生化分离工程2萃取分离.ppt

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1、2005-3-21,1,2.萃取分离,基本概念2.1 有机溶剂萃取2.2 双水相萃取2.3 反胶团萃取2.4 超临界流体萃取,2005-3-21,2,基本概念,萃取 extraction 是利用液体或超临界流体为溶剂提取原料中目标产物的分离纯化操作。萃取剂 extractant 萃取分离中的流体。有机溶剂萃取 organic solvent extraction，简称溶剂萃取 solvent extraction液固萃取或浸取 leaching超临界流体萃取 supercritical fluid extraction双水相萃取 aqueous two-phase extraction反胶团萃

2、取 reversed micelle extraction液膜萃取,2005-3-21,3,基本概念,反萃取 back extraction 为进一步纯化目标产物，在溶剂萃取分离过程中，调节水相条件，将目标产物从有机相转入水相的萃取操作。物理萃取 溶质根据相似相溶的原理在两相间达到分配平衡而进行萃取的分离过程。化学萃取 利用脂溶性萃取剂与溶质之间发生化学反应生成脂溶性复合分子实现溶质向有机相分配的过程。萃取剂与溶质之间的化学反应包括离子交换和络合反应等。化学萃取中通常用煤油、己烷、四氯化碳和苯等有机溶剂溶解萃取剂，改善萃取相的物理性质，此时的有机溶剂称为稀释剂 diluent。,2005-3-

3、21,4,2.1 溶剂萃取,分配定律在溶剂萃取过程中，将供提取的溶液称为料液；从料液中待提取的物质称为溶质；用来萃取目的产物的溶剂称为萃取剂；溶质转移到萃取剂中与萃取剂形成的溶液称为萃取液；被萃取出溶质后的料液称萃余液。平衡时溶质在两相中的浓度之比为一常数K，即：K 萃取相浓度/萃余相浓度 c1c2(2-1)常温下K为常数，c的单位通常用mol/L或U/ml。式(2-1)应用条件：(1)稀溶液；(2)溶质对溶剂之互溶度没有影响；(3)必须是同一种分子类型，即不发生缔合或离解。,2005-3-21,5,弱酸或弱碱性溶质还要考虑弱电解质在水相中的电离平衡。如penicillin是一类弱酸，在水中会

4、有一部分离解成负离子(PCOO)，在萃取相乙酸丁酯等有机相中则仅以游离酸分子(PCOOH)的形态存在。两相中的游离酸分子的分配平衡用分配系数K0表征电离平衡用电离常数KP来表征。,图2-1 青霉素的分配平衡与电离平衡,2005-3-21,6,K0和KP是客观存在的，但一般测定得到的是PCOOHPCOO的总浓度c2，在这种情况下，c1c2K 这里的K称之为表观分配系数。而K和K0、KP的关系式可经理论推导如下：KK0H(KpH)(弱酸)(2-2)KK0Kp(Kp H)(弱碱)(2-3)由此可见，溶质在不互溶两相中的分配不仅与本身的性质(决定KP)、萃取溶剂(决定K0)有关，也与水相的pH有关。,

5、2005-3-21,7,分离因数若原来的料液中除溶质A以外，还含有溶质B，则由于A、B的分配系数不同，A和B就得到了一定程度的分离。如A的分配系数较B大，这样萃取剂对溶质A和B分离能力的大小可用分离因数来表征：(c1A/c1B)(c2A/c2B)(c1A/c2A)(c1B/c2B)KAKB(2-4)下标1、2分别代表萃取相和萃余相，A、B为溶质 如果A是产物，B为杂质，分离因数可写为：K产K杂 越大，A、B的分离效果越好，即产物与杂质越容易分离。,2005-3-21,8,水相条件的影响由于产物所在的水相中往往还存在与产物性质相近的杂质、未完全利用的底物、无机盐、其他营养成分等。必须考虑这些物质

