流式细胞术发展和细胞组学新技术(贝克曼).ppt

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1、流式细胞术发展和细胞组学新技术,游东生美国贝克曼库尔特公司上海,Past 5 years,In Development,Source:Dr.Priya Kunapuli,Senior Research Scientist,Merck Research Laboratories;Dec.2002,Key takeaways:Rapid movement to cell-based assays for contextual analysis,以细胞为主要研究对象的课题数量变化,细胞水平研究的历史、现在和未来,暗视野光镜，相差显微镜，微分干涉对比显微镜，偏振光显微镜，荧光显微镜,单光子共聚焦显微镜

2、，多光子共聚焦显微镜,大体荧光成像系统,细胞计数仪,18世纪，明视野显微镜发明,流式细胞仪,分光高度计，荧光高度计，干涉光高度计,放射自显影,细胞成像定量分析系统,?,形态学研究工具的发展历程,Simple optical microscope,Basic clinical scope,Research grade fluorescence scope,High-end automated HCS systems,Confocal scanning system,细胞定量工具发展历程,Simple cell counters&sizers,Automated Cell viability,2-

3、4 color cytometer simple assays,5-6 color cytometer clinical/high-end res.,6 color plus cytometer/sorter high-end res.,Cell Lab Quanta,流式细胞仪新技术趋势,Multi-color AnalysisRed sensitive PMTsExcellent SensitivityNew optics layout for SharpnessMulti-platform sampling and humanity devicesAuto Setup with biol

4、ogical sampleOff-line compensation,LMD compensation and MoreFCS 3.0 format for Listmode filesSolvent protein detection development(beads based assay),Multi-Laser,multi-power options for different useLarge and Small particle sortingNew technologies for high yield,high purity and high viability sortin

5、g。,32 支试管自动上样盘（MCL)Walkaway 独立获取样本，减轻操作劳动MCL 自动模式.MCL 手工模式.单管上样模式.暂停/转动功能可以方便地往试管加入刺激剂或终止剂进行试验 每支试管检测前单独震动混匀，有利于均匀获取细胞,自动上样方式,FC500 MPL 24 孔0.5 2.5 ml 每孔容量96 标准孔和深孔反应板250 ul 最小容量40 支试管(12x75mm)1ml 最小体积可以固定体积上样检测175 ul 吸样量,可以减少高通量工作需要的烦杂的取样过程适合于零成本绝对计数将您的注意力从操作中解放出来，而集中于思路的创新,从模拟信号到先进的数字化信号,数字化信号转换对数

6、查表保证最优化的线性和稳定性4次幂转换误差 1%光纤通讯速度快保真性高实时获取数据和分析报告结果20比特的数据，补偿数字化全矩阵正反补偿 离线补偿,线性对对数查表 VS 普通对数放大,从相邻相邻相减到减法全矩阵到正反全矩阵数字化补偿方法,自动设置功能实时自动补偿每个通道电压自动调整2-5 色全自动补偿以细胞而不是微球进行自动荧光交叉和重叠的计算可以根据不同的应用而分别设置利用20比特的数据进行数字化补偿实时手工补偿全矩阵正反补偿 20比特未补偿的原始数据能提供LMD结果直接补偿获取后通过滑调调节迅速重新补偿20比特未补偿或补偿不好的原始数据可重新离线补偿在相同电压条件下进行自动设置生成相应的补

7、偿文件利用补偿文件进行LMD结果的重新播放可以进行单个文件和批处理文件的重新补偿,特别适用于三色以上补偿，准确方便适用于三色以下补偿和提供多色人工修正补偿的机会对于分群明显但补偿不好的文件可以在结果中直接补偿对于稀有标本或复杂实验，发现结果不好时不必进行实验的重新操作而可以用离线补偿进行抢救数据,离线补偿后得到的补偿文件应用于LMD文件进行重新补偿,离线补偿自动设置后得到的设置文件应用于新样本的获取,FC500离线补偿界面,从其它系统到Windows 系统多种方式的图形重叠点击将结果输出至WORD,PPT文件 点击将结果直接以EXCEL结果输出点击将结果直接以PDF格式输出,操作平台和结果输出

8、的变化,FCS 3.0文件包含20比特的原始数据，10比特获取时经过补偿的数据和获取时的方案可以直接以LMD结果文件来获取新的样本分析时不须预先打开方案，而可以直接打开LMD结果文件进行分析可以重新进行补偿,LISTMODE文件格式数据量的变化,细胞在进入流动室之前已经经过流体力学聚焦形成分散独立的颗粒,流动室两边电极产生电流，细胞通过时产生的电阻可以用来计数细胞和体积（大小）,引入全新的细胞参数，如精确细胞大小测定，增加不同的前向角收集角度,5种主要的激发波长提供了分析包括紫外光在内的灵活的分析方式,特殊光源（特别是UV和大功率激光）的应用,大功率紫外激光,5%,16%,25%,100%,体

9、积增加,直径增加,直径 vs.体积,本图所示说明了体积分析对细胞大小的分析的敏感性远远超过前向角散射光分析,ECV FS,前向角散射光分析 vs.体积分析,QUANTA,联合体积分析和荧光分析的优势,其它经典CYTOMETER,Normal Nuclei,Malignant Nuclei,NPE Analysis,NPE Analysis,NPE=5.8,NPE16.0,NPE=核质包装效率,Where do you separate viable/nonviable?,体积参数对死活细胞的良好分群,Quanta 是目前市场上分析精度最高的分析工具，能用的染料最多，并且能同时得到细胞大小的精确

