细胞工程制药PPT课件.ppt

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1、第三章 细胞工程制药,细胞工程药物第一节、动物细胞工程制药基本技术及实例第二节、植物细胞工程制药基本技术及实例,作业,一、名词解释：转化细胞系、微载体培养、毛状根、气升式反应器 二、分别列出1种动物细胞、1种植物细胞工程制药的实例,细胞工程制药,指以细胞为研究对象，通过细胞培养获得自然界难以获得的珍贵产品的新兴生物技术。,微生物、动物、植物细胞培养特性,动物细胞工程药物,适合真核表达的的药物蛋白或亚单位疫苗单克隆抗体药物筛选模型,培养方法,（一）原代培养 1、组织块培养法 2、细胞单层培养法（二）传代培养（三）单细胞克隆培养,动物细胞培养概述,动物细胞培养是指离散的动物活细胞在体外人工培养条件

2、下生长、增殖的过程。,培养细胞的分类,悬浮型血液、淋巴细胞、杂交瘤细胞贴壁型：A上皮细胞型B成纤维细胞型C游走细胞型D多形细胞形（1）动物细胞贴壁生长特性（2）动物细胞接触抑制特性兼性贴壁型：,动物培养细胞的优点,（1）细胞经培养后形成的细胞系和细胞株，特征均一。（2）理化环境可控制，培养物可直接被观测。（3）提供大量均一的细胞供制备用。（4）便于进行人工筛选。（5）结合显微电影技术，可观察细胞代谢活动和反应。应用：（1）生产有重要价值的蛋白质产品 分泌性的蛋白质产品（2）培养皮肤细胞用于移植 形成组织（3）检测有毒物质 致癌致畸引起染色体数目和结构改变（4）理论研究 培养正常或异常细胞用于生

3、理、病理、药理研究,（1）动物细胞贴壁生长特性,（2）动物细胞接触抑制特性,细胞从接种到长满底物表面后，由于细胞繁殖数量增多相互接触后，不再增加。,动物细胞培养所需仪器设备,实验室要求（A）和缓冲间相连，缓冲间内备消毒服装和鞋，口罩等，入内换上。（B）室内空气不流通，有适当的光线，清洁，干燥.万级。（C）侧部可设传递窗，用于物品传递。（D）有消毒用紫外线灯（1）培养器具（2）超净工作台（3）CO2培养箱（4）倒置显微镜（5）纯化水装置,（1）培养器具,培养瓶,培养板,培养皿,（2）超净工作台,超净工作台的工作原理是利用鼓风机驱动空气遁过高效滤器除去空气中的尘埃颗粒，使空气得到净化。100级超净

4、工作台指标：（0.5m3.5粒/L）,（3）CO2培养箱,CO2培养箱设定的条件为37，5CO2。二氧化碳的作用：细胞生长需要、维持pH值。,（4）倒置显微镜,（5）纯化水装置,培养细胞的生存环境,适宜的温度-人和哺乳动物培养细胞最适温度均为3537。气体环境和氢离子浓度-需要一定量的O2和CO2（95空气+5%CO2）；pH 7.2-7.4 营养物质-适当的培养基环境无毒和无菌：双抗、消毒渗透压：,平衡盐溶液（BSS）,功效：维持渗透压提供缓冲系统提供水分和无机盐,培养液要求,氨基酸-氮源盐类-钠离子，钾离子，镁离子，钙离子，氯离子，硫酸根离子，磷酸根离子，碳酸氢根离子等 葡萄糖：供能 缓冲

5、系统-CO2缓冲系统或HEPES（羟乙基哌嗪乙硫磺酸）生长因子-血小板源性生长因子（PDGF），表皮生长因子（EGF），成纤维细胞生长因子（FGF）以及血管内皮生长因子（VEGF）其它成分-维生素，矿物，有机补充物，激素等,动物细胞的培养基,动物细胞的培养基组成-氨基酸、葡萄糖、蛋白质、核酸类物质、维生素、辅酶、激素、生长因子、微量元素、缓冲系统。1、天然培养基2、合成培养基3、无血清培养基,天然培养基,天然培养基如-血清，血浆，组织浸出液等优点-营养成分丰富，培养效果好缺点-来源受限。成分复杂，影响对某些实验产物的提取和实验结果的分析。易发生支原体污染天然培养基的类型：A乳蛋白水解物培养基B

6、酪蛋白水解物培养基C血清及胚胎浸出液培养基,合成培养基,合成培养基-是根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成的。如TC199、MEM、RPMI-1640、DMEM等。优点-标准化生产，组分和含量相对固定，成本低。缺点-缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长需要。目前常用基本合成培养基血清来培养细胞合成培养基的类型：（A）Eagle培养基（内含13种氨基酸、9种维生素、多种无机盐）（B）Ham氏F10培养基（内含20种氨基酸、多种维生素、10种无机盐）（C）199培养基（D）Waymouth氏MB752/1培养基（E）NCTC109培养基,无血清培养基,无血清培养基-在基本合成培养

