抗生素备课第八章发酵过程的控制.ppt

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1、第八章 发酵过程的控制,微生物发酵的生产水平取决于：1）生产菌种本身的特性；2）合适的环境条件，,第一节 发酵过程主要控制参数与微生物发酵有关的参数，可分为物理、化学和生物三类。一、物理参数1、温度（）2、压力（Pa）3、搅拌转速（r/min）4、搅拌功率（kV）5、空气流量V/（V min），简称VVM6、黏度,二、化学参数1、pH值2、基质浓度 指发酵液中糖、N、P等重要营养物质的浓度。3、溶解氧浓度4、产物浓度,三、生物参数1、菌丝形态 一般都以菌丝形态作为衡量种子质量、区分发酵阶段、控制发酵过程的代谢变化和决定发酵周期的依据之一。2、菌体浓度,参数检测传统的检测在线测量：。抗生素发酵过

2、程中在线测量有许多优点，如及时、省力，且可从烦琐操作中解脱出来，便于计算机控制。但其应用的困难在于发酵液的性质复杂，一般培养液中同时存在三相，即液、气、固体不溶物或油。,第二节 发酵过程中的代谢变化微生物培养有：分批培养、分批补料培养和连续培养三种方式。工业上大都采用分批培养和分批补料培养，特别是分批补料培养。1、分批培养：指在一封闭培养系统内含有初始限制量的基质的发酵方式。,发酵过程的三个时期：,1,2,3,1.停滞期2.对数期3.稳定期,时间,细胞数目的对数,1）停滞期 在刚开始接种后的一段时间，几乎未见菌体浓度的增加。工业上要求尽可能缩短延滞期，这可通过使用适当种龄的种子和接种量达到。2

3、）对数生长期 微生物在此期内的比生长速率最大，细胞数目呈指数生长。3）稳定期 由于养分的消耗和 微生物产物的分泌，生长速率逐渐减速直至停止。生长终止原因可能是由于某些必须养分的耗尽和自体毒性代谢物在培养基上积累的结果。在稳定期，许多次级代谢产物在此期合成，因此也称为生产期。,2、补料分批发酵（Fed-batch culture，FBC）指在分批培养过程中，间隙或连续地补加新鲜培养基的培养方法。3、连续发酵 也称连续流加培养，即培养基料液连续输入发酵罐，并同时放出含有产品的发酵液。由于营养物质的供应与消耗相平衡，培养系统成为稳定的状态。,连续培养优点：能维持低基质浓度，可以提高设备的利用率和单位

4、时间的产量，节省发酵罐的非生产时间，便于自动控制。但由于培养时间长，难以保证纯种培养。并且菌种变异可能性较大，故在工业规模上很少采用。,第三节 基质的影响及其控制基质：培养微生物的营养物质。基质是产生菌代谢的物质基础，既涉及菌体的生长繁殖，又涉及代谢产物的形成。一、C源种类和浓度的影响及控制迅速利用碳源：缓慢利用碳源：,碳源浓度的控制:采用中间补料的方法控制，包括补糖时间、补糖量和补糖方式。,二、N源种类和浓度的影响及控制N源：有机N源、无机N源 迅速利用N源：缓慢利用N源：如黄豆饼粉、花生饼粉、棉子饼粉等，对延长抗生素的分泌期、提高产物的产量有好处。发酵培养基一般是选用快速和慢速利用的混合源

5、。,为了调节菌体生长和防止菌体衰老自溶，除了基础培养基中的N源外，还要在发酵过程中补加N源来控制浓度。生产中采用的方法有：1、补加有机N源 根据产生菌的代谢情况，可在发酵过程中添加酵母粉、玉米浆、尿素等。2、补加无机N源 补加氨水或硫酸铵是工业上的常用方法。氨水既可作为无机N源，又可调节pH。,三、磷酸盐浓度的影响和控制微生物生长良好所允许的磷酸盐浓度为0.32300 mmol,但对抗生素合成良好所允许的最高平均浓度仅为1.0 mmol,提高到10 mmol,就明显地抑制其合成。磷酸盐浓度的控制，一般是在基础培养基中采用适当的浓度。对抗生素发酵来说，常常采用生长亚适量（对菌体生长不是最适合但又

