNA大小的计算 DNA的分子大小取决于

7、组成DNA的碱基对（bp或kb)的数目DNA分子量=核苷酸对的平均分子量核苷酸对数目DNA分子长度=核苷酸对之间的轴距核苷酸对数目核苷酸对数目=DNA分子量核苷酸对的平均分子量,Chargaff首先注意到DNA碱基组成的某些规律性，在年总结出DNA碱基组成的规律：,腺嘌呤和胸腺嘧啶的摩尔数相等，即 A=T。,鸟嘌呤和胞腺嘧啶的摩尔数相等，即G=C。,含氨基的碱基总数等于含酮基碱基总数，即A+C=G+T。,嘌呤的总数等于嘧啶的总数，即A+G=C+T。,DNA的二级结构,1953年，J.Watson和F.Crick 在前人研究工作的基础上，根据DNA结晶的X-衍射图谱和分子模型，提出了著名的DNA

8、双螺旋结构模型，并对模型的生物学意义作出了科学的解释和预测。,DNA的双螺旋结构的形成,DNA分子由两条DNA单链组成。DNA的双螺旋结构是分子中两条DNA单链之间基团相互识别和作用的结果。双螺旋结构是DNA二级结构的最基本形式。,DNA双螺旋结构特征,（1）DNA分子由两条多聚脱氧核糖核苷酸链(简称DNA单链)组成。两条链沿着同一根假设的中心轴平行盘绕，形成右手双螺旋结构。螺旋中的两条链方向相反，即其中一条链的方向为53，而另一条链的方向为35。,（2）嘌呤碱和嘧啶碱基位于螺旋的内侧，磷酸和脱氧核糖基位于螺旋外侧。碱基环平面与螺旋轴垂直，糖基环平面与碱基环平面成90角。,（3）螺旋横截面的直

9、径约为2 nm，每条链相邻两个碱基平面之间的距离为0.34 nm，每10个核苷酸形成一个螺旋，其螺矩（即螺旋旋转一圈）高度为3.4 nm。并形成大沟和小沟。,0.34nm,大沟,小沟,（4）两条DNA链相互结合以及形成双螺旋的力是链间的碱基对所形成的氢键。纵向靠碱基平面之间的碱基堆积力（即疏水作用）维持其稳定性。,DNA双螺旋结构的意义,该模型揭示了DNA作为遗传物质的稳定性特征，最有价值的是确认了碱基配对原则，这是DNA复制、转录和反转录的分子基础，亦是遗传信息传递和表达的分子基础。该模型的提出是上世纪生命科学的重大突破之一，它奠定了生物化学和分子生物学乃至整个生命科学飞速发展的基石。,DN

10、A结构的多样性,DNA的右手螺旋并不是自然界DNA唯一存在的方式。右手螺旋结构是在生理盐水溶液中提取的DNA的结构，目前将这种结构称为B-DNA。1979年，Alexander Rich发现了左手螺旋，称为Z-DNA，另外也有A-DNA的存在。,DNA的三级结构,DNA的三级结构指双螺旋DNA分子通过扭曲和折叠所形成的特定构象超螺旋结构。,DNA的超螺旋结构,超螺旋,螺旋,大部分原核生物的DNA是共价封闭的环状双螺旋，这种双螺旋还可以再次螺旋化形成超螺旋。当引进的张力与原先右手螺旋的方向相同时，超螺旋的方向是左手的，称为正超螺旋（变紧）；引进张力与原先右手螺旋方向相反时，超螺旋的方向是右手的，

11、称为负超螺旋（变松）。正超螺旋是旋紧双螺旋后形成的，负超螺旋是放松双螺旋后形成的。,松弛型,超螺旋,部分解链,使DNA形成高度致密状态从而得以装入核中；推动DNA结构的转化以满足功能上的需要。如负超螺旋分子所受张力会引起互补链分开导致局部变性，利于复制和转录。,DNA与蛋白质复合物的结构,生物体内的核酸通常都与蛋白质结合形成复合物，以核蛋白（nucleoprotein）的形式存在。DNA分子十分巨大，与蛋白质结合后被组装到有限的空间中。,.病毒.细菌拟核.真核染色体,噬菌体T2结构,动物病毒切面模式图,被膜（脂蛋白、碳水化合物）,衣壳（蛋白质）,病毒粒,突起（糖蛋白）,细菌拟核（nucleoi

12、d）的突环结构,平均一个突环含有约40kpDNA,RNA-蛋白质核心,突环由双链DNA结合碱性蛋白质组成,真核生物：DNA和蛋白质组装成染色体，染色体的基本单位是核小体。核小体由DNA和组蛋白构成。组蛋白有H1，H2A，H2B，H3和H4五种。H2A，H2B，H3和H4各两分子构成核小体的核心，称为组蛋白八聚体。DNA双螺旋分子缠绕在八聚体上构成核小体的核心颗粒。核小体的核心颗粒之间再由DNA和组蛋白H1构成的连接区连接起来形成串珠状结构。核小体进一步旋转折叠形成棒状染色体，将近1 m长的DNA分子容纳于直径只有数微米的细胞核中。,DNA（2nm）,核小体链（11nm，每个核小体200bp）,

