长链非编码RNANORAD在肺癌中的表达及其对肺癌细胞增殖能力的影响.docx
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1、长链非编码RNANORAD在肺癌中的表达及其对肺癌细胞增殖能力的影响王靖L杨利杰,宋政,王瑞宇,张钱璐,李俊大理大学临床医学院,云南省大理市671000【摘要】目的研究长链非编码RNADNA损伤诱导的非编码RNA(NoRAD)在肺癌中的表达及其对肺癌细胞增殖的影响。方法RNA-Seq分析肺癌组织中LnCRNA及miRNA的表达改变,根据表达量确定候选LnCRNA;RT-qPCR检测分析肺癌组织及肺癌细胞中候选NORAD的表达;免疫荧光检测分析肺癌组织中细胞增殖核抗原Ki-67的表达;通过直线回归分析肺癌组织中NORAD与Ki-67的表达相关性。生物在线软件联合miRNA测序结果,并通过荧光素酶
2、检测分析NORAD与miR-26b-5pmiR-654-5p结合可能性。将A549细胞分成空白对照组(ContrO1)、si-NORAD组、miR-26b-5pmimics、miR-654-5pmimics、si-NORAD与miR-26b-5pmimics联合组、si-NORAD与miR-654-5pmimics联合组,利用脂质体法将si-NORAD组、miR-26b-5pmimics、miR-654-5pmimics分别或联合转染入A549细胞,24h后,利用EdU检测细胞增殖能力、ArmeXinV-FITC/PI双染检测细胞凋亡、蛋白印迹(WeStemblot)检测细胞凋亡相关蛋白(Ba
3、d、Bd-2、CIeaVedCaSPaSe-3)的表达。结果NoRAD在肺癌组织及肺癌细胞中的表达均显著升高(均P0.01),其表达量与Ki-67的表达呈正相关(r=0.646,PmiR-654-5p在肺癌组织及细胞中的表达均显著降低(均PV0.01),生物在线软件及荧光素酶检测验证,NORAD与miR-26b-5p、miR-654-5p存在结合位点;在肺癌组织中,miR-26b-5p(r=-0.403,P=O.000)、miR-654-5p(r=-0.423,P=0.000)的表达与Ki-67的表达均呈负相关;miR-26b-5p(=-0.435,PV0.05)与miR-654-5p(r=-
4、0.395,P0.05)的表达与NoRAD表达均呈负相关。与ComroI组比较,si-NORAD可显著抑制A549细胞的增殖(PV0.01)、促进其凋亡(PVO.01),Bad及CleaVedCaSPaSe-3的表达均显著升高(均PVO.01),Bd2的表达显著降低(PV0.05);与Si-NoRAD组比较,Si-NoRAD与miR-26b-5pmimics联合组、si-NORAD与miR-654-5pmimics联合组可进一步抑制细胞增殖(PV0.01),促进细胞凋亡(PVO.01),Bad及CIeaVedcaspase-3的表达均显著提高(均P0.05),Bcl-2的表达显著降低(PV0.