6、对萃取过程的影响。(1)pH值根据式(2-2)、(2-3)可见，pH值直接影响表观分配系数。pH除影响K外，还可能对选择性有影响。如青霉素在pH 2萃取时，乙酸丁酯萃取液中青霉烯酸可达青霉素含量的12.5，而在pH 3的条件下萃取，则可降低至4。另外，pH值还应尽量选择在使产物稳定的范围内。,2005-3-21,9,(2)温度温度会影响生化物质的稳定性。影响分配系数K。(3)盐析无机盐类如硫酸铵、氯化钠等一般可降低产物在水中的溶解度而使其更易于转入有机溶剂相中，另一方面还能减小有机溶剂在水相中的溶解度。如提取维生素B12时，加入硫铵，可促使维生素B12自水相转移到有机相中；提取青霉素时加入Na

7、Cl，也有利于青霉素从水相转移到有机溶剂相中。,2005-3-21,10,(4)带溶剂为提高分配系数K，常添加带溶剂。带溶剂是指能和产物形成复合物，促使产物更易溶于有机溶剂相中，在一定条件下又要容易分解的物质。青霉素作为一种酸，可用脂肪碱作为带溶剂。青霉素能和正十二烷胺、四丁胺等形成复合物而溶于氯仿中。这样萃取收率能够提高，且可以在较有利的pH范围内操作。这种正负离子结合成对的萃取，也称为离子对萃取。柠檬酸在酸性条件下，可与磷氧键类萃取剂如磷酸三丁酯(TBP)形成中性络合物而进入有机相(C6H8O73TBP2H2O)，这种形成络合物的萃取称为反应萃取。,2005-3-21,11,萃取方式和理论

8、收得率工业上萃取操作通常包括三个步骤：混合分离溶剂回收 因而工业萃取的流程中须有混合器(如搅拌混合器)、分离器(如碟片式离心机)和溶剂回收装置(如蒸馏塔)。混合萃取和分离也可在同一台设备内完成。一般萃取过程很快，如果接触表面足够大，则在1560 s之内就可完成。萃取操作流程可分为单级萃取和多级萃取。,2005-3-21,12,单级萃取如图2-2所示。,图2-2 单级萃取流程图,2005-3-21,13,萃取操作理论收得率的计算须符合以下两个假定：萃取相和萃余相很快达到平衡 两相完全不互溶，在分离器中能完全分离。设K为分配系数，VF为料液体积，VS为萃取剂体积，E为萃取因子(extraction

9、 factor)即萃取平衡后，溶质在萃取相与萃余相中质量的比值，则：EKVSVFKm(2-5)式中 mVFVS料液体积萃取剂体积令未被萃取的体积分数为，则：1(E1)(2-6)而理论收得率为：1E(E1)(2-7),2005-3-21,14,多级萃取为提高收率常常采用多级萃取，多级萃取又有多级逆流萃取和多级错流萃取流程，如图2-3和图2-4所示。,图2-3 多级错流萃取流程,图2-4 多级逆流萃取流程,2005-3-21,15,由理论推导，经n级萃取后，两种多级萃取流程的产物收率分别为：多级错流萃取流程：111(E11)(E21)(En1)(2-8)多级逆流萃取流程：1(En1E)(En11)

10、(2-9),图2-5 三级逆流萃取设备流程,2005-3-21,16,例1：赤霉素在10、pH值2.5时的分配系数(乙酸乙酯水)为35，用等体积乙酸乙酯单级萃取一次问理论收得率为多少？解1：E351135 理论收得率 1 35(351)97.2例2：赤霉素二级错流萃取时，第一级用1/2体积乙酸乙酯，第二级用1/10体积乙酸乙酯，问理论收得率为多少？解2：E135217.5 E235103.5 理论收得率 1 11(17.51)(351)98.79,2005-3-21,17,多级错流萃取由于溶剂分别加入各级萃取器，故萃取推动力较大，萃取效果较好。缺点是需加入大量的溶剂，因而产品浓度稀，需消耗较多

