生物分离工程技术第四张细胞破碎技术.ppt

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1、生物分离（工程）技术,主讲：吴元喜E-mail:联系电话：2010年8月,生物工业下游技术一般工艺过程,第四讲 细胞破碎 技术,一、概 述 二、常用的细胞破碎技术及其应用三、细胞破碎技术研究的发展方向 四、思考题,一、概 述,（一）细胞破碎的意义（二）细胞壁的成分与结构（三）细胞破碎过程的检测,（一）细胞破碎的意义,目的：细胞破碎技术是分离纯化细胞内合成的非分泌型成分的基础。有效的细胞破碎对分离和纯化任何细胞内活性药物成分都是必要的。细胞破碎与上游和下游工艺设计的关系 上游通过细胞的生理状态对细胞破碎效果产生影响；而下游则要考虑去除细胞碎片和细胞蛋白质的污染等对产品活性的影响。细胞破碎过程中必

2、须考虑的因素 细胞壁的坚韧程度、目标产品的性质、破碎的规模、方法、费用等.,（二）细胞壁的成分与结构,细菌细胞壁 主要成分是肽聚糖，由N-乙酰葡萄糖胺、N-乙酰胞壁酸和短肽聚合而成的多层网状结构。霉菌的细胞壁 大多由几丁质和葡聚糖构成，含有少量蛋白质和脂类。酵母和真菌的细胞壁 主要为葡聚糖为-1，6葡聚糖，通过-1，3糖苷键与D-葡萄糖第一侧链交联，也含有甘露糖和几丁质植物细胞壁：含纤维素、半纤维素、木质素等,原核细胞的结构,电镜下：（1）革兰阳性菌细胞壁较厚，具有2080 nm的肽聚糖层，约占细胞壁干重的50。（2）革兰阴性菌的肽聚糖层较薄，仅23 nm，占细胞壁干重的10左右。,（3）在肽

3、聚糖层外还有一较厚的外壁层，约810 nm，主要为脂蛋白、脂多糖和其他脂类，含量为细胞壁干重的80。,酵母细胞的结构,植物细胞的结构,（三）细胞破碎过程的检测,革兰氏染色法次甲基蓝染色法测定核酸与蛋白质含量离心细胞破碎液观察,革兰氏染色法,用革兰氏染色剂进行染色破壁的酵母呈粉红色，而未破壁的酵母呈兰紫色，分别计数，并采用相同的稀释度用血球记数板进行镜检记数，计算破壁率。,-破壁率（100%）C-破壁前的细胞数（相同稀释倍数）C-破壁后的细胞数（相同稀释倍数）n1-染色后呈紫色细胞数n2-染色后呈粉红色细胞数,次甲基蓝染色法,取未经灭活的发酵液 0.5,用 9/的生理盐水稀释 1 0 0倍后,用

4、次甲基蓝染色5,用血球计数板计数,计算出细胞的存活率。酵母存活率：=1-(染色细胞总数/酵母细胞总数)100%.,测定核酸与蛋白质含量,分别在 2 60和 2 80波长下,测定发酵液的光吸收值，用Lorry法测量细胞破碎后上清中的蛋白质含量也可以评估细胞的破碎程度，判断细胞破碎率。核酸提高率：=(处理后发酵液的吸光值/未处理发酵液的吸光值)-1100%,用离心细胞破碎液观察,用离心细胞破碎液观察沉淀模型的方法来确定细胞破碎率，完整的细胞要比细胞碎片先沉淀下来，并显示不同的颜色和纹理。对比两项，可以算出细胞破碎率。,二、常用的细胞破碎技术及其应用,细胞破碎方式,高压匀浆 高速珠磨 纳米磨破碎撞击

5、破碎,渗透压冲击超声破碎冻融法低温玻璃化,酶溶法-溶菌酶、纤维素酶等,机械法,化学法-化学渗透-超临界细胞破碎技术,物理法,(八)化学渗透法,化学渗透法是使用某些有机溶剂(如苯、甲苯)、螯合剂(EDTA)、表面活性剂(SDS、triton X-100)、变性剂(盐酸胍、脲)等改变细胞壁或膜的通透性，从而使内含物有选择地渗透出来。化学渗透取决于化学试剂的类型以及细胞壁和膜的结构与组成，不同试剂对各种微生物细胞作用的部位和方式有所差异。化学渗透法有利也有弊,EDTA,EDTA作为螯合剂，可用于处理革兰氏阴性菌(如Ecoli)，对细胞的外层膜有破坏作用。革兰氏阴性菌的外层膜结构通常是靠二价阳离子Ca