6、不影响产物合成的量）的磷酸盐浓度。,第五节 温度的影响极其控制一、温度对发酵的影响温度的变化对发酵可产生两方面的影响：一方面是影响各种酶反应的速率和蛋白质的性质；另一方面是影响发酵液的物理性质。,另外，温度有时也会影响菌体代谢产物合成的方向。金色链霉菌进行四环素发酵中，随着发酵温度的提高，有利于四环素的合成，30 以下时合成的金霉素增多，达35 时就只产四环素，而金霉素合成几乎停止。温度对发酵液的黏度、基质和氧在发酵液中的溶解度和传递速率、某些基质的分解和吸收速率等，都受温度变化的影响，进而影响发酵动力学特性和产物的合成。,二、影响发酵温度变化的因素Q发酵=Q生物+Q搅拌 Q蒸发 Q显 Q辐射

7、,三、温度的控制1、最适温度的选择作为次级代谢产物的抗生素,微生物发酵其最适菌体生长温度和最适抗生素合成温度往往存在差异。如在2%乳糖、2%玉米浆和无机盐的培养基中对青霉素产生菌进行发酵研究，测得菌体的最适生长温度为30，而青霉素合成的最适温度又为24.7。,又如在林可霉素发酵的不同阶段采用不同的培养温度，对生产菌菌丝形态和发酵单位产生影响。培养起初60维持在31,随后降到30培养70,再回升至31培养至放罐,结果显示:生产菌中、后期菌体浓度下降幅度减小,菌丝上的空泡缩小,自溶期推迟,发酵单位得到了提高。因此发酵温度的确定，在理论上，整个发酵过程中不应只选一个培养温度，而应根据不同的阶段，选择

8、不同的温度。在生长阶段，应选择最适生长温度，在产物分泌阶段，应选择最适生产温度。,最适发酵温度还随菌种、培养基成分、培养条件和菌体生长阶段而改变。如，在较差的通气条件下，由于氧的溶解度是随温度下降而升高，因此降低发酵温度对发酵是有利的，因为低温可以提高氧的溶解度、降低菌体生长速率，减少氧的消耗，从而可弥补通气条件差所带来的不足。2、温度的控制由于发酵过程中释放大量发酵热，需要冷却情况较多。一般情况下，将冷却水通入发酵罐的夹层或蛇形管中，进行热交换降温。如果气温较高，冷却水的温度又高，可采用冷冻盐水进行循环式降温。,第六节 pH的影响极其控制一、微生物细胞生长和代谢产物形成的最适pH值不同微生物

9、对pH值的要求不同，大多数细菌的最适pH值为6.5-7.5,霉菌的最适pH值为4.0-8.0,酵母菌的最适pH值为3.8-6.0,放线菌的最适pH值为。pH值不仅影响微生物的生长，还会影响到代谢产物的形成。,并且微生物生长的最适pH值和发酵产物形成的最适pH值往往不同。如青霉素产生菌生长的最适pH值为6.5-7.2,而青霉素合成的最适pH值为。链霉素产生菌生长的最适pH值为6.3-6.9,而青霉素合成的最适pH值为。二、pH对微生物生长繁殖和产物的形成的影响原因,三、发酵过程中pH值的变化情况发酵过程中由于微生物细胞在一定的温度及通气条件下，随着微生物对培养基中的营养物质的利用及某些物质的积累

10、，发酵液的pH值会发生一定的变化。1、在微生物细胞的生长阶段，相对于接种后的起始pH值来说，发酵液的pH值有上升或下降的趋势。,2、在生产阶段，一般发酵液的pH值趋于稳定，维持在最适产物形成的pH范围。3、在微生物细胞的自溶阶段，随着培养基中营养物质的耗尽，微生物细胞内蛋白酶积累和活跃，微生物趋于自溶，引起培养液中的氨基氮等的增加，致使pH上升。引起发酵液pH值下降的主要原因有：1）培养基中C/N比例不当，C源过多，如葡萄糖过量或中间补糖过多或溶解氧不足，使糖的氧化不完全，培养液有机酸大量积累，使pH值下降；2）消泡油加得过多；3）生理酸性物质的存在，使pH值下降。,引起发酵液pH值上升的主要