11、的能量回收溶剂。例3：赤霉素进行二级逆流萃取，乙酸乙酯用量为1/2体积，问理论收得率为多少？解3：E35217.5 n2 理论收得率 1 17.5317.517.531 99.7由上可见三种萃取过程中，以逆流萃取收率最高，溶剂用量最少。因而也是工业上普遍采用的流程。,2005-3-21,18,5.2 双水相萃取,过滤和离心依赖于被分离颗粒的尺寸或密度的差异，当希望收集微生物的细胞器、分离去除细胞碎片、提取和浓缩胞内物质时，普通的过滤和离心技术就显得力不从心了。溶剂萃取法难于应用于蛋白质分离。值得注意的是溶液的分相不一定完全依赖于有机溶剂，在一定条件下，水相也可以形成两相甚至多相。于是有可能将水

12、溶性的酶、蛋白质等生物活性物质从一个水相转移到另一水相中，从而完成分离任务。,2005-3-21,19,1896年Beijerinck观察到当把明胶与琼脂或把明胶和可溶性淀粉的水溶液混合时，先得到一混浊不透明的溶液，随后分成两相，上相含有大部分明胶，下相含有大部分琼脂(或可溶性淀粉)。再如图2-6中，2.2的葡聚糖水溶液与等体积的0.72甲基纤维素钠的水溶液相混合并静置后，可得到两个粘稠的液层。,图2-6 葡聚糖与甲基纤维素钠的双水相体系,2005-3-21,20,上述现象称为聚合物的不相溶性(incompatibility)。如果多种不相溶的聚合物混在一起，就可得到多相体系，如硫酸葡聚糖、葡

13、聚糖、羟丙基葡聚糖和聚乙二醇相混时，可形成四相体系。聚合物的不相溶性主要是由于聚合物分子的空间阻碍作用，相互间无法渗透，当聚合物的浓度达到一定值时，就不能形成单一的水相，所以具有强烈的相分离倾向。某些聚合物的溶液与某些无机盐的溶液相混合时，只要浓度达到一定值，也会形成两相，即聚合物-盐双水相体系，成相机理尚不清楚，一种解释为“盐析”作用。,2005-3-21,21,某些亲水性高分子聚合物的水溶液超过一定浓度后可形成两相，并且在两相中水分均占很大比例，即形成双水相系统(two aqueous phase system)。利用亲水性高分子聚合物的水溶液可形成双水相的性质，Albertsson于50

14、年代后期开发了双水相萃取法(two aqueous phase extraction)，又称双水相分配法(two aqueous phase partitioning)。70年代以后，Kula，Hustedt和Johansson等发展了双水相萃取技术在生物分离过程中的应用，为蛋白质特别是胞内蛋白质的分离与纯化开辟了新的途径。现在的研究已涉及到酶、核酸、生长激素、病毒等各种物质的分离和提纯。,2005-3-21,22,2.2.1 双水相分离理论,双水相体系广泛应用的双水相体系是聚乙二醇(PEG)/葡聚糖(Dex)体系。聚合物与无机盐的混合溶液，例如，PEG/磷酸钾、PEG/磷酸铵、PEG/硫酸钠

15、等常用于生物产物的双水相萃取。分离某一生物大分子，两相系统的选择原则，必须有利于目的物的萃取和分离，同时又要兼顾到聚合物的物理性质。如甲基纤维素和聚乙烯醇，因其粘度太高而限制了它们的应用。PEG和Dex因其无毒性和良好的可调性而得到广泛应用。,2005-3-21,23,相图 双水相的形成条件和定量关系常用相图表示，图2-7是PEGDex体系的相图。TCB称为双节线(binodal)，双节线以上的区域为 两相区。上相组成用 T(Top)表示，下相组 成用B(Bottom)表示。连接T、B两点的线段 TB称为系线(tie line)，系线上各点处系统的 总浓度不同，但均分 成组成相同而体积不 同的

16、两相。两相的体积近似服从杠杆规则。,图2-7 PEGDex体系相图,2005-3-21,24,如点M为整个系统的组成，该系统实际上由T、B所代表的两相组成，vT表示上相体积，vB表示下相体积，则：vTvBBMMT(2-10)系线的长度是衡量两相间相对差别的尺度，系线越长，两相间的性质差别越大。当点M向下移动时，系线长度缩短，两相差别减小，到达C点时，系线长度为0，两相间差别消失而成为一相，因此C点为系统临界点(critical point)。双节线的位置和形状与聚合物的相对分子质量有关。聚合物Dex的相对分子质量越高，相分离所需的浓度越低；两种聚合物相对分子质量相差越大，双节线的形状越不对称，