6、2+或Mg2+结合脂多糖和蛋白质来维持的，一旦EDTA将Ca2+或Mg2+螯合，大量脂多糖分子将脱落，使外层膜出现洞穴。这些区域由内层膜的磷脂来填补，导致该区域通透性增强。,Triton X-100,Triton X-100是非离子型清洁剂，对疏水性物质具有很强的亲和力，能结合并溶解磷脂，因此其作用部位主要是内膜的双磷脂层。tritonX100常与其它试剂混合使用。,盐酸胍和脲,盐酸胍和脲是常用的变性剂。一般认为胍能与水中氢键作用，削弱了溶质分子间的疏水作用，从而使疏水性化合物溶于水溶液，如胍能从大肠杆菌膜碎片中溶解蛋白。盐酸胍不仅能改变细胞的通透性，而且能溶解不溶性重组蛋白(如包含体)，并在

7、其它试剂的配合下使其二硫键断裂，变性解离成单体，从而释放出来。除去变性剂和杂蛋白后，在一定条件下恢复肽链内或肽链间的二硫键，再折迭复性成具有活性的蛋白质立体结构。,化学渗透法的优缺点,优点：对产物释出具有一定的选择性。例如用0.2molL胍处理E.coli C600-1，5h后80位于胞间质的-内酰胺酶释放出来，而总的蛋白释放率仅为4。细胞外形完整；碎片少，有利于后分离。核酸释出少，浆液黏度低，便于进一步提取。缺点：时间长，效率低。化学试剂具有毒性。通用性差。,（一）高压匀浆破碎法,1、高压匀浆阀及其破碎机理 2、温控与能耗3、存在的问题,1、高压匀浆阀及其破碎机理,从高压室(几十兆帕)压出的

8、细胞悬浮液经过阀座D的中心孔道，从D和阀C之间的小环隙中喷出，速度可达每秒几百米。这种高速喷出的浆液又射到静止的撞击环E上，被迫改变方向从出口管流出。细胞在这一系列过程中经历了高速造成的剪切、碰撞以及由高压到常压的变化，从而造成细胞的破碎。,高压匀浆破碎的动力学表达式,S细胞破碎率；k破碎速率常数；p压力；N循环次数；S，k，a，b，p 等随细胞种类和培养条件变化,实验室级高压均质仪,高压细胞破碎机,2、温控与能耗,将温度控制在35以下，那么酶活损失可以忽略。对于温度敏感性物质，需低温操作。机械破碎的能耗主要包括提供动力(如压力)消耗的能量以及低温操作耗费的能量。如，提高压力需增加能耗(3.5

9、kW100MPa)，同时产生热量(23.8100MPa)。,3、存在的问题,高压匀浆破碎技术适合细菌和部分酵母菌细胞的破碎处理，而不适用于丝状微生物细胞的破碎，这是由于丝状微生物会对破碎器产生堵塞作用。细胞破碎时浓度应在60-80(湿重体积)，高于这个浓度时破碎效果有所降低。,（二）高速珠磨法,高速珠磨的破碎机理 温控、能耗 及存在的问题高压匀浆法与高速珠磨法的优劣,1、高速珠磨的破碎机理,如：株磨式组织研磨器小型株磨器,微生物细胞悬浮液与极细的研磨剂(通常是直径1 mm的无铅玻璃珠)在搅拌桨作用下充分混合，珠子之间以及珠子和细胞之间的互相剪切、碰撞促进细胞壁破裂，释出内含物。在珠液分离器的协

10、助下，珠子被滞留在破碎室内，浆液流出，从而实现连续操作。破碎中产生的热量由夹套中的冷却液带走,细胞破碎动力学表达式,S细胞破碎率；k破碎速率常数；t细胞破碎时间，t=V/R，V为细胞悬浮液体积m3，R为悬浮液流量m3/s。,珠磨式组织研磨器,利用微细玻璃珠，在高速运转下的相互碰撞，造成组织细胞的破裂与分散。适合珍贵样品液的研磨，例如蛋白质、酶及细胞液等。微细玻璃珠可回收使用。样品处理量，含玻璃珠可达350ml。样品量可达80克,小型珠磨器,特点：密闭容器可容纳1至1.5ml的组织液或是一些细胞悬浊液，通过1至3分钟的剧烈搅拌，能使细胞彻底的破裂，甚至一些骨头、微生物的孢子通过玻璃珠的研磨也能有

11、效的磨碎。,玻璃珠适用性：细菌用0.1mm的玻璃珠，酵母、藻类和组织培养细胞用0.5mm的玻璃珠，动植物的组织用1mm的玻璃珠,2、温控与能耗,采用夹套冷却的方式实现温度控制提高破碎率，需要增加装珠量、提高转速和延长破碎,3、高压匀浆法与高速珠磨法的优劣,高压匀浆法操作参数少，易于确定，而且样品损失量少，最少可处理20ml悬浮液；珠磨机操作参数多，一般凭经验估计，并且珠子之间的液体损失使一次处理85ml悬浮液最终只能得到50ml左右的浆液。连续操作时，珠磨机兼具破碎和冷却双重功能，减少了产物失活的可能性，而高压匀浆器需配备换热器进行级间冷却；其次珠磨法破碎效率高，,（三）超声波细胞粉碎机,1、