11、原因有：1）培养基中C/N比例不当，氮源过多，氨基氮释放会使pH值上升；2）生理碱性物质的存在；3）中间补料液中氨水或尿素等碱性物质加入过多。四、发酵过程中pH的控制1、调节培养基的原始pH值，或加入缓冲溶液制成缓冲能力强、pH值变化不大的培养基，或使盐类和碳源的配比平衡。2、可在发酵过程中加入弱酸或弱碱进行pH值的调节，进而合理地控制发酵条件。3、如果仅用酸或碱调节pH值不能改善发酵情况时，进行补料是一个较好的办法，既调节,了pH值，又可补充营养，也进一步提高发酵产率。通过补料调节pH值来提高发酵产率的方法已在工业发酵过程中取得了明显的效果。4、生理酸性铵盐作为氮源时，引起pH下降，可在培养

12、液中加入CaCO3来调节pH值。但需要注意的是，CaCO3的加入量一般都很大，在操作上容易引起染菌。因此，此方法在发酵过程中应用不是太广。5、在发酵过程中根据pH值的变化可用流加氨水的方法来调节，同时又把氨水作为氮源供给。由于氨水作用快，对发酵液的pH值波动影响大，应采用少量多次的流加方法进行流加，以免造成pH值过高，抑制微生物的生长。,6、以尿素作为氮源进行流加调节pH值。尿素流加引起的pH值变化有一定的规律性，易于操作控制。,第七节 溶氧的影响及其控制在抗生素生产的有氧发酵中,保证足量的溶解氧浓度是发酵控制的主要因素之一。氧在水中的溶解度很小，在25和1105Pa时，空气中的氧在水中溶解度

13、仅0.25mol/m3左右,能维持微生物菌体1520s的正常呼吸，随之就会耗尽。在实验室中，通过摇瓶机的往复运动对摇瓶中的微生物供养，而中间实验规模和生产规模的培养装置则需采用通入无菌空气并同时进行搅拌的方式对微生物供养。,通气和搅拌的目的就是提供微生物生长和代谢所需的氧，并使微生物在培养液中处于悬浮状态以及提高代谢产物的传递速度。一、发酵过程溶解氧浓度的变化对多数发酵来说，氧的不足会造成代谢异常，产量降低。溶解氧最易变为发酵中的主要矛盾。只有了解发酵过程中溶解氧浓度的变化，才能有效地控制发酵的进行。,如金霉素发酵，在生长期中短时间停止通气，就可能影响菌体在生产期的糖代谢途径，由磷酸戊糖途径转

14、向糖酵解途径，使金霉素合成的产量减少。1、临界氧浓度临界溶氧浓度：当培养基中不存在其他限制性基质时，不影响好氧性微生物生长繁殖的最低溶解氧浓度称为临界氧浓度。,而微生物发酵的最适氧浓度与临界氧浓度是不同的。最适氧浓度：溶解氧浓度对生长或产物合成的最适的浓度范围。为了避免发酵处于限氧条件下，需要考查每一种发酵产物的临界氧浓度和最适氧浓度，并使发酵保持在最适氧浓度范围。这样便可减少批次之间的波动和更有效地利用空气动力。需氧发酵并不是溶氧愈大愈好。溶氧较高虽然有利菌体的生长和产物的合成，但当溶氧水平太大,有时会抑制产物的形成。,2、溶解氧浓度的变化规律在设备和工艺条件不变的情况下，发酵过程中溶解氧的

15、变化有一定的规律。1）在发酵前期：由于产生菌大量繁殖，需氧量不断大幅度增加，此时需氧超过供养，溶氧明显下降，溶氧曲线出现一个低谷。2）过了生长阶段，一般需氧量略有减少，溶氧随之上升，次级代谢产物开始形成。发酵中后期，溶氧浓度明显受工艺控制手段的也许，如补料的数量、时机和方式等。如，在补糖后，菌体的需氧量增加，引起溶氧下,降，其下降幅度与菌龄、补糖量及补糖前的溶氧浓度都有关系。如工艺控制不合适，不断地大量补糖，会使溶氧浓度低于临界氧浓度，此时溶解氧就会成为生产的限制因素。3）在发酵后期，由于菌体衰老，呼吸减弱，溶氧浓度也会逐步上升，一旦菌体自溶，溶氧就会明显地上升。3、发酵异常时的溶氧变化发酵过