17、见图2-8。,2005-3-21,25,PEG的相对分子质量固定(PEG6000)而Dex的相对分子质量如下：1.D5(Mn2800，Mr3400)2.D17(Mn23000，Mr30000)3.D24(Mn23000)4.D37(Mn88000，Mr179000)5.D43(Mn180000，Mr460000)6.D170(Mn630000，Mr2200000)Mn数均分子量 Mr重均分子量,图2-8 PEGDex体系的双节线和临界点,2005-3-21,26,物质在两相中的分配和溶剂萃取法一样，物质在两水相中的分配用分配系数K表示。K cTcB 式中 cT、cB分别代表上相、下相中溶质的浓

18、度。K与温度、压力以及溶质和溶剂的性质有关，与溶质的浓度无关。影响分配系数的主要因素，可用Gerson公式表示：lgKA(2-11)式中 A表面积；两相表面自由能之差电荷数；电位差；标准化学位和活度系数等组成的常数,2005-3-21,27,表面自由能可用来量度表面的相对憎水性，改变成相聚合物的种类。聚合物的平均分子量和相对分子质量分布，都能影响相的疏水性。一般地，大分子的表面积A都很大，的微小变化都会引起蛋白质大分子的分配系数产生很大变化；加入系统的盐，以及体系的pH会影响相间电位差和蛋白质所带的电荷数，因而也对分配系数产生大的影响。由于影响分配系数的因素很多，加上各因素间又互相影响，因此定

19、量地将蛋白质的一些分子性质与分配系数关联起来是困难的，最佳的双水相操作条件还得依靠实验来获得。,2005-3-21,28,2.2.2 影响分配平衡的参数,影响物质分配的因素主要有：聚合物及成相盐的种类及浓度聚合物的平均分子量体系的pH值及其他盐的种类及浓度菌体或细胞的种类及含量、体系温度等。,2005-3-21,29,聚合物及其分子量的影响 不同聚合物，水相系统显示不同的疏水性，水溶液中聚合物的疏水性依下列次序递增：葡萄糖硫酸盐甲基葡萄糖葡萄糖羟丙基葡聚糖甲基纤维素聚乙烯醇聚乙二醇聚丙三醇，这种疏水性的差别对目的产物与相的相互作用是重要的。同一聚合物的疏水性随分子量增加而增加，其大小的选择依赖

20、于萃取过程的目的方向，若想在上相获得较高的蛋白质收率，对于 PEG/盐系统，应降低PEG聚合物的平均分子量，相反，若想在下相获得较高的蛋白质收率则平均分子量应增加。,2005-3-21,30,双水相萃取糖化酶的结果(见表5-4)表明，PEG平均分子量增大，分配系数减少。当分子量为400时，K1，酶主要分布于上相，当分子量大于400时，K1，酶主要分布于下相。主要原因是随着PEG分子量的增大，其端基数目减小，因而疏水性增加，使糖化酶在上相的表面张力增大，而使0，从而转入下相，为了使酶分布于上相，应选用分子量为400的PEG。表2-1 PEG平均分子量对分配平衡的影响 系统 K 相体积 产率 PE

21、G400(31.36)(NH4)2SO4(14.05)6.28 4.75 96.8 PEG1000(21.77)(NH4)2SO4(12.76)0.26 3.0 43.5 PEG4000(12.67)(NH4)2SO4(12.14)0.30 4.1 59.8 PEG6000(15.76)(NH4)2SO4(12.34)0.03 1.2 2.1,2005-3-21,31,在PEG/Dex双水相系统中，PEG分子量的减少，会使蛋白质的K值明显增大，如图5-13。Dex水解程度的不同，对K值也有一定的影响。,普鲁兰酶(12PEG，1DexT 500，100mmolL Na3PO4，pH7.5)1,4