7、基中加入起血清作用的种类激素和生长因子，如铁转运蛋白、乙醇胺、胰岛素、硒、氢化可的松、维生素C、促胃激素等等。血清的成分：激素：胰岛素、胰高血糖素、生长激素、孕酮、氢化可的松、雌二醇等生长因子：表皮生长因子、神经生长因子、成纤维生长因子、血小板生长因子结合蛋白：白蛋白、转铁蛋白等贴壁和铺展因子物质：如纤维粘连素、多聚赖氨酸、胶原、血清铺展因子等。多种金属离子低分子量营养因子：维生素A、维生素C、脂肪酸等不明成分,动物组织块培养法,将动物组织切成直径为12mm的小块、并且进行培养的方法称为动物组织块培养法。有些动物组织如人的皮肤细胞，由于分散成细胞十分困难，因此常常采用组织块培养法。动物组织块固

8、着之后，加培养液，于37、CO2培养箱中、通入含5%CO2的空气进行培养，即可在组织块周围长出新的细胞单层。动物组织培养过程中，进行旋转或者振荡，培养效果更好。,动物细胞单层培养法,动物组织块经过胰蛋白酶消化分散成单细胞或者细胞团块之后，粘附于培养基中，培养成新生细胞单层的方法称为动物细胞单层培养法。动物细胞单层培养法包括二个过程：1、组织块分散成单细胞2、培养,有关概念,细胞株：原代细胞一般传至10代左右细胞生长停滞，大部分细胞衰老死亡，少数细胞存活到4050代，这种传代细胞为细胞株。细胞系：细胞株传代至50代后又出现细胞生长停滞状态，只有部分细胞由于遗传物质的改变，使其在培养条件下可以无限

9、制传代，这种传代细胞为细胞系。细胞株和细胞系的区别：细胞系的遗传物质改变，具有癌细胞的特点，失去接触抑制，容易传代培养。,动物组织,单个细胞,细胞悬液,贴壁生长,分瓶培养,10代细胞,50代细胞,不死细胞,原代培养,传代培养,胰蛋白酶,剪碎,加培养液,接触抑制,少数癌变,少数,动物细胞培养技术流程,为什么用胚胎组织或幼龄动物的组织细胞进行细胞培养,因为它们生命力旺盛，分裂能力强。（细胞分化程度低，增殖能力强，有丝分裂旺盛，容易培养）。,为什么要将组织分散成了单个细胞再进行培养？,分散成单个细胞、细胞群（团）后容易培养，细胞容易获得营养物质，其代谢废物容易排出；分散成单个细胞培养，容易完成细胞水

10、平的工程技术操作。,为何要定期用胰蛋白酶使细胞从瓶壁上脱离下来？,当贴壁细胞生长到表面相互接触时，细胞就会停止分裂增殖细胞出现接触抑制。,哪些细胞失去了接触抑制？,传代培养时，少数超过50代的细胞，由于遗传物质发生改变，可无限增殖，并失去了接触抑制肿瘤细胞。,1、组织块分散成单细胞,消化分散组织块的方法分为三种：（1）酶消化法（2）物理分散法（3）酶消化与物理分散结合法,2、培养,上述细胞悬液经过计数、稀释之后，接种于无菌培养器中，加入培养液于37条件下培养，细胞即粘于瓶底或者转瓶内壁，并且开始生长形成单层。接种浓度：上皮细胞1*1053*105个/毫升。成纤维细胞2*1056*105个/毫升

11、。成体细胞应高于胚胎细胞。培养时间：上皮细胞57天形成单层。成纤维细胞34天形成单层。培养条件：动物细胞的需氧量较低，一般通入含5%CO2的空气进行供氧，有利于维持培养基的PH值。培养方法（1）原代培养（2）传代培养,（1）原代培养,定义：从新鲜供体取得组织细胞后在体外进行首次培养，一般持续14周。原代细胞：直接将动物组织和器官经过粉碎、消化而制得的悬浮细胞步骤：取材-组织分离原代细胞-培养,（2）传代培养,定义：当原代培养的细胞相互汇合时，细胞由原培养瓶消化、收集、稀释后传到新的培养瓶的过程。注意：原代细胞类型不一，利用不同的消化时间和消化液。细胞系-原代培养物首次传代成功后即成细胞系。A有

12、限细胞系：传代细胞系 B连续细胞系：转化细胞系,传代细胞系：又称二倍体细胞系，原代细胞经过传代、筛选、克隆等步骤，从多种细胞中纯化得到的某种具有一定特征的细胞系。步骤：A贴壁细胞：去除培养基-胰蛋白酶消化-加入培养液，形成细胞悬液-稀释传代细胞系-培养B悬浮细胞：收集细胞悬液-离心搜集细胞-用培养液稀释-稀释传代细胞系-培养传代细胞：（1）具有二倍性染色体（2n），染色体核型正常。（2）具有明显的贴壁依赖、接触一致性（3）培养条件下一般可联系传代50代，不能进行无限期的分裂繁殖。（4）无致癌性。目前已获得了多种人胚胎肺二倍体细胞，来源于3-4个月的胚胎肺组织，如：W1-38；MRC-5；MRC

