微生物的纯培养与显微技术.ppt

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1、微生物学洪 龙 62756091生物技术楼 202hongl,微生物学的研究内容,参考书,（1）微生物学教程（第二版），周德庆，高等教育出版社，2002（2）微生物生物学，杨苏声、周俊初，科学出版社，2004（3）“Brocks Biology of Microorganism 11TH”，Michael T.Madigan，John M.Martinko，Jack Parker，Prentice Hall，2006（4）“Microbiology”，Lansing M.Prescott,Donald Klein,John Harley，McGraw-Hill Higher Education

2、，2005,讲授内容,第二章：微生物的纯培养和显微技术第三章：微生物细胞的结构与功能第四章：微生物的营养第七章：病毒(噬菌体)第十三章：微生物物种的多样性(节选)课件下载：北大教学网,微生物学 沈萍主编 2006年高教出版社,第二章 微生物的纯培养与显微技术,第二章 微生物的纯培养与显微技术,一、显微技术 各种显微镜、决定显微镜的分辨率的因素、细菌的染色方法,二、纯培养技术 纯培养技术 纯培养技术的局限,微生物学发展与微生物学技术的关系：列文虎克、巴斯德、科赫,微生物学的基础实验技术,第二章 微生物的纯培养与显微技术,显微技术,纯种分离与培养技术,无菌技术,染色技术,看,做,第二章 微生物的纯

3、培养与显微技术,微生物基础实验课的教学思路,第三个模块：四大类微生物的分离；涉及培养四大类微生物所需培养基的配制，灭菌、纯种分离、保藏等，巩固第一个模块的知识探索性实验，注重广度；第四个模块：未名湖水质检测；大肠杆菌的形态、生理生化、鉴定以及实际应用(国标)探索性实验，注重深度；,分为4个模块：第一个模块：四大类微生物的形态学特征，基础知识验证性实验；要求学生能认识四大类微生物；第二个模块：噬菌体效价测定验证性实验；病毒特性；,一、显微技术,第二章 微生物的纯培养与显微技术,（一）,微生物生长快速与其大小相关。,第二章 微生物的纯培养与显微技术,生长速度快与其大小相关,比表面积大，有利于营养吸

4、收、物质交换,大肠杆菌代时是20分钟，48小时可产生2.2*1043个细胞，重量相当于地球的4000倍。,我家里的几位女眷想要看醋里的线虫，可是看了以后，厌恶地发誓说再也不用醋了。要是我告诉她们在口腔里牙垢上生活的动物比全国的人口还多，她们将会怎样反应呢？Leeuwenhoek,微生物的大小,第二章 微生物的纯培养与显微技术,（一）,细胞型m；非细胞型nm,设计能自主生活的(微)生物？,科学问题：生命的最小极限？,第二章 微生物的纯培养与显微技术,（一）,最少的基因数,192，基因敲除与互补参考文献Kobayashi K.et al,（2003）Essential Bacillus subti

5、lis genes,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,100:4678-4683,理论上最小的可独立生活的生命体应140nm,必需基因的类别,第二章 微生物的纯培养与显微技术,（一）,物质结构基础 水是生命活动重要的、不可或缺的场所，“勇气”号和“机遇”号的一个重要使命,(1)DNA复制,(2)DNA复制的修复系统,(3)RNA转录,(4)蛋白质翻译,(5)分子伴侣,(6)能量代谢,(7)辅酶,(8)细胞膜系统,已知最小的独立生活的生命体,第二章 微生物的纯培养与显微技术,（一）,最大的细菌,第二章 微生物的纯培养与显微技术,（一）,费氏刺骨鱼菌80*600m,纳米比亚硫珍珠菌75

6、0m,决定显微镜观察效果的因素,第二章 微生物的纯培养与显微技术,（一）,分辨率：最小可分辨距离,反差：样品区别于背景的程度,显微镜的种类,第二章 微生物的纯培养与显微技术,（一）,电子显微镜 透射电子显微镜 扫描电子显微镜 扫描隧道显微镜,光学显微镜 普通光学显微镜 暗视野显微镜 相差显微镜 荧光显微镜,分辨率是决定观察效果最重要的指标,第二章 微生物的纯培养与显微技术,（一）,0.5 l 分辨率=n sin,n玻片与物镜间介质的折射率空气(n=1.0)；水(n=1.33)；香柏油(n=1.52)；玻璃(n=1.54),光学显微镜原理,第二章 微生物的纯培养与显微技术,（一）,:物镜镜口角的