22、-葡聚糖磷酸酶(9.3PEG，7DexT 500，50mmolL Na3PO4，pH7.8)亮氨酰基-tRNA合成酶 9.2PEG，6.3DexT 500，73mmolL Na3PO4，pH7.8),图2-9 PEG平均分子量对分配率的影响,2005-3-21,32,系线长度对分配平衡的影响相图中系线长度由组成的总浓度决定，在临界点附近，系线长度趋向于零，上相和下相的组成相同，因此，分配系数应该是1，随着聚合物和成相盐浓度增大，系线长度增加，上相和下相相对组成的差别就增大，产物如酶在两相中的表面张力差别也增大，这将会极大地影响分配系数，使酶富集于上相。仍以PEG(NH4)2SO4系统双水相萃取

23、糖化酶为例，增加PEG400的浓度有利于酶在上相的分配，当PEG400浓度在2527时，分配系数高达47.3，浓度过高则不利于酶的分配；在PEG400浓度固定为26时，增加(NH4)2SO4的浓度，糖化酶的分配系数也增大，这主要是由于(NH4)2SO4盐析作用影响增强的缘故，最适浓度为16，过高也不好，酶蛋白会因盐析作用过强而产生沉淀。,2005-3-21,33,体系中无机盐离子的影响在PEG/Dex中，无机盐离子在两相中也有不同的分配(见表2-2)，因此在两相间形成电位差。由于各相要保持电中性，这对带电生物大分子，如蛋白质和核酸等的分配，产生很大的影响。表2-2 一些无机离子的分配系数正离子

24、 分配系数K 负离子 分配系数KK 0.824 I 1.42 Na 0.889 Br 1.21 NH4 0.92 Cl 1.12 Li 0.996 F 0.912,2005-3-21,34,在体系中加入适当的盐类，会大大促进带相反电荷的两种蛋白质的分离。当pH 6.9时，溶菌酶带正 电，卵蛋白带负电。在PEG/Dex体系中加入 NaCl，产生电位差，上 相电位小于下相电位，导致带正电荷的溶菌酶 大量迁移到上相，其K 值增大，而带负电荷的 卵蛋白迁移到下相，从 而使溶菌酶和卵蛋白得 以较好地分离。,图2-10 加入NaCl对卵蛋白和溶菌酶分配的影响,相系统：8Dex 500；8PEG 4000，

25、0.5mmolL Na3PO4；pH6.9,2005-3-21,35,体系pH的影响pH会影响蛋白质中可离解基团的离解度，因而改变蛋白质所带电荷和分配系数；另外，pH还影响系统缓冲物质磷酸盐的离解程度，从而影响分配系数。pH微小的变化有时会使蛋白质的K改变23个数量级。对一种特定的蛋白质，在不同盐系统中，pH和其分配系数之间的关系应不同，而在等电点时，得到的均为不带电时分子的分配系数。对不同的盐系统，其等电点时的分配系数应相等，两条pH和分配系数关系的曲线必交于一点，该点所对应的pH值即为该特定蛋白质的等电点。根据这一原则测定蛋白质等电点的方法，称为交错分配法(Cross partitioni

26、ng)，如图2-11所示。,2005-3-21,36,图2-11 血清蛋白在两种盐系统中分配系数 K 与 pH 的关系(交错分配),2005-3-21,37,体系温度的影响温度影响相图，同时影响分配率和蛋白质的生物活性。一般地，临界点附近，温度对分配率的影响较大，远离临界点时，影响较小。在考虑温度对分配率的影响时，必须考虑到过程的冷量消耗和分离过程中蛋白质的停留时间。由于亲水聚合物的多元醇或多糖结构保护了蛋白质，蛋白质在双水相中的稳定性增加，所以一般都可在室温下操作。从省掉冷却系统的室温操作过程中各相前后温度的变化可知，分离后上、下相的温度上升不多，说明无冷却系统的室温操作是可行的。,2005