13、-9；IMR-90；2BS；KBM-13；LS-7,转化细胞系：正常细胞经过某个转化过程，失去正常细胞的特点而获得无限增殖能力的细胞系。特征：原代细胞相比，其形态、染色体结构、倍增时间、营养要求、生理生化特性、病毒敏感性、抗原性、上均发生了变化，并且具有致癌性。来源：自然转化；人为转化；肿瘤组织目前已经获得的确立细胞系有：ABHK-21细胞 地鼠幼鼠肾脏BHela细胞 人子宫癌细胞CVero细胞 非洲绿猴肾脏细胞DCHO细胞 中国仓鼠卵巢细胞ENamalwa细胞 肯尼亚淋巴瘤病人,转化细胞系,单细胞分离培养,单细胞分离培养也称为细胞克隆培养，是指将单个细胞培养成纯细胞系群的技术。由于动物细胞具

14、有集群效应，单个细胞在培养基中难以生长。因此在克隆株培养过程中，常常采用：（1）使用条件培养基进行培养。（2）在培养基中加入饲养细胞-如加入小鼠胸腺细胞和小鼠腹腔巨噬细胞。,单细胞微量板克隆技术,1、微量板克隆技术2、单细胞微量板克隆技术的特点和应用,1、微量板克隆技术,微量板是指孔径为6mm，容量为0.3ml的多孔培养板。常用的有96孔、55孔、24孔。细胞克隆时，将细胞稀释成10个/毫升以下的悬浮液，然后向每1微孔中加入0.1毫升，则每1孔中的细胞数平均为1个。接种后在含5%CO2的空气的培养箱中进行培养，每隔48天更换一次新的培养液0.2ml，直到形成单克隆细胞株。继代培养时，吸除培养液

15、，用不含Ca、Mg的平衡盐溶液冲洗，再用胰蛋白酶进行消化，然后用培养液洗涤，再转移到25cm2表面的培养瓶中，加3ml培养液进行培养，几天后就会长成成片的新克隆细胞。,2、单细胞微量板克隆技术的特点和应用,微量板细胞克隆过程中，由于每一个克隆肯定来源于同一个细胞，其培养的重复性和可靠性均十分良好。微量板细胞克隆技术可用于建立纯细胞株、检查细胞遗传性的一致性，还可用于分离细胞变种。微量板细胞克隆技术在评价药物、毒物对细胞生长的影响、筛选淋巴细胞杂交瘤工程、基因和细胞工程、制备单克隆抗体工程中具有重要作用。,动物细胞的种质保存技术,1、种质保存的必要性（1）动物细胞在连续的继代培养中，容易污染和产

16、生多种细胞混杂。（2）细胞株在继代培养过程中常常发生变异。（3）二倍体细胞存在寿命限制，无法进行大多的传代培养。2、保存形式（1）组织块（2）细胞悬浮物（3）细胞单层培养物3、保存方法4、超低温泠冻技术,3、保存方法,（1）常温法-将特定的动物细胞于20-30下进行保存的方法。如人羊膜细胞单层于28下可保存1个月。人肾细胞单层于25-30下可保存1个月以上。人二倍体细胞单层可保存二周，中间换液则可保存30天以上，（2）低温法-将特定的动物细胞于4下进行保存的方法。如人胚组织块于4下可保存1430天。（3）超低温泠冻法-将特定的动物细胞于-70以下、或者在液氮中进行保存的方法。超低温泠冻法可以长

17、期保存动物细胞，如二倍体细胞2BS自1973年来保存至今，其遗传性仍然没有变化。,4、超低温泠冻技术,（1）防冻剂准备（2）超低温泠冻的具体方法（3）超低温泠冻后的解冻方法,（1）防冻剂准备,超低温泠冻法需要使用防冻剂，以减少细胞在冻结过程中所受到的损伤。常用的防冻保护剂有：甘油、DMSO。A、甘油-毒性较小，能够结合水，减少组织结冰量，防止细胞内盐浓度升高，具有保护细胞的作用。其使用浓度一般为520%。B、DMSO-是目前应用较多的一种保护剂，使用浓度为5-12.5%，与甘油相比，DMSO的毒性更低、抗冻能力更强。,（2）超低温泠冻的具体方法,先配制8-10%的DMSO+15-20%的小牛血

18、清+适量NaHCO3的保护液将细胞培养物消化、分散、离心，收集单细胞按5*106个/ml的浓度添加保护液，1ml/支分装于安瓿瓶中0-4放置2-4小时-20放置2-4小时-702-4小时在液氮中进行保存,（3）超低温泠冻后的解冻方法,将安瓿瓶取出，包裹4层纱布浸入40水中，振摇融化40秒混匀后立即接种到1-2瓶100ml的培养瓶中按1-2-4-8ml的方式依次加入生长液。最终加至20ml。注意事项A、保护液中含DMSO时，可直接用来接种。B、保护液含甘油时，应该离心除去甘油以防影响细胞增殖。,动物细胞融合技术,动物细胞融合技术-也称动物体细胞杂交技术，是指二个或者二个以上的动物细胞在外力作用下

19、，合并为一个多核细胞的过程。细胞膜蛋白质重新分布是细胞融合的基础。（一）促融因素（二）细胞之间的融合（三）融合后杂种细胞的筛选技术,动物细胞融合,（一）促融因素,1、病毒诱导融合2、PEG诱导融合3、电场诱导融合4、其它诱导融合（1）聚乙烯醇（2）离心力,1、病毒诱导融合,某些不同种属的动物细胞在特定病毒、病毒外壳或者病毒碎片的作用下，可以发生融合作用。如仙台病毒、流感病毒、新城疫鸡瘟病毒、疱疹病毒等。当二种不同的动物细胞混合物中存在大量病毒时，病毒或其组分会在细胞间起粘连作用而使细胞聚集成团，细胞膜上的蛋白质和脂质双分子层产生重排、进而结合成一个整体。病毒所诱导的融合是随机的，无法人为控制，