7、一半n sin：数值孔径（numerical aperture）,其数值越大，显微镜分辨率越好。,光学显微镜原理,第二章 微生物的纯培养与显微技术,（一）,光线在穿过折射率不同的介质时发生折射,观察细菌应使用油镜,第二章 微生物的纯培养与显微技术,（一）,浸没油与玻璃的折射率相近,很多原来由于在透镜及载片表面的反射和折射而损失的光线可以进入物镜，使照明亮度提高，改善观察效果。,第二章 微生物的纯培养与显微技术,（一）,放大倍数越高，工作距离越短,光学显微镜物镜的特性,第二章 微生物的纯培养与显微技术,（一）,在对细菌、放线菌等进行光学显微镜观察时，油镜最常使用，也最为重要。,提高数值孔径的途径

8、,第二章 微生物的纯培养与显微技术,（一）,增大透镜直径，以增加镜口角；不实用增加折射率；采用短波长的电磁波,暗视野显微镜（dark-field microscopy）,第二章 微生物的纯培养与显微技术,（一）,样品与背景之间的反差增大,第二章 微生物的纯培养与显微技术,（一）,样品与背景之间的信噪比增大,暗视野显微镜（dark-field microscopy）,暗视野显微镜（dark-field microscopy）,第二章 微生物的纯培养与显微技术,（一）,小至 4200nm的微粒子，分辨率可比普通显微镜高50倍,生物体的明细外貌及其运动，但是看不见内部细微结构。,相差显微镜(phas

9、e-contrast microscopy),第二章 微生物的纯培养与显微技术,（一）,荷兰人Frits Zernike(F泽尔尼克)1953年，诺贝尔物理学奖,相差显微镜,第二章 微生物的纯培养与显微技术,（一）,原理：细胞各部分的折射率及厚度差异 光程差 相位差 相板 振幅差(明暗差),细胞内部结构,荧光显微镜(Fluorescent microscopy),第二章 微生物的纯培养与显微技术,（一）,荧光显微镜,第二章 微生物的纯培养与显微技术,（一）,荧光显微技术在免疫学、环境微生物学、分子生物学中应用普遍。,各种光学显微镜的使用范围,第二章 微生物的纯培养与显微技术,（一）,暗视野显微

10、镜：未经染色的活细胞，背景暗，标本亮，样品的轮廓、运动,普通光学显微镜：经染色的细胞，背景亮，标本暗,荧光显微镜：观察特异的细胞,相差显微镜：细胞内的细微结构,电子显微镜,第二章 微生物的纯培养与显微技术,（一）,光学显微镜(=550 nm)的分辨率为 220 nm。电子的波长比可见光小1000倍。,透射电镜,第二章 微生物的纯培养与显微技术,（一）,使用电子，电磁圈和荧光屏,第二章 微生物的纯培养与显微技术,（一）,分辨率：0.2nm(理论值)透射电镜：细胞内的超微结构,超薄切片镜筒高度真空,透射电镜,扫描电镜,第二章 微生物的纯培养与显微技术,（一）,经磁透镜汇集的电子探针在样品表面扫描，

11、激发出样品释放出二次电子，根据二次电子的多少可获得样品表面的立体形貌。分辨率为10nm。,样品的表面,扫描电镜,第二章 微生物的纯培养与显微技术,（一）,样品的表面,扫描隧道显微镜(STM),第二章 微生物的纯培养与显微技术,（一）,横向分辨率可以达到0.1-0.2 nm，纵向分辨率可以达到0.001 nm，是目前分辨率最高的显微镜。,样品的表面有一定的导电性；,样品的表面；,样品不受破坏。,原子力显微镜,第二章 微生物的纯培养与显微技术,（一）,利用激光装置来检测探针和样品之间的相互作用；,适合生物材料。,光学显微镜观察样品的制备和染色,第二章 微生物的纯培养与显微技术,（一）,直接观察活体