27、-3-21,38,2.2.3 双水相萃取技术的应用,双水相萃取技术目前较多地应用于胞内酶的提取和精制上。用双水相萃取技术处理细胞匀浆液，既可方便地除去细胞碎片，还可使酶得到精制。要成功地运用双水相萃取方法，应满足下列条件欲提取的酶和细胞碎片应分配在不同的相中；酶的分配系数应足够大，使在一定的相体积比时一次萃取，就能得到较高的收率；两相用离心机很容易分离。,2005-3-21,39,在双水相体系中，通常将目的蛋白质分配在上相(PEG)，而细胞碎片分配在下相(盐)。表5-6中蛋白质在多数情况下收率能达到90；分配系数K在220之间，一般能大于3；很多杂蛋白也能同时除去。PEG盐系统应用得很广泛，主

28、要由于PEG价格低廉以及该系统选择性。萃取操作时单位重量相系统中匀浆液的加入量一般每1 kg萃取相系统以处理200400 g湿菌体为宜。使用PEG盐系统提取胞内酶时，使细胞碎片分配到下相中是比较容易的，如用18%的PEG 1550、7磷酸钾系统处理20湿细胞碎片时，细胞碎片能全部转入下相(盐相)。,2005-3-21,40,图2-12 三步萃取流程示意图,2005-3-21,41,分配在上相中的蛋白质可通过加入适量的盐(有时也补充适量的PEG)，进行第二次双水相萃取，目的是除去核酸和多糖，它们的亲水性较强，因而易分配在盐相中，蛋白质就停留在上相PEG中在第三次萃取中，应使蛋白质分配在盐相(如调

29、节pH)，以便和主体PEG分离，色素因其憎水性而通常分配在上相；盐相中的蛋白质可用超滤法弃除残余的PEG，主体PEG可循环使用。双水相萃取法另一优点为易于放大，分配系数K值重复性好，故可直接放大。下面以甲酸脱氢酶(FDH)的分步提取和纯化来进一步说明双水相在胞内酶提取中的应用。,2005-3-21,42,图2-13 连续萃取流程示意图,2005-3-21,43,2.2.4 双水相萃取技术的进展,进一步提高目的蛋白的纯度 目的物还含有少量的核酸和多糖，进一步提高目的蛋白的纯度，可从双水相体系和萃取操作方式两方面进行改进。近年来发展起来的PEG衍生物。如在PEG上引入亲和基团或离子基团：(CH3)

30、3N-PEG-N(CH3)3，ConA-PEG-ConA等。目的蛋白的得率和纯度都有很大的提高。可采用多级萃取。,2005-3-21,44,廉价双水相体系的开发生物工程中得到应用的两种双水相体系，即高聚物高聚物和高聚物/盐体系。两种体系比较见表2-3。表2-3 两种双水相体系的比较 体系 优点 缺点PEG/dextran 盐浓度低，活性损失小 价格贵，粘度大，分相困难PEG/盐 成本低、粘度小 盐浓度高，活性损失大，界面吸附多 从表可见，高聚物/高聚物体系对活性物质变性作用小，界面吸附少，但价格高。因而寻找廉价的高聚物/高聚物双水相体系是双水相萃取技术应用的一个重要发展方向。,2005-3-2

31、1,45,目前比较成功的是用变性淀粉PPT（hydroxypropyl derivative of starch）代替昂贵的Dextran。PPT/PEG体系比PEG/盐体系稳定。和PEG/dextran体系相图非常相似：蛋白质溶解度大。蛋白质在PPT浓度到15以前没有沉淀，而在PEG浓度大于5时，溶解度显著地减小。粘度小。PPT的动力粘度只是粗Dextran的1/2，因而可以大大改善传质效果。价格便宜。,2005-3-21,46,双水相萃取技术同其他分离技术结合双水相体系同生物转化相结合将双水相萃取同生物转化结合在一起，可解决在许多生物转化中存在的两个问题：一是由于双水相体系对菌体及酶没有毒性，同时又可将产物萃入上相，所以可消除产物抑制效应；二是使分布在下相的细胞(酶)循环使用，从而为固定化细胞及酶的应用开辟了新路。双水相萃取同膜分离技术结合可解决双水相体系容易乳化和生物大分子在两相界面的吸附等问题并能加快萃取速率。,