20、同时融合率较低。,为什么灭活的病毒能作为诱导剂？,因为灭活的病毒能使细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合。,不灭活的病毒能作为诱导剂吗？,不能，因为不灭活的病毒会感染细胞。,2、PEG诱导融合,当二种不同的动物细胞混合物中存在PEG时，就会产生细胞聚集作用。在除去PEG的过程中，即产生细胞融合现象。所用的PEG分子量在1000-6000之间，一般浓度为40-50%，在37下作用2-3分钟，其促融效果最佳。PEG促融合的作用机理不清，其促融作用也具有随机性，无法人为控制。,聚乙二醇(PEG)法,二种原生质体等量混合之后，加入聚乙二醇（PEG）进行融合。所使用的PEG分

21、子量要求为1000-12000。再加入Ca、Mg。最终浓度要求：PEG-30-40%MgCl2-20mmolCaCl2-50mmolPH=9.0为了提高融合频度，同时可采用电诱导融合法、紫外线照射融合法。,聚乙二醇法的步骤图示,融合液：含山梨醇或甘露醇，Ca2，K。诱导液：融合液2045PEG稀释液：含葡萄糖，NaOH，甘氨酸等。,3、电融合法,原理：在直流电脉冲的诱导下，原生质体质膜表面电荷发生改变，从而使原生质体粘合并发生质膜瞬间破裂，进而连接闭合形成融合体。,电场诱导融合,将二种细胞混合物经过10-100V/cm的低强度非均匀交变电场作用时，细胞之间就会发生紧密接触，形成稳定的串珠状偶极

22、子排列。在此基础上再对细胞实施瞬间高强度电脉冲就会发生膜击穿，不同细胞间通过膜脂质分子重排就能实现融合，形成一个双核或者多核的细胞。一般来说，击穿电压为0.5-10KV/cm，作用时间为30-50微秒。电场诱导融合不损伤细胞，具有可人为操作的控制的特性，融合率较高。,电融合仪,（二）完整细胞之间的融合,取一定数量（107-108个/ml）的二种亲本细胞，充分混合离心，取下层细胞悬液0.1ml逐滴加入0.4ml、37、40%的PEG溶液，37静置90秒缓慢加入5-10ml无血清培养液，摇晃4-5次，离心，除去上清液每0.1ml细胞悬液加入25ml完全培养基，以每孔0.1ml分装于96孔培养板上。

23、37下CO2培养箱中培养。,动物细胞融合,动物细胞的融合还常常用到灭活的病毒作为诱导剂,单克隆抗体,由单个B淋巴细胞经过无性繁殖（克隆），形成基因型相同的细胞群，这一细胞群所产生的化学性质单一、特异性强的抗体称为单克隆抗体。特点：特异性强、灵敏度高,如何大量生产单克隆抗体？,利用淋巴细胞产生抗体的功能利用肿瘤细胞无限增殖的特性利用细胞融合的技术将两种细胞融合获得具有淋巴细胞和肿瘤细胞特性的杂交瘤细胞利用动物细胞培养技术大量培养杂交瘤细胞,单克隆抗体制备过程,细胞融合、筛选,足够数量的、能产生特定抗体的细胞群,单克隆抗体,（三）融合后杂种细胞的筛选技术,筛选杂种细胞的目的是为了获得性能优良的杂合

24、细胞。1、杂种细胞的筛选原理2、筛选系统,（三）融合后杂种细胞的筛选技术,筛选杂种细胞的目的是为了获得性能优良的杂合细胞。1、杂种细胞的筛选原理2、筛选系统,1、杂种细胞的筛选原理,将融合后的细胞混合物于选择性培养基上培养，终止那些同型多核、异型多核细胞以及未能发生融合的亲本细胞的生长繁殖，而仅仅允许异型双核细胞繁殖。（1）同型多核融合细胞-无法合成DNA，而失去繁殖能力。（2）异型多核融合细胞-细胞核不能进行再次分裂，也失去繁殖能力。,2、筛选系统,（1）HAT选择系统（2）抗药性选择系统（3）营养互补选择系统（4）原位杂交法（略）（5）基因探针选择法（略）,（1）HAT选择系统,正常的动物

25、细胞，其DNA的合成途径有二条：全合成途径-利用外源性营养物合成DNA。这一途径能被氨基喋呤所阻断。补救合成途径-利用游离嘌呤和嘧啶来合成。HAT是含有次黄嘌呤（H）+氨基喋呤（A）+胸腺嘧啶核苷（T）的一种选择性培养基。A、骨髓瘤细胞-骨髓瘤细胞能够在体外长期分裂繁殖，但是其DNA合成存在着缺陷。当培养基中含有氨基喋呤（A）时，骨髓瘤细胞就无法正常生长。HPRT-型骨髓瘤细胞-属于次黄嘌呤鸟嘌呤核苷酸转移酶缺陷型细胞，其嘌呤只能通过全合成途径进行合成。TK-型骨髓瘤细胞-属于胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型细胞，其嘧啶只能通过全合成途径进行合成。B、淋巴细胞-同时含有合成DNA的二条途径，但是不能够在