12、：可以避免染色固定时对微生物结构的破坏，主要用来观察微生物的大致形态和运动情况 压滴法 悬滴法 压(埋)片法,压滴法(水封片法)示意图,第二章 微生物的纯培养与显微技术,（一）,悬滴法示意图,第二章 微生物的纯培养与显微技术,（一）,埋片法示意图,第二章 微生物的纯培养与显微技术,（一）,染色观察,第二章 微生物的纯培养与显微技术,（一）,微生物无色透明，与背景折光率相差无几，染色可增强反差,染色前需固定 显微镜下观察到细菌的大小受固定方法影响,固定的目的,第二章 微生物的纯培养与显微技术,（一）,杀死细菌并使菌体粘附在玻片上,增加染料对细菌的亲和力,固定的方法,第二章 微生物的纯培养与显微技

13、术,（一）,使蛋白质变性,加热,化学试剂：乙醇、醋酸、甲醛、戊二醛,细菌染色法,第二章 微生物的纯培养与显微技术,（一）,活菌：美兰等 染料低毒性；能区分死活细胞,正染色：菌体着色，背景无色；负染色则反之。,死菌：正染色 简单染色：一种染料 鉴别染色：两种染料不同颜色的染料，如革兰氏染色、芽孢染色、抗酸性染色等 负染色 荚膜染色,二、微生物的纯培养技术,第二章 微生物的纯培养与显微技术,（二）,1、纯种分离技术,微生物的基本特点,第二章 微生物的纯培养与显微技术,（二）,小,培养技术在微生物学中具有重要意义！,在绝大多数情况下都是利用微生物的群体来研究其属性；,微生物的物种(菌株)一般也是以群

14、体的形式进行繁衍、保存；,第二章 微生物的纯培养与显微技术,（二）,在研究中使用微生物培养群体 培养物：在一定的条件下培养、繁殖得到的微生物群体 混合培养物：含有多种微生物的培养物；纯培养物：只有一种微生物的培养物；纯培养技术是进行微生物学研究的基础！,第二章 微生物的纯培养与显微技术,（二）,高密度培养,又称高密度发酵，一般要求大肠杆菌培养液浓度达到50g/L干重，应用于大规模制备重组蛋白。外源基因表达产量与细胞浓度正相关。,柯赫法则不适合专性寄生的病原菌,第二章 微生物的纯培养与显微技术,（二）,纯培养的局限二元培养物、不可培养与混合培养,二元培养物：培养物中只含有两种微生物，并有意识地保

15、持两者之间的特定关系。病毒：因无法获得绝对意义上的纯培养，以二元培养物来作为纯培养的替代。,第二章 微生物的纯培养与显微技术,（二）,不可培养与混合培养,宏基因组(Metagenome)是特定小生境中全部微小生物遗传物质的总和通过基因工程获得新的功能基因。,第二章 微生物的纯培养与显微技术,（二）,将未培养的微生物转变成可培养的微生物,用低浓度的培养基来进行分离培养,添加微生物生长所必需的营养成分,第二章 微生物的纯培养与显微技术,（二）,混合发酵在工业生产中的广泛应用,第二章 微生物的纯培养与显微技术,（二）,混合发酵的优势,(1)充分利用培养基、设备、人员和时间；,(2)混菌发酵能够获得一

16、些独特的产品，而纯种发酵很难做到。,微生物的纯种分离技术,第二章 微生物的纯培养与显微技术,（二）,从混杂的群体中分离特定的某一种微生物，是研究和利用微生物的第一步。,无菌技术用于分离、培养微生物的器具事先不含任何微生物；在转接、培养微生物时防止其它微生物的污染,微生物培养的常用器具及其灭菌,第二章 微生物的纯培养与显微技术,（二）,常用的器具：试管、瓶子、培养皿等,琼脂和Petri dish,第二章 微生物的纯培养与显微技术,（二）,1887年，R J Petri 发明,灭菌的方法,第二章 微生物的纯培养与显微技术,（二）,物理方法化学方法最常用的是高压蒸汽灭菌法,超净台及接种操作,第二章