16、程中若有染菌、污染噬菌体、菌体代谢异常、加油器失灵等异常情况出现，都可能引起溶氧浓度的异常变化。,1）发酵液中污染好气性杂菌，溶氧浓度会在短时间内跌到零值附近，且长时间不能回升，这比用无菌试验来反映杂菌情况要快48h。2）但不是一染菌溶氧就会有大幅度的下跌，要看所染杂菌的种类和数量，还要看杂菌和产生菌谁占优势。有时染菌也会出现溶氧反而升高的现象，这是因为生产菌受到杂菌抑制，而杂菌本身又非十分好气。这样生产菌的呼吸大为减弱而使溶氧上升。这种情况在污染噬菌体的发酵液中更为灵敏，更早地发出预报。3）补料或加油在供氧不良的罐内也会引起溶氧迅速降低,若溶氧原来就较低就容易降至零。一般13h溶氧回升，这可

17、与染菌时的溶氧变化相区别。4）某些设备故障也会引起溶氧的变化。例如自动加油器失灵，大量漏油，会引起溶氧迅速下降。,二、溶解氧浓度的控制要控制发酵液中的溶氧浓度，从供养与需氧两方面着手。影响氧传递系数的一些因素1、搅拌,它能从以下几个方面改善溶氧速率：1）搅拌能把大的空气泡打碎成为微小气泡，增加了氧与液体的 接触面积，而且小气泡的上升速度要比大气泡的慢，相应地氧与液体的接触时间也就增长；2）搅拌使液体作涡流运动，使气泡不是直线上升而是作螺旋运动上升，延长了气泡的运动路线，增加了气液的接触时间；3）搅拌使发酵液呈湍流运动，从而减少气泡周围液膜的厚度，减少液膜阻力，因而增大了KLa值；4）搅拌使菌体

18、分散，避免结团，有利于固液传递中的接触面积的增加，使推动力均一，同时也减少了菌体表面液膜的厚度，有利于氧的传递。,2、空气的线速度当增加通风量时，空气的线速度也就相应地增大，从而增加了溶氧，氧传递系数Kla相应地也增大。当然过大的空气线速度会使搅拌桨叶不能打散空气，气流形成大气泡在轴的周围逸出，使搅拌效率和溶氧速率都大大降低。3、空气分布管空气分布管的型式、喷口直径及管口与罐底距离的相对位置对氧溶解速率有较打影响。,4、培养液的性质在发酵过程中，由于微生物的生命活动，分解并利用培养液中的基质，大量繁殖菌体，积累代谢产物等都引起培养液的性质改变。5、表面活性剂培养液中消泡用的油脂等具有亲水端和疏

19、水端的表面活性物质分布在气液界面，增大了传递的阻力，使氧传递系数Kla降低。,需氧的控制：在一定的供氧能力下能控制需氧量，既做到满足生产菌的生长和产物合成对氧的需要，又不超过设备的供氧能力，使生产菌在这一条件下发挥最大的生产能力。控制办法：如控制补料速度、温度的调节，中间补水，控制菌体浓度。,第八节 补料的作用及其控制一、补料分批培养作用补料分批培养（FBC）对微生物发酵有下列几个基本作用：1、可以控制抑制性底物的浓度 在许多发酵过程中，微生物的生长是受到基质浓度的影响。要想得到高密度的生物量，需要投入几倍的基质。再增加底物浓度，就可能发生一种基质抑制区，迟滞期延长，比生长速率减小，菌浓下降等

