核酸提取精美生物医学.ppt
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1、核酸提取操作与含量测定,找答案,核酸分离提取的原则是什么?要达到哪些要求?DNA和RNA提取总需要注意的要点有哪些?核酸如何定量测定,简单说说它们的依据呢?,核酸是遗传信息的载体,是最重要的生物信息分子,是分子生物学研究的主要对象,因此核酸的提取是分子生物学实验技术中最重要、最基本的操作。,前言,一、核酸的分离原则及要求,(一)分离核酸的一般原则,因为遗传信息全部贮存在核酸的一级结构中,故完整的一级结构是保证核酸结构与功能研究的基础。,保证核酸一级结构的完整性;排除其它分子的污染。,1、核酸的分离和纯化时应遵循两个原则:,2、核酸的纯度要求,核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度
2、的金属离子;其它生物大分子如蛋白质、多糖和脂类分子的污染应降低到最低程度;排除其它核酸分子的污染,如提取DNA分子时,应去除RNA,反之亦然。,(三)核酸分离纯化的注意事项,为保证分离核酸的完整性和纯度,在实验中应注意:,尽量简化操作步骤,缩短提取过程,以减少各种有害因素对核酸的破坏;减少化学物质对核酸的降解,为避免过酸、过碱对核酸链中磷酸二酯键的破坏,操作多在pH410条件下进行;,防止核酸的生物降解。细胞内或外来的各种核酸酶水解核酸链中的磷酸二酯键,直接破坏核酸的一级结构。其中DNA酶需要金属二价阳离子Mg2+,Ca2+的激活,因此使用金属离子螯合剂,如EDTA或柠檬酸盐等基本上可以抑制D
3、NA酶的活性而RNA酶不但分布广泛、极易污染样品,而且耐高温、耐酸碱、不易失活,所以生物降解是RNA提取过程中的主要危害因素;,减少物理因素对核酸的降解,物理降解因素主要是机械剪切力,其次是高温。,机械剪切力包括强力高速的溶液振荡、搅拌,细胞突然置于低渗液中;细胞爆炸式地破裂及DNA样品的反复冻融等。主要危害对象是大分子量的线性DNA分子,如真核细胞的染色体DNA等。,高温,如长时间煮沸,除水沸腾带来的剪切力外,高温本身对核酸分子中的某些化合键也有破坏作用。核酸提取过程中常规操作温度为04以降低核酸酶的活性从而减少对核酸的生物降解。,破碎细胞提取核蛋白去除蛋白质、多糖、脂类等生物大分子去除盐类
4、、有机溶剂等杂质纯化干燥,二、核酸分离纯化的一般步骤,DNA提取的几种方法,基因组DNA的提取,CTAB法SDS法其它,DNA提取的几种方法,非基因组DNA的提取,质粒DNA的提取,碱裂解法 煮沸法,线粒体、叶绿体DNA的提取,差速离心结合SDS裂解法,基因组DNA CTAB法,CTAB法原理(植物DNA提取经典方法),CTAB(十六烷基三甲基溴化铵),是一种阳离子去污剂,可溶解细胞膜,并与核酸形成复合物。该复合物在高盐溶液中(0.7mol/L NaCl)是可溶的,通过有机溶剂抽提,去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。,注:CTAB溶液在低于15 时会形成沉淀析出,因此
5、在将其加入冰冷的植物材料之前必须预热,且离心时温度不要低于15。,Tris-HCl(pH8.0)提供一个缓冲环境,防止核酸被破坏;EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子,抑制DNase活性;NaCl 提供一个高盐环境,使DNP充分溶解,存在于液相中;CTAB溶解细胞膜,并结合核酸,使核酸便于分离;-巯基乙醇是抗氧化剂,有效地防止酚氧化成醌,避免褐变,使酚容易去除,CTAB提取缓冲液的经典配方,CTAB提取缓冲液的改进配方,PVP(聚乙烯吡咯烷酮)是酚的络合物,能与多酚形成一种不溶的络合物质,有效去除多酚,减少DNA中酚的污染;同时它也能和多糖结合,有效去除多糖。,基因组DNA CTAB法,CTAB