17、微生物的纯培养与显微技术,（二）,第二章 微生物的纯培养与显微技术,（二）,培养基,第二章 微生物的纯培养与显微技术,（二）,培养基：由人工配制，适合微生物生长繁殖或产生代谢产物的营养基质(食物)按物理状态(固、液)分为：固体、液体、半固体培养基,第二章 微生物的纯培养与显微技术,（二）,1,2,3,1：固体培养基；2：半固体培养基；3：液体培养基。凝固剂的有无及含量,培养基的种类及用途,第二章 微生物的纯培养与显微技术,（二）,固体培养基：分离，琼脂含量1.6-2%半固体培养基：运动性，琼脂含量0.5%液体培养基：生长快，不含琼脂,第二章 微生物的纯培养与显微技术,（二）,菌落与菌苔,菌落(

18、colony)：单个(或聚集在一起的一团)微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖到一定程度可以形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞生长群体,菌苔(lawn)：众多菌落连成一片,菌落与菌苔,第二章 微生物的纯培养与显微技术,（二）,菌落的一些特征,第二章 微生物的纯培养与显微技术,（二）,群体特征与个体特征,第二章 微生物的纯培养与显微技术,（二）,不同微生物在特定培养基上生长形成的菌落或菌苔一般都具有稳定的特征（形状、颜色等），可以成为对该微生物进行分类、鉴定的重要依据,思考题：为什么要求在特定的培养基上观察菌落的特征？,菌落特征的重要性,使用固体培养基进行纯种分离,第二章 微生物的纯

19、培养与显微技术,（二）,划线分离法,稀释分离法,(1)稀释分离法,第二章 微生物的纯培养与显微技术,（二）,同一个稀释度的大多数(95%)的试管没有细菌生长，则有细菌生长的平行管为纯培养,(2)划线分离法,第二章 微生物的纯培养与显微技术,（二）,操作较稀释法简单易行分离到非优势微生物的几率较高,各种划线方法,第二章 微生物的纯培养与显微技术,（二）,第二章 微生物的纯培养与显微技术,（二）,单细胞(孢子)分离,第二章 微生物的纯培养与显微技术,（二）,一般采用显微操作仪，在显微镜下进行；操作难度与细胞或个体的大小成反比,确保为纯培养物,微生物的培养条件,第二章 微生物的纯培养与显微技术,（二

20、）,温度好氧或厌氧培养基的成分生长速度,厌氧微生物,第二章 微生物的纯培养与显微技术,（二）,与人类健康密切相关,最古老的生命,厌氧条件的获得,第二章 微生物的纯培养与显微技术,（二）,培养基中添加还原性物质,通过物理、化学方法驱除环境中的氧气,厌氧微生物的培养,第二章 微生物的纯培养与显微技术,（二）,耐氧微生物的培养,第二章 微生物的纯培养与显微技术,（二）,专性厌氧微生物的培养,第二章 微生物的纯培养与显微技术,（1）光学显微镜的分辨率取决于其透镜系统的数值孔径以及所使用光波的波长。常见明视野最大的分辨率为0.2 m（2）明视野、暗视野、相差及荧光显微镜是最常见的光学显微镜类型。（3）电

21、子显微镜使用的不是可见光，而是波长很短的电子束，因此可以获得较高的分辨率（0.2nm）。常见的电子显微镜的种类有透射电镜、扫描电镜。,本章小结（1）,第二章 微生物的纯培养与显微技术,本章小结（2）,（4）有时侯可以直接对微生物进行活体观察，活体观察制片的方法有压滴法、悬滴法以及菌丝埋片法。但大多数微生物是无色的，在明视野显微镜中难以看清，因此样品必须经过染色后才能进行观察。（5）染色前固定的目的有两个：一是杀死微生物；二是增强染料对菌体的亲和力。固定的原理是使蛋白质变性。（6）纯培养技术在微生物学的研究中具有重要意义，但随着微生物学的发展，纯培养技术又在一定程度上限制了微生物学的研究。,第二章 微生物的纯培养与显微技术,本章小结（3）,（7）对微生物进行纯种分离的方法主要有稀释分离、划线分离和单孢子分离，划线分离由于简单易性而最为常用。（8）厌氧培养技术是微生物特有的实验技术，对微生物学的研究具有不可或缺的作用。（9）微生物学四大经典研究技术：显微技术、无菌技术、培养技术和染色技术。,