生物制药工艺学中亲和层析.ppt

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1、生物制药工艺学Biopharmacetical Technology,第七章 亲和层析 Affinity Chromatography,亲和层析(Affinity Chromatography,AC)亲和层析的基本概念 亲和层析载体的性质与选择 亲和层析配基的性质与选择 载体、配基、目的物的连接（难点）亲和层析的基本操作(重点）,第一节：亲和层析（Affinity Chromatography）的基本概念及特点：一、基本概念：(basic concept)：1：亲和层析是利用待分离物质与其特异性配基之间特异性的亲和力进行分离的一类特殊的层析技术.Typically offers puritie

2、s 95%in one step.2：配基（ligand）：被固定在基质上的分子称为配基，配基和基质是以共价键结合的。3：基质（matrix):亦称为载体（vector):是 构成固定相的骨架。,二：亲和层析有如下特点：(Characteristics of Affinity Chromatography),1:纯化过程简单、迅速.2:分离效率高。3:产物纯度高。4:必须针对某一分离对象制备专一的配基及寻求稳定的层析条件。因此应用范围受到一定的限制。,三：亲和层析的基本原理(Mechanism of Affinity Chromatography)1：亲和的一对分子中的一方以共价键形式与不溶性

3、载体相连作为固定相吸附剂。2：当含有混合组份的样品（流动相）通过此固定相时，只有和固定相分子有特异亲和力的物质，才能被固定相吸附结合，其它没有亲和力的无关组份就随流动相流出。3：然后改变流动相成份，将结合的亲和物洗脱下来。（见Fig1、Fig2)。,(Fig1.Mechanism of AC),(Fig2.Mechanism of AC),具有特异性亲和作用的生物分子 四：配基的种类:(sorts of ligand)1：抗原与抗体。2：DNA与互补DNA或RNA（cDNA、mRNA)。3：酶与其底物。4：激素与其受体。5：维生素与结合蛋白。6：糖蛋白与植物凝集素。,五：亲和层析载体的性质与选

4、择亲和层析载体的选择(selection of vectors)1：多孔的立体网状结构，能使被亲和吸附的 大分子自由通过。2：颗粒均匀，具有良好的流速。3：具有惰性，尽量减少非专一性吸附。4：在温和的条件下 能与配基共价偶联。,亲和层析载体的性质与选择 六：常用的亲和层析载体：(Vectors of Affinity Chromatography)1：纤维素(cellulose)2：葡聚糖凝胶(Sephadex)3：琼脂糖凝胶(Sepharose)4：聚丙烯酰胺凝胶(Bio-gel P)5：多孔玻璃珠(Bio-Glass)6：其它新型载体(Other gels),七：亲和层析配基的选择(Sel

5、ection of ligand)1.纯化对象和配基之间必须有较强的亲和力.2.但亲和力太高也是有害的，因为在解离配 基复合物时所 需的条件就要强烈，这样可 能使生物分子变性。3.配基必须具有适当的化学基团，可用于和 载体相连，同时又不影响配基与生物分子 之间的亲和力。,亲和层析配基的性质与选择,配基的偶联:1：酸酐法 2：羟基琥珀酰亚胺法 3：叠氮化作用 4：还原性烷基化合物（西夫碱）的形成,第二节:载体、配基、目的物的连接：(Conjunction of vector、ligand and target material),载体（Vectors or Matrix)+配基（Ligand)+

6、目的物（target material）见(Fig3,Fig4,Fig5),Fig 3.AC relies upon a reversible highly specific binding reaction.,Fig4.Spacer arm principle,A spacer is sometimes used to ensure full accessibility of the affinity ligand.,Fig5.Principle of preparing AC media,第三节：亲和层析的基本操作方法：,1.平衡（Equilibration）用平衡Buffer 冲洗柱体，至基线平稳.,2.样品上柱和冲洗：（Sample application and wash）样品中的目的物与层析介质选择性的吸附，杂质不被吸附。用上样Buffer冲洗柱体，杂质被冲洗下来。形成杂质峰（见下图）。,3.洗脱（Elution）选择适当的条件，将吸附在亲和介质上的目的物解吸下来（见下图）。,