13、纤丝（30nm，每圈6个核小体）,突环（150nm，每个突环大约75000bp）,玫瑰花结（300nm，6个突环）,螺旋圈（700nm，每圈30个玫瑰花）,染色体（1400nm，每个染色体含10个玫瑰花200bp）,核生物染色体DNA组装不同层次的结构,染色体的四级结构,第四节 RNA的分子结构,一、RNA一级结构 和类别二、tRNA 的分子结构三、rRNA的分子结构四、mRNA的分子结构,RNA的一级结构,RNA分子中各核苷之间的连接方式（3-5磷酸二酯键）和排列顺序叫做RNA的一级结构。,RNA与DNA的差异 DNA RNA糖 脱氧核糖 核糖碱基 AGCT AGCU 不含稀有碱基 含稀有碱

14、基,RNA的类别,信使RNA（mRNA）：在蛋白质合成中起模板作用；核糖体RNA（rRNA）：与蛋白质结合构成核糖体,核糖体是蛋白质合成的场所；转移RNA（tRNA）：在蛋白质合成时起着携带活化氨基酸的作用。,tRNA 的结构,二级结构特征：单链 三叶草叶形 四臂四环,三级结构 特征：在二级结构基础上进一步折叠扭曲形成倒L型,酵母tRNA Ala 的二级结构,tRNA的二级结构都为四茎四环的三叶草形。其结构特点和名称是：,（1）氨基酸臂或氨基酸茎，由3-端和5-端碱基组成7对互补碱基对的双螺旋区，富含鸟嘌呤，末端为CpCpA-OH，接受活化的氨基酸。,（2）二氢尿嘧啶环，由812个核苷酸组成，

15、含有二氢尿嘧啶。由34对碱基组成的双螺旋区与tRNA其余部分相连，这个双螺旋区叫二氢尿嘧啶臂（茎）。,（3）反密码子环，由 7个核苷酸组成，环中部由 3个碱基组成反密码子，反密码子在蛋白质（肽）合成中能与rnRNA上的密码子配对。次黄嘌呤常出现于此环中。5对碱基组成的双螺旋区叫反密码子臂（茎），反密码子环由此茎与tRNA分子的其他部分相连。,（4）额外环，又可变环（或叉），由318个核苷酸组成，是tRNA分类的重要指标。（5）假尿嘧啶核苷-胸腺嘧啶核糖核苷环，即TC环，由7个核苷酸组成。有5对碱基组成的双螺旋区叫TC臂，由此臂与tRNA的其它部分连接。,tRNA的三级结构,tRNA的三级结构的

16、形状像一个倒写的L字母。它是在二级结构三叶草形的基础上进一步扭曲、折叠而成的。氨基酸茎处在倒 L的一端并与TC茎形成双股螺旋；倒L的另一端为反密码子环，二氢尿嘧啶茎与反密码子茎形成双螺旋；在倒L的拐弯处是TC环和二氢尿嘧啶环。整个分子为扁平状，厚度约2nm，两端间直线距离约7nm，以氢键和疏水作用力维持倒L结构。,rRNA的分子结构,特征：单链，螺旋化程度较tRNA低 与蛋白质组成核糖体后发挥其功能,原核生物核糖体,5SrRNA，5.8SrRNA，28SrRNA,5sRNA的二级结构,mRNA的结构,mRNA是以DNA为模板合成的，携带着DNA的遗传信息，故称信使RNA。mRNA又是蛋白质合成

17、的模板，决定着蛋白质（多肽）中氨基酸的排列顺序。每一种多肽有一种特定的mRNA负责编码，所以细胞内mRNA种类很多。mRNA的分子大小不一，相差甚大。,原核与真核细胞的mRNA在结构上的差异,（1）原核细胞mRNA是多顺反子，即可以编码多条多肽链；真核细胞的mRNA为单顺反子。（2）绝大多数真核细胞的mRNA的3-末端具有一段多聚腺苷酸（poly(A)），而且不同真核细胞的mRNA的3-末端的poly(A)长短不同。而原核细胞的mRNA一般没有poly(A)。,（3）真核细胞mRNA 5-末端有一个特殊的5-“帽子”结构。“帽子”结构和3-末端的poly(A)都有抗核酸外切酶的作用，。原核生物