20、，所以高浓度营养物对大多数微生物生长是不利的。,2、可以解除或减弱分解代谢产物阻遏在微生物合成初级或次级代谢产物中，有些合成酶受到易利用碳源或氮源的阻遏，特别是葡萄糖，它能够阻抑多种酶或产物的合成，如青霉素、赤霉素等。这种阻遏作用不是葡萄糖的直接作用，而是由葡萄糖的分解代谢产物引起的。通过补料来限制基质的浓度，就可解除酶或其代谢产物合成受阻，提高产量。3、可以使发酵过程最佳化 利用FBC技术，可以使菌种保持在最大生产力的状态。,二、补料分批培养的补料方式和控制补料方式：连续流加、不连续流加、多周期流加。每次流加方式：快速流加、恒速流加、指数速率流加、变速流加。三、补料内容1、基础培养基2、碳源

21、 补糖（葡萄糖）3、氮源 补充有机氮源、通氨、尿素4、微量元素5、补水,四、流加补料的内容和原则原则：控制微生物的中间代谢，使之向着有利于产物积累的方向发展。为此，要根据微生物的生长代谢、生物合成规律，利用流加补料的措施给予生产菌适当的调节，让它能在生物合成阶段有足够而又不过多的营养物质供其维持正常代谢和合成产物的需要。,第九节 泡沫的影响及其控制一泡沫的危害泡沫的形成：培养基中有蛋白质类表面活性剂存在，在通气条件下，培养液中就形成了泡沫。泡沫形成的危害：1）减小发酵罐的装料系数、氧传递系数；2）泡沫过多时形成大量逃液；3）增加发酵液污染机会；4）严重时使搅拌无法进行，菌体呼吸受到阻碍，导致代

22、谢异常或菌体自溶。二、消除泡沫的方法1、机械消沫,分为罐内消沫、罐外消沫。前者靠罐内消沫桨转动打碎泡沫；后者将泡沫引出罐外，通过喷嘴的加速作用或离心力来消除泡沫。2、消沫剂消沫是利用外界加入消沫剂，使泡沫破裂的方法。消沫剂作用：降低泡沫液膜的机械强度，或者是降低液膜的表面黏度，或兼而有之，达到破裂泡沫的目的。常用消沫剂：天然油脂类、化学消沫剂天然油脂不仅可作为消沫剂，还可作为碳源使用，但使用效果不如化学合成的消沫剂。,化学合成消沫剂，主要指聚醚类，如聚氧丙烯甘油（GP型）、聚氧乙烯氧丙烯甘油（GPE型）。消沫效果非常好，相当于油脂的几十倍。,第十节 发酵终点的判断一、微生物发酵终点的判断既要追

23、求高生产力，又要顾及产品的成本，必须把两者结合起来，既要有高产量，又要是低成本。二、确定合理放罐时间考虑因素1、经济因素发酵产物的生产能力是实际发酵时间和发酵准备时间的综合反应。实际发酵时间，以最低的成本来获得最大生产能力的时间为最适发酵时间。,如果发酵时生产速率很高，就要尽可能延长抗生素的分泌期，提高抗生素单位产量。但是在生产速率较小或停止的情况下，如果继续延长时间，使平均生产能力下降，而动力消耗、管理费用支出、设备消耗等费用仍在增加，因而产物成本增加，就应该即时放罐。2、产品质量因素发酵时间长短对后提取工序与产品质量有很大关系。如果发酵时间太短，有过多的尚未代谢的营养物质残留在发酵液中。给

24、提取带来不利影响。但是如果发酵时间太长，,菌体会自溶，释放菌体蛋白或酶，发酵液变粘稠，增加过滤工序的难度，使不稳定产物降解。所有这些影响，都会使抗生素产量下降，产物杂质含量增加。3、特殊因素对老品种来说，放罐时间都已掌握，在正常情况下可根据作业计划，按时放罐。但在异常情况下，如染菌、代谢异常，就应根据不同情况及时处理。发酵终点的判断，要综合这些因素来确定。,第九章 抗生素产生菌的代谢调节控制,第一节 初级代谢产物生物合成的调节微生物在长期的进化过程中，经过自然选择，建立了有利于自身存在的代谢调节系统。因为微生物在自然界生存，经常会发生这样或那样的变异，当变异有利于微生物存在时，就有可能保留下来