10、信息,4.407565,528,530.902,7.74%,1,554,129.5,6.3,G2,11.78082,353,408.461,24.64%,4,947,108.8,5.9,S-Phase,5.901847,290,295.862,57.93%,11,633,82,5.4,G1,Color,CV1,Mode1,Mean1,Pct,Counts,MCV,Diameter,Region Name,DNA dyes used on the Quanta Include:DAPIPropidium IodideDraq5Hoechst 7-AAD,体积参数在分析细胞周期中的作用,经典的免疫

11、系统细胞分析,INNATE PMN NUETROPHILS EOSINOPHILS BASOPHILS MONOCYTES/MACROPHAGES DENDRITIC CELLS:mDC-pDC NK CELLS NKT CELLS gd T LYMPHOCYTES CD5+B CELLS,ADAPTIVE B CELLS HELPER T-CELLSTh1Th2 REGULATORY T-CELLS(Th3)CYTOTOXIC T-CELLS,两群树突状细胞MDC/PDC,先天免疫细胞分析NK细胞,多色分析离我们越来越近,越来越多的细胞缺乏特异性标记，需要越来越多的标记来限定。多色分析的优势

12、是21+1,32+1,31+1+1,ETC.节省试剂和工作量。如果做非常全面的免疫分型，三色需要20支试管，四色需要12支，而五色只需要6支。越来越多的生命活动研究需要多参数多角度分析，例如凋亡，AICD等。,抗原特异性T细胞分析,四聚体（tetramer)染色细胞因子分泌试验ELISPOTCytokine Secretion Assay,不同厂家的MHC四聚体产品不太一样：贝克曼库尔特公司创造性地构建和表达了MHC分子3链的区域突变的蛋白（iTAg），能降低其与非特异性T细胞结合，大大提高了特异性。并且将MHC四聚体直接标记荧光，和常用的抗原多肽负载后整体商品化，也有单独的MHC分子（iTA

13、g）单独出售，极大方便了研究者 利于此技术关键问题在四聚体制备，最大的问题不是没有阳性细胞，而是阳性率太高,四聚体染色技术,Beckman Coulter已经有的部分产品,传染性疾病相关：HIV gag SLYNTVATL HLA-A*0201HIV pol ILKEPVHGV HLA-A*0201CMV PP65 NLVPMVATV HLA-A*0201EBV GLCTLVAML HLA-A*0201EBV GLCTLVAML HLA-A*0201Influenza M1 GILGFVFTL HLA-A*0201HBV core FLPSDFFPSV HLA-A*0201肿瘤性疾病相关：Ma

14、rt1 ELAGIGILTV HLA-A*0201Gp 100 IMDQVPFSV HLA-A*0201Gp 100 ITDQVPFSV HLA-A*0201Her-2/neu KIFGSLAFL HLA-A*0201Her-2/neu RLLQETELV HLA-A*0201PR-1 VLQELNVTV HLA-A*0201Tyrosinase YMDGTMSQV HLA-A*0201,抗原决定簇分析的科学平台iTopia Epitope Discovery System,在目前主要以数据库为基础的理论性分析抗原决定簇的基础上，iTopia技术平台为研究者研究免疫的发生发展、疫苗的研制和免疫

15、学检测提供了一个科学合理的解决方案,分泌细胞因子的细胞的检测和分选,DC与TLR分子和T细胞的相互作用,DC Capture Ag Via TLR Induced Actin RemodelingTLR activate DC endocytosis-FITC-dextran incubationMature DC Priming Nave T Cells,贝克曼库尔特公司PLG试剂 能测定保存长达5天的陈旧血,世界首先专利特殊的克隆号和抗体保存秘方更多的此类抗体即将问世,贝克曼库尔特公司BBA试剂能同时检测10种细胞因子,*Human Th1/Th2 Cytokine I Kit,FL2(R

16、eporter Parameter),FL4(Differentiator Parameter),Cells,Beads,细胞表面标记和样本可溶性蛋白同时检测系统单种可溶性蛋白,Beads,Cells,细胞表面标记和样本可溶性蛋白同时检测系统多种种可溶性蛋白,干细胞中的研究应用-Hoechst 33342 side population,干细胞能表达ABCG2泵蛋白，在HOECHST 33342染色时能将该染料泵出，因此分析不能被该染料染色的细胞群时可以发现一群不能染色的细胞既是干细胞，因此能够在众多肿瘤细胞中区分出肿瘤干细胞。,QUANTA检测SP细胞群,EPICS Altra 测定SP细胞

17、群,流式细胞仪对细胞结构的分析,细胞酶活性检测,Th1细胞DPPIV 活性实时检测与验证,神经元细胞融合检测,利用DIL,DIO对神经元细胞进行染色观察和流式检测,流式细胞术在生物医学研究的新方向,细胞多态性分析：受体、抗原折叠、HLA等，包括CXCR4,CCR5,DC-SIGN(与AIDS易感性有关），NKR重要分子的进一步分析，如粘附分子（物种间高度保守，与细胞间通讯，干细胞HOMING，肿瘤的发生，细胞分化成熟等）信号传导（实际主要为胞浆内磷酸化及去磷酸化蛋白的检测）新型荧光特异性探针：胞内病原体检测、转录因子检测、细胞器或细胞生命活动指标的新荧光素的应用利用分选的细胞进行体内和体外功能研究与其它定位性的荧光设备联合使用（如MPE,CONFOCAL,IC200等）,谢 谢！,游东生贝克曼库尔特公司上海代表处,