6、法流程图,植物材料,裂解液,上层溶液,液氮研磨,抽提,细胞裂解,干燥溶解,离心洗涤,酒精沉淀,DNA溶液,基因组DNA CTAB法,SDS法原理,基因组DNASDS法,SDS是一种阴离子去垢剂,在高温(5565)条件下能裂解细胞,使染色体离析,蛋白变性,释放出核酸;提高盐(KAc或NH4Ac)浓度并降低温度(冰浴),使蛋白质及多糖杂质沉淀,离心后除去沉淀;上清液中的DNA用酚/氯仿抽提,反复抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。,SDS法DNA提取缓冲液,SDS法流程图(以动物组织为例),基因组DNASDS法,基因组DNA其它方法,物理方式:玻璃珠法、超声波法、研磨法、冻融法化学方式:异硫氰酸胍法、
7、碱裂解法生物方式:酶法,根据细胞裂解方式的不同有:,基因组DNA其它方法,吸附材料结合法:,根据核酸分离纯化方式的不同有:,硅质材料阴离子交换树脂磁珠,高盐低pH值结合核酸,低盐高pH值洗脱。快捷高效。,低盐高pH值结合核酸,高盐低pH值洗脱适用于纯度要求高的实验。,磁性微粒挂上不同基团可吸附不同的目的物,从而达到分离目的。,基因组DNA其它方法,浓盐法:有机溶剂抽提法:密度梯度离心法:,利用RNP和DNP在盐溶液中溶解度不同,将二者分离,有机溶剂作为蛋白变性剂,同时抑制核酸酶的降解作用,利用不同内容物密度不同的原理分离各种内容物,细胞器DNA差速离心法,差速离心法原理,是利用物质比重的不同分
8、离混合物的一种方法。将待分离物质置于均匀介质(蔗糖)中,以一定的转速进行离心,比重大的物质优先沉降,比重小的却处于上层,从而得以分离。,线粒体和叶绿体是生物体内半自主性细胞器,自身可编码蛋白,它们的比重和大小一定,因而在同一离心场内的沉降速度也一定 根据这一原理,常用不同转速的离心法,将细胞内各种组分分级分离出来。,DNA提取的基本步骤,I.材料准备II.破碎细胞或包膜内容物释放III.核酸分离、纯化IV.沉淀或吸附核酸,并去除杂质V.核酸溶解在适量缓冲液或水中,材料准备,最好使用新鲜材料,低温保存的样品材料不要反复冻融提取血液基因组DNA时,要选择有核细胞(白细胞)组培细胞培养时间不能过长,
9、否则会造成DNA降解含病毒的液体材料DNA含量较少,提取前先富集,基因组DNA的提取,质粒DNA的提取,使用处于对数期的新鲜菌体(老化菌体导致开环质粒增加)培养时应加入筛选压力,否则菌体易污染,质粒易丢失尽量选择高拷贝的质粒,如为低拷贝或大质粒,则应加大菌体用量菌株不要频繁转接(质粒丢失),细胞裂解,材料应适量,过多会影响裂解,导致DNA量少,纯度低针对不同材料,选择适当的裂解预处理方式:植物材料液氮研磨动物组织匀浆或液氮研磨组培细胞蛋白酶K细菌溶菌酶破壁酵母破壁酶或玻璃珠高温温浴时,定时轻柔振荡,基因组DNA的提取,质粒DNA的提取,菌体量适当培养基去除干净,同时保证菌体在悬浮液中充分悬浮变
10、性的时间不要过长(5分钟),否则质粒易被打断复性时间也不宜过长,否则会有基因组DNA的污染G菌、酵母质粒的提取,应先用酶法或机械法处理,以破壁,核酸分离、纯化,采用吸附材料吸附的方式分离DNA时,应提供相应的缓冲体系采用有机(酚/氯仿)抽提时应充分混匀,但动作要轻柔离心分离两相时,应保证一定的转速和时间针对不同材料的特点,在提取过程中辅以相应的去杂质的方法,基因组DNA的提取,质粒DNA的提取,核酸分离、纯化,蛋白质的去除:酚/氯仿抽提使用变性剂变性(SDS、异硫氰酸胍等)高盐洗涤蛋白酶处理,多糖的去除:高盐法:用乙醇沉淀时,在待沉淀溶液中加入1/2体积的5M NaCl,高盐可溶解多糖。用多糖
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