26、体外长期分裂繁殖。在人工培养基中的存活时间只有1-2天。C、骨髓瘤细胞+淋巴细胞=杂交瘤细胞-既能够在体外长期分裂繁殖，又能够通过二条途径合成DNA因此在带有选择性的HAT培养基中，只有杂交瘤细胞才能正常存活。,（2）抗药性选择系统,利用生物细胞对于药物敏感性的差异程度，来筛选杂种细胞的方法，称为抗药性选择系统。一种亲本细胞M对药物A敏感、同时对药物B不敏感。另一种亲本细胞N对药物A不敏感、而对药物B敏感。M+N融合后的杂合细胞P同时对药物A、B均不敏感。那么，在同时含有药物A、药物B的选择性培养基中（A）亲本细胞M不能生长（B）亲本细胞N也不能生长（C）只有杂合细胞P才能在选择性培养基中存活

27、。这样，经过反复分离和继代移植，就可以筛选出杂种细胞。,（3）营养互补选择系统,生物细胞在缺乏某种营养成份时就不能生长，这种细胞称为营养缺陷型细胞。A亲本细胞为色氨酸缺陷型。B亲本细胞为苏氨酸缺陷型。A+B融合后的杂合细胞C则为非缺陷型。在同时不含色氨酸+苏氨酸的选择性培养基中。A、B亲本细胞均不能正常生长而只有A+B融合后的杂合细胞C才能存活,动物细胞大规模生产技术,动物细胞大规模培养技术是指在人工条件下，在细胞生物反应器（bioreactor）中，进行大量培养有用的动物细胞，生产药品的技术。20世纪60-70年代，就已创立了可用于大规模培养动物细胞的微载体培养系统和中空纤维细胞培养技术。是

28、目前生物高科技药物大规模生产的核心技术（一）培养材料（二）培养基（三）培养方法（四）动物细胞生物反应器（五）操作方式（六）动物细胞培养国内外生产现状,（一）动物细胞大规模培养材料,传代细胞系：原代细胞经过传代、筛选、克隆等步骤，从多种细胞中纯化得到的某种具有一定特征的细胞系。可传代30-50代，属有限细胞系，无致瘤性。转化细胞系：正常细胞经过某个转化过程，失去正常细胞的特点而获得无限增殖的能力。有永生性，属无限细胞系。如Vero细胞、CHO细胞、BHK细胞工程细胞系：采用细胞融合或基因工程技术构建的细胞系,（二）培养基,1、含小牛血清的培养基-在培养基中添加5-10%的小牛血清。2、不含小牛血

29、清的培养基-具体有三种类型（1）基本合成培养基（2）基本合成培养基+生长因子（3）基本合成培养基+组织抽提物起血清作用的各类生长因子-铁传递蛋白、乙醇胺、胰岛素、促胃酸激素、维生素C、可的松、硒等等成份。,（二）培养方法,1、细胞悬浮培养法：CHO细胞(中华仓鼠卵巢)、BHK-21细胞(仓鼠肾)，杂交瘤细胞，昆虫细胞等进行悬浮培养2、滚瓶培养法3、微载体培养法：(贴壁-悬浮培养)4、固定化培养法：人二倍体细胞、传代细胞Vero细胞(非洲绿猴肾)等利用载体进行贴壁培养,1、细胞悬浮培养法,（1）细胞悬浮培养法的概念（2）细胞悬浮培养法的工艺流程（3）细胞悬浮培养法的注意事项,（1）细胞悬浮培养法

30、的概念,是细胞在培养液中呈现悬浮生长繁殖的方法称为细胞悬浮培养法，是细菌发酵基础上改进的主要用于非贴壁依赖型细胞培养，如杂交瘤细胞等,也适用于兼性贴壁细胞气升式，搅拌式反应器细胞悬浮培养法的操作方式有3种：分批法、半连续法、连续法。细胞悬浮培养法适用于培养确立细胞株、杂交瘤细胞、肿瘤细胞、血液细胞和淋巴细胞。可用来大量生产疫苗、a-干扰素、白介素、淋巴细胞杂交瘤单克隆抗体（McAb）。,（2）细胞悬浮培养法的工艺流程,由配料罐培养液贮罐平衡罐前培养罐主培养罐培养液分离槽离心提取干燥设备所组成。在配料罐内配制培养液，经过无菌过滤之后，送入培养液贮罐送入平衡罐，调整氧化还原电位至70-100Mv，

31、以提高细胞生长繁殖速度送入前培养罐进行细胞增殖培养，再送入主培养罐生产和合成药物培养后的细胞悬液送入收集罐和分离槽离心提取干燥设备,（3）细胞悬浮培养法的注意事项,A、在培养过程中，需要采用搅拌式反应器或者气升式反应器，通入含水量5%CO2的无菌空气，并维持培养液中一定的溶解氧。B、为了使细胞不至于产生凝聚、成团或者沉淀，在培养基的基础盐溶液中不加Ca和Mg。C、在进行动物细胞培养过程中，随时检测和控制培养过程的温度、压力、溶解氧、CO2、PH值、氧化还原电位、搅拌速度、通气量、营养成份。D、细胞密度：在动物组织中的细胞密度为109个/ml，为自然界中的最高密度状态。体外悬浮细胞培养状态，细胞