5、05)。结论肺癌中NORAD的表达显著上调,可能通过抑制miR-26b-5p.miR-654-5p的表达而促进肺癌细胞增殖,NORAD可能作为肺癌的诊断标志物。*基金项目:大理大学博士科研启动基金项目(NoiKYBS)通讯作者:王靖,E-mail:【关键词】肺癌;长链非编码RNA;细胞增殖;微小RNAExpressionoflongnon-codingRNANORADinlungcanceranditseffectonlungcancercellproliferation.WANGJing,YANGLi-jie,SONGZheng,WANGRui-yu,ZHANGYu-l,LlJun.Clin
6、icMedicalCollege,DaliUniversity,Dali671000,Yunnan,CHINA(AbstractObjectiveToinvestigatetheexpressionoflongnon-codingRNADNAdamageinducednon-codingRNA(NORAD)inlungcanceranditseffectontheproliferationoflungcancercells.MethodsTheexpressionchangesofLncRNAandmiRNAinlungcancertissueswereanalyzedbyRNA-seq,an
7、dcandidateLncRNAwereidentifiedaccordingtotheexpressionlevels.RT-qPCRwasusedtodetecttheexpressionofcandidateNORADinlungcancertissuesandlungcancercells.ImmunofluorescenceassaywasusedtodetecttheexpressionofKi-67inIungcancertissues.ThecorrelationbetweenNORADandKi-67expressioninlungcancertissueswasanalyz
8、edbylinearregression.TheresultsofmiRNAsequencingwerecombinedwithbiologicalonlinesoftware,andthepossibilityofNORADbindingtomiR-26b-5pandmiR-654-5pwasanalyzedbyIucifasedetection.A549cellsweredividedintoblankControlgroup(Control),si-NORADgroup,miR-26b-5pmimics,miR-654-5pmimics,si-NORADandmiR-26b-5pmimi
9、cscombinedgroup,si-NORADandmiR-654-5pinthecombinedmimicsgroup,thesi-NORADgroup,miR-26b-5pmimicsandmiR-654-5pmimicswererespectivelyorjointlytransfectedintoA549cellsbyliposomemethod.24hlater,CellproliferationwasdetectedbyEdU,apoptosiswasdetectedbyAnnexinV-FITC/PIdoublestaining,andapoptosisrelatedprote
10、ins(Bad,Bcl-2,Cleavedcaspase-3)expressionwasdetectedbyWesternblot.ResultsTheexpressionofNORADinlungcancertissuesandlungcancercellswassignificantlyincreased(allPVo.01),andtheexpressionlevelofNORADwaspositivelycorrelatedwiththeexpressionofKi-67(r=0.646,PVO.01).TheexpressionsofmiR-26b-5pandmiR-654-5pin
11、Iungcancertissuesandcellsweresignificantlydecreased(allP0.01).BiologicalonlinesoftwareandIuciferasedetectionverifiedthatNORADhadbindingsiteswithmiR-26b-5pandmiR-654-5p.Inlungcancertissues,theexpressionofmiR-26b-5p(r=-0.403,P0.01)andmiR-654-5pQ=-0.423,P0,01)wasnegativelycorrelatedwiththeexpressionofK
12、i-67.TheexpressionsofmiR-26b-5p(r=-0.435,PVo.05)andmiR-654-5p(r=-0.395,PVO.05)werenegativelycorrelatedwithNORAD.ComparedwiththeControlgroup,si-NORADsignificantlyinhibitedtheproliferationofA549cells(P0.01)andpromotedapoptosis(PVo.01),andsignificantlyincreasedtheexpressionofBadandCleavedcaspase-3(allP
13、0,01),andsignificantlydecreasedtheexpressionofBcl-2(P0.05).Comparedwithsi-NORAD,si-NORADcombinedwithmiR-26b-5pmimicsgroupandsi-NORADcombinedwithmi-654-5pmimicsgroupcouldfurtherinhibitcellproliferation(P0.01)andpromotecellapoptosis(P0.01).TheexpressionofBadandCleavedcaspase-3wassignificantlyincreased