25、；而当变异不利于微生物自身存在时，就会在自然选择过程中被淘汰。这样合理的变异经过长期的积累，就形成了代谢调节系统。,菌体代谢类型：分解代谢和合成代谢 初级代谢和次级代谢初级代谢产物：指微生物生长和繁殖所必须的物质，如蛋白质、核酸等。次级代谢产物：指由微生物产生的与微生物的生长、繁殖无关的一类物质。抗生素是微生物所产生的最大的一类次级代谢产物。微生物的代谢是由各种酶所催化的，因此，代谢的调节，实质上，主要是通过控制酶的生成和功能而实现的。一、酶生成的调节,主要有诱导生成、终产物阻抑、分解代谢物阻抑三种形式。1、诱导生成酶生成的方式：1）诱导酶：只有在诱导剂存在时才生成，环境中没有诱导剂时，酶合成

26、就停止；2）组成酶，经常存在于细胞内，不随诱导剂存在与否而转移。如乳糖操纵子模型，乳糖作为诱导物，诱导-半乳糖苷酶的生成。由于酶诱导生成的调节，使得微生物仅在需要时才合成某些酶，不需要时便不能生成。以避免了能量和代谢物的浪费。,2、酶生成的阻抑酶生成的阻抑：由于某种化合物的存在而阻止了酶的合成。分为终产物阻抑与分解代谢物阻抑1）终产物阻抑：起阻抑作用的化合物是某一合成途径的终产物，则称为终产物阻抑。由于微生物具有终产物阻抑的调节系统，使得微生物在已合成足够它需要的物质时，或有外源加入该物质时，就停止生成其有关合成的酶类；而当该物质缺乏时，又开始生成这些酶。这样就节约了大量的能量和原料。,2）分

27、解代谢物阻抑：起阻抑作用的化合物是分解代谢途径中的产物，则称为分解代谢物阻抑也被称为葡萄糖效应，指E.coli对各种混合碳源的利用时,发现葡萄糖能抑制其他糖的利用,只有当葡萄糖被利用完以后,才能利用第二种糖,因此出现二次生长现象。葡萄糖效应其实就是一种碳分解代谢调节作用。碳分解代谢调节是指被迅速利用的碳源或其分解代谢产物，对其他代谢中酶的调节作用。其他能被快速利用的碳源、氮源、磷源也具有类似效应。,3、酶生成调节机制操纵子学说二、酶功能的调节酶一旦生成后，就比较稳定地存在，继续起作用，消耗能量，积累过多的中间产物。为了防止这种不必要的消耗和积累，微生物有另一套调节系统，既酶活性调节(细调)，使

28、得不需要的酶立即停止活动，当需要时又可立即恢复。这种调节酶功能的作用称为反馈抑制。1、反馈抑制,几种类型：p.981、单一终产物的反馈抑制2、顺序反馈抑制3、合作反馈抑制4、累加反馈抑制5、同功酶二、反馈抑制的机制调节酶学说:反馈抑制的酶有两个结合位点，一个是和酶的底物结合，称为活性中心，另一个和终产物结合，称为调节中心。当终产物和调节中心结合后，引起酶的结构改变，使酶的活性中心结构也随之改变，不能和底物结合，而失去催化活性。,第二节 抗生素产生菌的代谢调节一、次级代谢物生物合成的特征1、大多数抗生素生物合成有一个明显的特征:抗生素合成是在产生菌的生长结束之后才出现。因此，可将抗生素产生菌的生

29、命活动过程分为两个时期，即营养生长期和次级代谢产物形成期。抗生素的合成过程一般是在培养液中缺乏某种营养物质，菌体的生长受到限制时被启动。2、抗生素产生菌的生长期向生产期转变时，在形态学和生理学上会发生一些变化。如一些产芽孢细菌此时会形成芽孢，真菌和放线菌会形成孢子等。菌体的生长速率、分支,状态和球菌的大小等都是合成抗生素的重要因素。因此，有人把抗生素的合成认为是细胞分化的伴随现象。3、一种微生物的不同菌株能够产生多种在分子结构上完全不同的次级代谢产物。如灰色链霉菌不仅产生链霉素，而且还可以产生柱晶白霉素、吲哚霉素、灰霉素和灰绿霉素等。同样，不同种类的微生物也能够产生同一种次级代谢产物。如能够产