32、密度一般控制在5*106个/ml。在新颖的灌流培养系统中，细胞密度可达到107个/ml。,4、固定化培养法,（1）固定化培养法的定义（2）动物细胞的固定化培养方法（3）目前已经开发的固定化培养装置（4）中空纤维培养器,（1）固定化培养法的定义,又称大载体培养，指采用高分子材料将细胞限制或者定位于特定的空间位置，制成固定化颗粒，进而在培养液中培养的技术称为细胞固定化培养法。固定化培养有优点有：A、细胞可维持在较小体积的培养液中生长。B、对细胞抗剪切力和污染力强。C、易于更换培养液。D、细胞和培养液容易分离，分离纯化简单。E、细胞生长密度高，培养液中产物浓度高。,（2）动物细胞的固定化培养方法,包

33、埋法-将细胞包埋于海藻酸钠、海藻酸钙、琼脂、琼脂糖、胶原、血纤维等海绵状基质之中。微囊法-将包埋好的细胞，再用长链氨基酸聚合物、多聚赖氨酸包被形成半通透性外被膜。吸附法-有陶瓷颗粒、玻璃珠、硅胶颗粒等多空载体、中空纤维膜。,（3）目前已经开发的固定化培养装置,1、多层平板式反应器2、多层园盘式反应器3、螺旋转膜式反应器4、多层托盘式反应器5、卷带式反应器6、中空纤维筒式反应器7、流化床式反应器8、微载体搅拌式悬浮培养反应器9、笼式通气搅拌反应器10、贴壁培养反应器11、蜂窝状反应器,2、滚瓶培养,适用于贴壁依赖型细胞和兼性贴壁细胞。放大容易，也能实现灌流培养。操作繁琐，传代或放大时需要用蛋白酶

34、将细胞从瓶壁上消化下来。,2、微载体培养法,（1）定义-将细胞吸附于微载体表面，再在培养液中进行悬浮培养，使细胞在微载体表面生长成单层的方法称为微载体培养法。（2）微载体培养法的优点:兼有贴壁培养和悬浮细胞培养的双重特点。在不增加培养罐体积的条件下就能增加动物细胞产量。60-250um的颗粒，创造大面积供细胞贴附生长载体体积小，比重轻，在轻度搅拌下即可携带细胞悬浮于培养基20世纪80年代正式用于工业化生产各种疫苗和细胞产品,（3）微载体培养法所用的材料,对细胞无毒；容易使细胞产生贴附；其密度大于1；溶胀后微粒的直径为200-300um，可容纳几百个细胞；耐高温；非刚性，避免相互碰撞对细胞损伤；

35、不吸附培养基中营养成分；多次使用。目前已经选用的材料有：DEAE-Sephadex-A50DEAE-Sephadex-A52QAE-Sephadex 经处理的塑料 尼龙二甲基氨基丙基聚丙烯酰胺 聚苯乙烯市场上出售的商品微粒有：DEAE-交联葡聚糖（Cytodex-1，Superbeads）二甲基氨基丙基聚丙烯酰胺（Biocarrier）聚苯乙烯（Biosilon）,商业化微载体,（三）动物细胞生物反应器,实验室规模：小于20L的反应器，培养工艺研究中试规模：20-100L的反应器，提供一定量的产品，共纯化、临床前的各种检测和临床观察，工艺优化实验等的需要生产规模：大于100L，1000L居多，

36、最大达8000L，用于生产，提供产品,90,搅拌式生物反应器,最经典、最早用于动物细胞培养的反应器通气好，搅拌剪切力小，有利于长时间，高密度培养主要用于悬浮细胞的培养、微载体培养、微囊培养以及结团培养,笼式通气搅拌器的改进-NBS装置,作为对最初设计的笼式通气搅拌器的改进，NBS装置中分别包括笼式的通气腔和消泡腔。气液交换在由200目不锈钢丝网制成的通气腔内实现；而在鼓泡通气过程中所产生的泡沫经管道进入液面上部的由200目不锈钢丝网制成的笼式消泡腔内，泡沫经钢丝网破碎分成气、液两部分，达到深层通气而不产生泡沫的目的。,气升式生物反应器,没有搅拌，气体通过喷管进入剪切力更小主要用于悬浮细胞的分批

37、式培养，近年开发用于贴壁细胞的微载体培养，并进行半连续、连续和灌流式培养,气升式细胞培养反应器不仅在植物细胞培养中应用广泛,而且在动物细胞培养中也取得了很大的成功。,和搅拌式生物反应器相比，气升式反应器中产生的湍动温和而均匀，剪切力相当小；同时反应器内无机械运动部件，因而细胞损伤率比较低；反应器通过直接喷射空气供氧，氧传递速率高；反应器内液体循环量大，细胞和营养成分能均匀分布于培养基中。,3.固定床或流化床式生物反应器,反应器内装不锈钢、玻璃珠、玻璃环、光面陶瓷、塑料或有孔的陶瓷、玻璃、聚氨酯塑料等载体Verax公司推出的CF-IMMO培养系统（右图）专用于比重较大的多孔微球的培养,4.膜式生