18、rnRNA一般没有“帽于”结构。,（4）真核细胞5-“帽子”结构的下游和3-poly(A)的上游分别为5-端不编码区和3-端不编码区，二者之间是其编码区。已知5-端不编码区和“帽子”结构是与核糖体结合的区域，与蛋白质合成的起始有关。至于3-端不编码的功能，目前仍不清楚。原核细胞由于没有“帽子”结构，不编码区位于mRNA的两端。,第五节 核酸与核苷酸的理化性质及核酸研究常用技术,一、核酸的物理性质二、核酸的两性解离性质三、核酸的紫外吸收四、核酸的变性、复性和分子杂交五、核酸的熔解温度（Tm）六、核酸的颜色反应,物理性质：DNA相对分子质量很大，一般在1061012，制品为白色絮状物。RNA相对分

19、子质量较小，一般在110万，制品为白色粉末。核苷酸也是白色粉末。DNA、RNA和核苷酸都是极性化合物，易溶于水，难溶于有机溶剂。,核酸及核苷酸中碱基上有可解离基团，如胞嘧啶的N3，嘌呤的N1和N7，可接受质子带正电荷。，磷酸基团可可进行酸性解离袋负电荷。所以，核酸和嘌呤核苷酸、胞苷酸是两性化合物，有等电点。尿嘧啶和胸腺嘧啶不能进行碱性解离，所以它们的核苷酸不是两性化合物。,两性解离性质,紫外吸收性质,DNA和RNA的紫外吸收性质无明显差别。最大吸收峰258nm，最小吸收232nm。它们的纯度常用A260/A280的比值来判断，纯DNA溶液的A260/A280为1.8，纯RNA溶液的A260/A

20、280比值为2.0，样品中若有蛋白质，则A260/A280比值要下降。对DNA和RNA制品，可测定其A260，从而计算出含量。,天然DNA变性DNA核苷酸总吸收值,123,DNA的紫外吸收光谱,核酸的变性、复性和杂交,变性：在物理、化学因素影响下，DNA碱基对间的氢键断裂，双螺旋解开，这是一个是跃变过程，伴有A260增加（增色效应）,DNA的功能丧失。复性（退火）：在一定条件下，变性DNA 单链间碱基重新配对恢复双螺旋结构，伴有A260减小（减色效应）,DNA的功能恢复。,在DNA复性过程中,双链分子的再形成既可以发生在序列完全互补的核酸分子之间,也可以发生在碱基序列部分互补的不同的DNA之间

21、或DNA与RNA之间,这种现象称为分子杂交。利用这一原理，在核酸研究中可引入特制的“探针”。,分子杂交,DNA分子,限制片段,限制性酶切割,琼脂糖电泳,转移至硝酸纤维素膜上,与放射性标记DNA探针杂交,放射自显影,带有DNA片段的凝胶,凝胶,滤膜,用缓冲液转移DNA,吸附有DNA片段的膜,印迹法,DNA分子的熔点,DNA变性从开始到完全解链是在一个相当窄的温度范围内完成 的。定义增色效应达到最大值的50%时的温度称为DNA分子的熔点。用Tm表示。也就是说，当DNA溶液的温度达到Tm时，已经有50的DNA处于解链状态。Tm的大小与其所含碱基中的G+C比例相关，G+C比例越高，Tm值越高。,核酸的

22、显色反应,地衣酚反应,二苯胺反应,定磷,已知RAN的含磷量为9.2，DNA的含磷量为9.5，所以按照常规经典定磷法钼蓝反应可以通过检测核酸中的磷而检测核酸的含量。,核酸的分离纯化的一般步骤：,（1）破碎细胞；（2）除去蛋白质、脂类、糖类等成分；（3）避免激烈搅拌和振荡；（4）除去RNA（或DNA）；（5）抑制相关酶；（6）低温操作。,DNA的分离纯化,（1）在破碎细胞的同时，用浓盐酸或十二烷基硫酸钠（SDS）使DNA与相关的蛋白质解联。（2）蛋白酶K消化以使蛋白质部分分解。（3）通过缓冲液饱和的苯酚抽提以除去蛋白质。（4）通过Rnase消化使RNA降解。（5）利用氯仿-异戊醇处理，进一步除去蛋

23、白质。（6）加入二倍体积的无水乙醇沉淀DNA。（7）琼脂糖凝胶电泳进一步分离和鉴定。,DNA的分离纯化,目前在实验室中常常是将细胞匀浆后进行差速离心，制得细胞核、叶绿体、线粒体和核糖体等细胞器和细胞质，然后再从这些细胞器中分离某一些RNA。,复习题,1.某DNA样品含腺嘌呤15.1%（按摩尔碱基计），计算其余碱基的百分含量。2.DNA双螺旋结构是什么时候，由谁提出来的？试述其基本特点。这些特点能解释哪些最重要的生命现象？3.计算（1）分子量为3105的双股DNA分子的长度；（2）这种DNA一分子占有的螺旋圈数。（一个互补的脱氧核苷酸残基对的平均分子量为618）4.名词解释：变性和复性 分子杂交 增色效应 TmChargaff定律,又结束一章了！,