14、(allPNCl-HI299、NCl-HI395、NCI-HI650)购自于赛百慷(上海)生物技术股份有限公司,HFLl(人胚肺成纤维细胞)购自于武汉灵思生物技术有限公司,由本实验室保存。AnnexinVFITC/PI细胞凋亡检测试剂盒、CCK-8试剂盒购自于北京索莱宝科技有限公司,免疫荧光检测试剂盒购自于武汉灵思生物有限公司,RT-qPCR检测试剂盒购自于美国Bio-Rad公司,LiPofeCtamine3000转染试剂盒购自于美国InVitrogen公司,Anti-Badantibody、Anti-Bcl-2antibodyAnti-CleavedCaspase-3antibodyAnti
15、-ki-67antibody购自于英国abeam公司;Anti-GAPDHantibody购自于武汉三鹰生物技术有限公司。hsa-miR-26b-5pmimicshsa-miR-654-5pmimics及NC(NegativeContrOl)购自于广州锐博生物,si-NORAD(5,-AAGCCACCUUUGTGAACAGUA-3。购自上海吉玛制药技术有限公司。RT-qPCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,引物序列如表1所示。表1RT-qPCR引物序列Table1PrimersofRT-qPCR基因名称上游序列(5,-3,)下游序列(5*-3)NORADCctggaaggtgagc
16、gaagtAgagggtggtgggcattthsa-miR-26b-5pTatctagacatctgctacctcAtgcggccgcgattcaacaagCTCCCGACAACtctacagctatattgccagcchsa-miR-654-5pTggtgggccgcagaacatgtACGAPDHAACGGATTTGGTCGTATTGGGAAGATGGTGATGGGATTU6CtcgcttcggcagcacaAacgcttcacgaatttgcgt10对肺癌患者肿瘤及配对的癌旁组织均为2019年1月-2021年12月在我院心胸外科住院,行肺手术后经病理检查明确诊断为肺癌患者。患者年龄44
17、76岁,平均年龄559.38l岁,其中男性4例、女性6例。肿瘤及其配对的癌旁样本置于液氮中保存。每位患者均己签署知情同意书,由我院伦理委员会审查和批准。HERAcell150il型CO2培养箱购自于美国Thermo公司;Lightcycler480型RT-qPCR仪购自于美国ROChe公司;NIKoNDS-U3正置荧光显微镜购自于日本尼康;MUltiSkanSky全波长酶标仪购自于美国Thermo公司;FACSCalibUr流式细胞仪购自于美国BD公司;PowerPaceBasic型电泳仪购自美国Bio-RAD公司。1.3 实验方法1.3.1 肺癌组织样本RNAseq分析取6个肺癌组织及配对的
18、癌旁组织样本经过RNA抽提、纯化、建库之后,基于InUminaHiSeq2500测序平台,对这些文库进行双末端(Paired-end,PE)测序,筛选差异表达基因(筛选标准:log2Fo!dChange1,P-valuehsa-miR-26b-5p表达TRlZol裂解法,提取肺癌组织及细胞总RNA,逆转录试剂盒逆转录成cDNA,RT-qPCR检测NORAD、hsa-miR-654-5p、hsa-miR-26b-5p的表达。数据以2.仃表示,(:=目的基因Ct值-内参基因Ct值,aac=实验组(Ct(目的基因)-(内参基因)-对照组(Ct(目的基因)-Ct(内参基因)。1.3.5 免疫荧光检测肺
19、癌组织中Ki-67表达肺癌及配对的癌旁组织样本经冰冻切片,室温晾干水分,4%多聚甲醛固定10min,待4%多聚甲醛完全干后置于PBS(PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次,每次5min。抗原修复后,5%BSA抗原阻断,滴加ki-67抗体(1:300),4C孵育过夜;PBS清洗3次,每次5min,滴加Cy3标记的二抗,37C孵育60min,PBS清洗3次,每次3min,滴加抗荧光淬灭封片剂。利用日本尼康正置荧光显微镜(NlKoNDS-U3)采集照片。利用Image-ProPIUS6.0分析软件计算每个样本中Ki-67的平均荧光值。1.3.6 细胞分组及转染取对数生长期的A549细胞,IX104
20、CelISmL的细胞量传于细胞培养6孔板,将A549细胞随机分成:空白对照组(COntro1)、si-NORAD组、miR-654-5pmimics组、miR-26b-5pmimics组、si-NORAD与miR-654-5pmimics联合组、si-NORAD与miR-26b-5pmimics联合组。si-NORADmiR-654-5pmimics、miR-26b-5pmimics按照Lipofectamine2000脂质体转染试剂盒说明书转染入A549细胞,24h后,收集细胞对应检测。1.3.7 EdU检测细胞增殖将37C预热的EdU工作液(20M)加入6孔板,37、5%Co2继续培养2h
21、后,去除培养基,PBS清洗细胞3次,加入4%多聚甲醛,室温固定15min,每孔用ImL细胞通透液(含0.3%TritonX-Ioo的PBS),室温孵育10-15min,PBS清洗细胞3次后,每孔加)入5LPK碘化丙咤)染色,荧光显微镜拍照。1.3.8 细胞凋亡检测收集细胞,按照试剂盒操作说明,预冷乙醇固定后,加入10LAnnexinV-FITC及碘化丙咤(Pl)染色液,轻轻混匀,室温避光孵育15min,随后置于冰浴中,上机检测,FlowJoDongIe分析软件进行分析。1.3.9 荧光素酶检测将包含NORAD与miR-26b-5pmiR-654-5p结合位点的野生型(Wt)及突变型(MUt)序
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