38、物反应器,培养分为两室或三室，培养基与细胞用滤膜分开既可用于贴壁细胞培养也可培养悬浮细胞优点：可使细胞达到很高密度；可随意组合进行操作，达到保留和浓缩产品或及时分离提纯产品,（四）动物细胞大规模培养的操作方式,分批操作(batch)补料-分批操作半连续式操作(semi-continuous)连续式操作(continuous)：除个别情况下用于悬浮细胞的培养生产外，一般用灌流培养来代替。灌流式操作(perfusion),我国动物细胞工程制药的目标,(1)建立动物细胞大规模培养的技术平台。该平台是基因工程药物、单克隆抗体及疫苗等产品的关键，由以下几个要素构成：1)高效的真核细胞表达系统。CHO表达

39、的外源蛋白最接近天然构象，是最为想的表达系统，但存在表达量低、大规模培养困难、生产成本高昂等问题。对细胞本身的生理特征进行改造，除了要求目的蛋白的表达量高外，必须适应无血清培养基培养，具有即抗细胞衰老凋亡能力；2)性能优越的、个性化的细胞培养基，包括低血清培养基、无血清培养基；3)先进的生物反应器设备；,动物细胞工程的实例,组织纤溶酶原激活剂（t-PA）生产工艺,1、组织纤溶酶原激活剂（t-PA）生产工艺,组织纤溶酶原激活剂是一种丝氨酸蛋白酶，属单链糖蛋白，它可使组织纤溶酶原活化成纤溶酶，而纤溶酶可水解纤维蛋白，因此组织纤溶酶原激活剂对血栓具有治疗作用。培养基-Eagle培养基，加入青霉素10

40、0U/ml、链霉素100U/ml、10%小牛血清。（1）工程细胞构建（2）细胞培养（3）t-PA抗体的制备（4）抗t-PA的亲和吸附剂的制备 A、Sepharose 4B的活化 B、抗t-PA亲和吸附剂（t-PA-IgG-Sepharoes-4B亲和吸附剂）的制备（5）t-PA的分离（6）t-PA的精制,（1）工程菌构建,人肺组织提取总RNA由mRNA转录成cDNA特异性扩增t-PA基因,鉴定,脂质体法转染仓鼠卵巢细胞,工程细胞,（2）细胞培养,取5L玻璃转瓶，按每平方米表面积2.5L的比例加入Eagle细胞培养液。将工程细胞按常规方法消化分散、洗涤、计数、稀释成细胞悬液。将细胞悬浮液接种到转

41、瓶之中，接种浓度为3*103个/ml置于CO2培养箱中，37下培养、通入含5%CO2的无菌空气等到长成致密单层之后，弃去培养液，用PH=7.4、0.1mol/L的磷酸缓冲液洗涤细胞单层2-3次。换入无血清Eagle培养液继续培养每隔3-4天收获一次培养液，用于制备t-PA。同时向转瓶中加入新鲜培养液继续培养如此反复，可获得大量t-PA。,（3）t-PA抗体的制备,取人t-PA、或者猪心t-PA按每只家兔200-300ug的计量，t-PA采用福氏完全佐剂充分乳化，注射入家兔皮下。每隔2周再用t-PA100ug进行加强免疫，共加强2次取家兔血清用50%硫酸铵盐析沉淀物于0下，用生理盐水透析经过Se

42、phadex 75柱层析得到抗t-PA的免疫球蛋白IgG备用,（4）抗t-PA的亲和吸附剂的制备,A、Sepharose 4B的活化B、t-PA的亲和吸附剂（IgG-Sepharoes4B亲和吸附剂）的制备,A、Sepharose 4B的活化,Sepharose 4B用10倍体积的蒸馏水（V/V）多次漂洗、布氏漏斗抽滤取20克Sepharose 4B湿凝胶放入500ml的三颈烧瓶中，加蒸馏水30ml，搅均匀后，用2mol/L的NaOH溶液调节PH=11，降温至18在通风橱中，另取溴化氰1.5g于乳钵中，加入30-40ml蒸馏水分多次研磨溶解将溴化氰溶液倒入三颈烧瓶中，升温至20-22，同时滴加

43、2mol/L的NaOH溶液调节PH=11-12等反应液PH值不变时，继续反应5分钟，取出烧瓶，向其中投入小冰块降温，用3号垂熔漏斗抽滤用300ml、4、0.1mol/L的NaHCO3溶液洗涤。然后用300ml、PH=10.2、0.025mol/L的硼酸缓冲液分3-4次抽滤洗涤最后转移至250ml的烧瓶中，加入50-60ml的硼酸缓冲液，即得活化的Sepharose 4B，备用,B、t-PA的亲和吸附剂（IgG-Sepharoes 4B亲和吸附剂）的制备,取抗t-PA的免疫球蛋白IgG，70-80mg溶于20ml硼酸缓冲液中、过滤。滤液加入到已经活化的Sepharose 4B中，10下搅拌反应1

44、6-18小时第二天装柱，用10倍柱床体积（V/V）、PH=10.2的硼酸缓冲液，以5-6ml/min的流速洗涤柱床。收集流出液，测定其A280用5倍柱床体积（V/V）的、PH=10.0、0.1mol/L乙醇胺溶液洗涤柱床用5倍柱床体积（V/V）的、PH=8.0、0.1mol/L硼酸缓冲液洗涤柱床用5倍柱床体积（V/V）的、PH=7.4、0.1mol/L磷酸缓冲液洗涤平衡。直到流出液的A280小于0.01，所得到的固定化抗t-PA的免疫球蛋白IgG，就是待提取的t-PA的亲和吸附剂。将其转移至含0.01%NaN3的、PH=7.4、0.1mol/L的磷酸缓冲液中，于4下贮存，备用。,（5）t-PA