12、基本原理2、影响因素 3、实验室连续破碎池结构示意图,超声波细胞粉碎机基本原理,超声波破碎机由超声波发生器和换能器组成。超声波发生器将50Hz220V市电变成20KHz电能供给换能器。换能器随之作纵向机械振动。振动波通过浸入在生物溶液中的钛合金变幅杆产生空化效应，激发介质里的生物微粒剧烈振动，引起的冲击波和剪切力使细胞破碎。,空化现象：是在强超声波作用下，气泡形成、长大和破碎的现象。,影响超声波破碎的因素,超声波的声强、频率、温度控制能力和破碎时间。细胞悬浮液的离子强度、pH和细胞种类等对破碎效果也产生影响。发射针的快速振动会产生大量的热，在使用中必须每间隔几分钟关掉发生器以消散热量。超声波破

13、碎时细胞浓度一般在20左右，高浓度和高黏度都会降低破碎速度。超声波产生的化学自由基团能使某些敏感性活性物质变性失活，噪声令人难以忍受，而且大容量装置的声能传递、散热均有困难。,实验室连续破碎池结构示意图,（四）胶体磨-纳米破碎机,胶体磨的原理胶体磨基本参数,胶体磨原理,胶体磨的基本工作原理是剪切,研磨及高速搅拌作用。磨碎依靠两个齿形面的相对运动,其中一个高速旋转另一个静止,使通过齿面之间的物料受到极大的剪切力及磨擦力,同时又在高频震动,调整旋涡等腰三角形复杂力的作用下使物料有效的分散、浮化、粉碎、均质。,胶体磨基本参数,（五）撞击破碎法,细胞悬浮液以喷雾状高速冻结(冻结速度为数千min)，形成

14、粒径小于50m的微粒子。高速载气(如氮气，流速约300ms)将冻结的微粒子送入破碎室，高速撞击撞击板，使冻结的细胞发生破碎。,撞击破碎的特点,细胞破碎仅发生在与撞击板撞击的一瞬间，细胞破碎程度均匀，可避免细胞反复受力发生过度破碎的现象。另外，细胞破碎程度可通过无级调节载气压力(流速)控制，避免细胞内部结构的破坏，适用于细胞器(如线粒体、叶绿体等)的回收。撞击破碎适用于大多数微生物细胞和植物细胞的破碎，通常处理细胞悬浮液浓度为1020。实验室规模的撞击破碎器间歇处理能力约50-500ml，而工业规模的连续处理能力在10Lh以上。,（六）渗透压冲击破碎法,渗透压冲击破碎法是将细胞放在高渗透压溶液中

15、(如25的蔗糖或甘油溶液)，由于渗透压的作用，细胞内水分向外渗出，细胞收缩，此时快速将细胞转移至低渗缓冲液中(如水溶液)，由于渗透压的突然变化，胞外的水分迅速渗入胞内，使细胞快速膨胀而破裂的细胞破碎技术。细菌、真菌类和植物细胞的细胞壁强度较高，渗透压冲击破碎法很少用于此类细胞的破碎,（七）低温玻璃化破碎技术,低温玻璃化破碎技术是在低温玻璃化保存过程中发生的低温断裂基础上提出来的新技术。其理论和实验依据是生物组织超快速冻结发生低温断裂现象,进而对组织细胞产生不可逆损害,使细胞组织破裂,胞物质成份游离释放。该方法在低温水平下从超微结构上进行破碎,避免了通常提取法中使用高温高压、强酸强碱处理对营养组

16、分活性的破坏,故具有低温稳定性好,产品质量高等优点,三、细胞破碎技术研究的发展方向,（一）多种破碎方法相结合（二）与上游过程相结合（三）与下游过程相结合,（一）多种破碎方法相结合,化学法与酶法取决于细胞膜壁的化学组成;机械法取决于细胞结构的机械强度，而化学组成又决定了结构的机械强度化学法或酶法与机械法相结合:例如，用细胞壁溶解酶预处理面包酵母，然后高压匀浆，95MPa压力下匀浆4次，总破碎率接近100，而单独采用高压匀浆法，同样条件下破碎率只有32。,与上游过程相结合,在发酵培养过程中，生长期、培养参数等对细胞破碎组成结构有直接影响。用基因工程的方法对菌种进行改造也是非常重要的。如:包含体的形成。克隆噬菌体溶解基因。耐高温产品的基因表达。,与下游过程相结合,细胞破碎与固-液分离紧密相关，对于可溶性产品来讲，碎片必须除净，否则将造成层析柱和超滤膜的堵塞，缩短设备的寿命。因此必须从后分离过程的整体角度来看待细胞破碎操作，机械破碎操作尤其如此。,四、思考题,1、细菌、霉菌、酵母的细胞壁组成结构有何特点？2、有那些方法可以检测细胞破碎的程度？怎样检测？3、常用的细胞破碎方法有那些？目前那些适合工业化应用？那些适合实验室使用？4、植物叶片、动物内脏、酵母菌、红血球细胞分别可用那些细胞破碎技术？,