30、生青霉素的微生物包括有点青霉、产黄青霉、土曲霉等的一些真菌和某些链霉菌。,4、一种微生物的次级代谢产物大多是一组具有相似结构的化合物。这使工业上对抗生素的分离纯化过程比初级代谢物的分离纯化要困难得多。导致产生多组分产物的主要原因是由于参与抗生素生物合成的酶对底物的特异性不强。这种特异性既可受到内部因素的控制，也可受到外部环境的影响。因此，在工业生产上可通过菌种选育和发酵控制来得到更多的目的产物。5、抗生素的生物合成过程是一种由多基因控制的代谢过程。这些基因不仅位于微生物的染色体中，也可位于染色体外的遗传物质中，且在,某些抗生素生物合成中起主导作用。另外，染色体外遗传物质可由于外界环境的影响而从

31、细胞中丢失，从而造成抗生素生产的不稳定性。二、初级代谢与次级代谢的关系初级代谢与次级代谢的关系可以从生化代谢与遗传代谢两个方面来分析。1、生化代谢1）首先，从菌体生化代谢来看，抗生素的生物合成是由几种初级代谢产物形成的，即初级代谢途径提供合成抗生素的前体物质。,2）有些营养物质代谢的中间体既可以用来合成初级代谢产物，又可以生成次级代谢产物，把这类物质称做分叉中间体。3）次级代谢途径中所涉及的酶系，既有与初级代谢相同的酶系，又有特异性的酶系。2、遗传代谢初级代谢和次级代谢都是受到核内DNA控制，并且次级代谢还受到核外遗传物质的控制。,葡萄糖,3-脱氧-7-磷酸-阿拉伯庚酮糖,莽草酸,利福霉素,分

32、支酸,预苯酸,酪氨酸,由芳香中间体合成的抗生素和其它次级代谢物,对氨基苯甲酸,芳香多烯大环内酯抗生素,苯丙氨酸,肽类抗生素,诺卡菌素,邻氨基苯甲酸,色氨酸,放线菌素,L-氨基己二酸+L-半胱氨酸,-（氨基己二酰）-半胱氨酸+缬氨酸,-（氨基己二酰）-半胱氨酸-缬氨酸（ACV）,异青霉素N,青霉素G,三、抗生素产生菌的主要代谢调节作用1、磷酸盐对次级代谢物生物合成的调控磷酸盐对许多抗生素和其他一些微生物次级代谢产物具有明显的阻遏和抑制作用。这些微生物产物的生物合成只有在磷酸盐浓度适当时才能进行。有关磷酸盐对次级代谢物的合成影响机制可概括为如下一些原因：1）磷酸盐可促进初级代谢，而初级代谢的减弱会

33、解除对次级代谢的阻遏；2）磷酸盐会改变糖类分解代谢途径；,3）磷酸盐能限制抗生素途径诱导物的生成；4）磷酸盐能抑制抗生素前体的形成；5）磷酸盐抑制或阻遏抗生素合成所必须的磷酸酶；因此很显然，磷酸盐控制着与抗生素合成有关的途径，但具体机制还不很清楚。受无机磷酸盐干扰的抗生素链霉素：链霉素合成过程中至少包括三个脱磷酸步骤，这一过程对磷酸盐浓度非常敏感，该途径最后从双氢链霉素-6-磷酸脱去磷酸的酶被无机磷酸盐所抑制。四环素：四环素氧化酶,杀念菌素：p-氨基苯甲酸合成酶头孢菌素：ACV合成酶、异青霉素N合成酶庆大霉素、万古霉素、克拉维酸等2、碳源调控在许多抗生素的产生途径中，酶受到碳源的调控。如大量快