45、的分离,步骤-2中所收集到的培养液中，加入蛋白酶抑制剂aprotinin至5万单位/ml。加吐温-80至于0.01%、过滤、除去沉淀.滤液稀释3倍稀释液上柱，以5ml/min的流速进入IgG-Sepharoes4B亲和柱（直径4cm*长度40cm）。用含0.01%的吐温-80+2.5万单位/ml的蛋白酶抑制剂aprotinin+0.25mol/L的KSCN的PH=7.4、0.1mol/L的磷酸缓冲液以同样的流速洗涤亲和柱，以除去杂蛋白最后用3mol/L的KSCN溶液洗脱亲和柱，以每管10-15ml的体积进行分区收集合并t-PA的洗脱峰，装入透析袋内，埋入到PEG20000中浓缩至原体积的1/1

46、0-1/5。各t-PA粗提物,（6）t-PA的精制,t-PA粗提物进Sephadex-G-150柱（直径2cm*长度100cm）用含0.01%的吐温-80的1mol/L的NH4HCO3溶液以2-3ml/min的流速进行洗脱以每管10-15ml的体积进行分区收集合并t-PA的洗脱峰，于冻干机中进行冻干得t-PA精品,第二节、植物细胞工程制药基本技术,一、植物细胞工程概况二、植物细胞工程制药基本技术,一、植物细胞工程概况,植物细胞培养-是指在体外无菌和人工控制条件下，使植物细胞生长、增殖、发育的技术。,1、植物细胞培养基本概念,1902年，德国Haberlandt提出了细胞全能性学说，并进行了植物

47、叶肉细胞、髓细胞、腺细胞、气孔保卫细胞、表皮细胞的培养试验,奠定了细胞工程的基础。之后至30年代，建立了基本的植物组织培养技术,2、植物细胞工程发展历史,50年代期间，植物细胞工程进入新的阶段培养基的设计生物反应器培养动力学等用于次级代谢产物的 调控研究,80年代后，高速发展时期分子生物学技术改变植物遗传特性植物细胞培养技术进行有药用价值的天然产物的工业化生产和直接生产次生代谢产物成为主流目前，我国处于此方面的领先,可供培养的植物种类（1）到目前为止，有研究显示，近300种植物的细胞培养物能够产生400多种有效的药用成份。（2）许多药用植物如人参、长春花、紫草、甘草、紫杉、银杏、黄连等，其细胞

48、培养十分成功。（3）据初步统计，有约30种化合物在培养细胞中的含量已经超过1%，如紫草素的含量可达12%、小檗碱的含量可达1%，人参皂苷可达7%。,基本概念-细胞分化,在个体发育中，由一个或一种细胞增殖产生的后代，在形态、结构和生理功能上发生稳定性差异的过程，叫做细胞分化。,1、细胞分化的概念2、细胞分化的特点,1、持久性：分化了的细胞将一直保持分化后的状态，直到死亡；(细胞分化发生在生物体的整个生命进程中，但在胚胎时期达到最大程度；)2、普遍性：细胞分化是生物界中普遍存在的生命现象，是生物个体发育的基础。,3、细胞分化的意义,1、对于多细胞的生物来说，没有细胞的分化就没有个体发育；2、细胞分

49、化使多细胞生物体中的细胞趋向专门化，有利于提高各种生理功能的效率。,4、细胞分化后遗传物质是否发生了变化？,遗传物质没有变化，不同组织的细胞都是来源于受精卵，经有丝分裂产生。细胞分化的实质是基因选择性表达的结果。,细胞的全能性及分化,细胞的全能性,1、细胞的全能性概念：细胞的全能性:一个细胞所具有的产生完整生物个体的固有能力。2、细胞的全能性原因：,细胞内具有发育成个体的全部遗传物质，分化的根茎叶中仍保留少数未分化或分化程度不高的细胞（遗留的胚性细胞）,已经分化的细胞，仍然具有发育成完整个体的潜能；,细胞全能性比较权威的定义是1984年国际组织培养协会做出的：“细胞全能性为细胞的某种特征，有这

50、种能力的细胞保留形成有机体所有细胞类型的能力”。,细胞脱分化就是让已经_的细胞，经过诱导后，失去其特有的_而转变成_细胞的过程。在植物中，一些分化的细胞，经过_的诱导，可以_为其有分生能力的薄壁细胞，进而形成植物的愈伤组织。愈伤组织在一定的培养条件下，又可以_出幼根和芽，形成完整的小植株。,细胞脱分化和再分化,分化,结构和功能,未分化,激素,脱分化,再分化,一团没有特定结构和功能并处于旺盛分裂状态的薄壁细胞，排列疏松，无规则，高度液泡化,科学家利用菊花的花瓣培养出的菊花。那么，植物的花瓣是怎样培育成一株完整植株的呢？,植物的花瓣属于_的组织，利用它来培育出新的植株，首先要通过细胞的_过程，培养