34、速利用碳源葡萄糖经常抑制产物的形成，而慢速利用碳源淀粉、乳糖等经常作为发酵生产次级代谢物的最好碳源。培养基中一般包含大量快速利用碳源和迟效碳源，在速效碳源被利用完后，迟效碳源才被利用来生产次级代谢物。,在诺卡菌中，去乙酰氧基头孢菌素C合成酶被葡萄糖-6-磷酸及果糖-1，6-二磷酸所抑制，从而抑制头孢菌素产生。甘油醛-3-磷酸能竞争性抑制抑制ACV合成酶。3、氮源调控许多抗生素的生物合成同样受到氮分解产物的影响。如，谷氨酸和苯丙氨酸能够阻遏参与放线菌素生物合成的犬尿氨酸甲酰胺酶II的形成；半胱氨酸和甲硫氨酸能够阻遏参与链霉素生物合成的甘露糖苷链霉素合成酶的形成；铵能阻遏参与-内酰胺抗生素生物合成

35、的三肽合成酶（ACV）和脱乙酰氧头孢菌素C合成酶的形成。,4、反馈调节支路产物的反馈抑制：已知微生物代谢中产生的一些分叉中间体，既可用来合成初级代谢产物，又可合成次级代谢物。在某些情况下，初级代谢的末端产物能反馈抑制共用途径中某些酶的活性，从而影响次级代谢产物的合成。（图p.106）终产物的反馈调节：许多次级代谢物产物能够抑制或阻遏它们自身的生物合成酶。,氯霉素终产物的调节是通过阻遏其生物合成过程的第一个酶，芳基胺合成酶的合成使代谢朝着芳香族氨基酸的合成途径进行。吲哚霉素终产物的调节位点是抑制其生物合成途径中的第一个酶，而嘌呤霉素终产物的调节位点是抑制其生物合成途径中的最后一个酶，O-甲基转移

36、酶活性。四环素、金霉素和土霉素抑制四环素合成途径中的最后第二个酶脱水四环素氧化酶的活性。,抗生素合成中的反馈调节,5、鸟苷四磷酸（ppGpp）与次级代谢Ochi提出应急反应参与次级代谢。有报道证明ppGpp在放线菌素和链霉素的生物合成中起调节作用。但总的来说ppGpp触发抗生素合成的观点还值得怀疑。,第三节 生长期和生产期的相互关系抗生素生产存在两个明显不同的阶段：快速生长的生长期 抗生素产生的生产期1、生长期特点：菌体快速生长，包括多种必需养料平衡的吸收和利用。在生长期结束时，一种主要营养物质已经消耗完，如P、N、S而阻止细胞繁殖，转而进入生产期2、生产期特点：新酶出现比例增多，抗生素开始合

37、成。,为什么大多数抗生素发酵分为两个时期？为什么抗生素合成多在生长末期才开始？对这些的问题，迄今仍不清楚。根据操纵子学说，有下列可能性：1）阻抑蛋白有两个位点，一个与操纵基因相结合，另一个和诱导物相结合。当与诱导物结合以后，阻抑蛋白就发生变构效应，再不能和操纵基因相结合失去原由作用，这样酶结构就得以解除抑制而开始合成。2)在生长期中，分解代谢产物对生产期的基因产生阻抑。当分解代谢物被利用后，就解除阻抑。如放线菌素D合成的关键酶吩口恶嗪酮合成酶受到葡萄糖分解代谢物的阻抑，在葡萄糖耗尽时，才开始合成，从而开始放线菌素D的合成。,3）初级代谢的终点产物对次级代谢产生反馈阻抑作用，当这种终点产物耗尽时

38、，生产期的结构基因的受阻抑状态才能得到改变而开始转录、翻译，产生抗生素的合成酶。4）抗生素合成途径受高能化合物的阻抑作用。当ATP的量减少后，阻抑作用也被解除。5）在生产期，RNA聚合酶只能启动生长期基因的转录作用，不能附着在操纵生产期的启动基因的位置上。,放线菌产生抗生素的过程最重要的是由内源代谢物，如A因子（一类丁酸内酯类物质）的诱导作用。A因子既可诱导灰色链霉菌的形态分化，又诱导其化学分化，并且促进气生菌丝、分生孢子、链霉素合成酶以及链霉素的形成。在灰色链霉菌中，A因子能在转录水平上诱导至少10种蛋白质，其中之一就是链霉素-6-磷酸转移酶，参与链霉素的合成。当A因子结合到它的受体上，受体蛋白明显地从DNA结合位点移开，从而导致气生菌丝、分生孢子及链霉素合成酶的形成。,