微生物的实验室培养人教.ppt

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1、专题1 传统发酵技术的应用,课题 1 果酒的和果醋的制作课题 2 腐乳的制作课题 3 制作泡菜并检测亚硝酸盐含量,专题2 微生物的培养与应用,课题1 微生物的实验室培养,需要为微生物提供合适的营养和环境条件,需要无菌操作,课题目标：,1.了解有关微生物种类、培养方法和培养基的基础知识。2进行无菌技术的操作。3进行微生物的培养。,生物技术实践：微生物培养与利用：利用微生物进行发酵生产特定的产物。生物学研究中的科学思想和一般方法：设计可行的实验方案和实验装置 对简单的实验方案做出恰当的评价和修订,考试说明,从近年情况看，这部分知识在各区的模拟考查中多次涉及！尤其是关于灭菌方法和接种方法的选择是高频

2、考点,微生物是一切肉眼看不见（但有些微生物是可以看见的，像属于真菌的蘑菇、灵芝等。）或看不清的微小生物，个体微小（一般0.1mm），结构简单（有单细胞的，简单多细胞的，非细胞的），通常要用光学显微镜和电子显微镜才能看清楚的生物，统称为微生物。,微生物的概念：,一.微生物基础知识,.微生物的类群,微生物,原核类:,真核类,非细胞类：,蓝藻、细菌、放线菌、支原体、衣原体,个体微小、结构简单,酵母菌、霉菌、食用菌,真菌：,原生生物：,衣藻、草履虫、变形虫等,病毒、类病毒、朊病毒,微生物的共同特点：,一.微生物基础知识,知识梳理：细菌,大肠杆菌,淋病球菌,肉毒梭菌,霍乱弧菌,（单细胞原核生物）,1.细

3、菌的形态,（球、杆、弧、旋）,知识梳理：细菌,芽孢：某些细菌在其生长发育后期，在细胞内形成一个圆形或椭圆形、厚壁、含水量极低、抗逆性极强的休眠体，称为芽孢(内生孢子）。能够使细菌度过不良的环境。每一个细菌形成一个芽孢，所以其没有繁殖功能。,2.细菌的繁殖,芽孢和孢子：,二分裂,孢子：细菌、原生动物、真菌和植物等产生的一种有繁殖或休眠作用的生殖细胞。能直接发育成新个体。,知识梳理：细菌,2.细菌的结构,芽孢,3.菌落（高三考查较多）,（1）定义：是一个细胞繁殖而来的肉眼可见子细胞群体。P18,举例：有荚膜细菌：菌落光滑。S型 无荚膜细菌：菌落粗糙。R型,（2）特征：表现在菌落的大小、形状、光泽度

4、、颜色、硬度透明度等方面。,（3）功能：菌落特征是鉴别菌种的重要依据,知识梳理：细菌,几种菌落及其形态,几种菌落及其形态,(二)微生物培养基,1.培养基概念：人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。,2.培养基的成分：微生物的元素组成：C、H、O、N、P、S微生物生长需要的物质营养要素(一般含有碳源、氮源、无机盐和水等四类),(二)微生物培养基,2.培养基的成分：,（1）碳源,概念：能为微生物提供所需碳元素的营养 物质，需要量最大。种类：无机碳源 CO2、NaHCO3 有机碳源(有机物)糖类、脂肪酸等 有机物；(天然成分混合物)花生粉饼 石油等常用的碳源：糖类（尤其是

5、葡萄糖）,(二)微生物培养基,2.培养基的成分：,（1）碳源,功能：构成微生物的细胞质和一些代谢产物；异养微生物主要能源物质,思考：,大肠杆菌，硝化细菌，蓝细菌，乳酸菌分别选用哪种碳源？,糖类，二氧化碳，二氧化碳，糖类,(二)微生物培养基,2.培养基的成分：,（2）氮源,概念：能为微生物提供所需氮元素的营养物质种类：无机氮源：N2、NH3、铵盐、硝酸盐；有机氮源：牛肉膏、蛋白胨、氨基酸。,功能：合成蛋白质、核酸以及含氮的代谢产物,（“含C、H、O、N”的有机物既可以作为碳源，又可以作为氮源，如氨基酸等）,培养根瘤菌、大肠杆菌、硝化细菌时分别需要哪一类氮源？,思考：,N2，铵盐或硝酸盐、牛肉膏或

6、蛋白胨等，NH3,(二)微生物培养基,2.培养基的成分：,注意：关于能源物质自养型：光能自养：太阳光 化能自养：无机物（氧化放能）【例】硝化细菌 氨的氧化异养型：有机物（氧化分解放能）,（3）水（4）无机盐,思考若乳酸菌、根瘤菌、固氮蓝藻、硝化细菌混合在一起，我们配制什么样的培养基可以将三种微生物分离？,光能,糖类等含碳有机物,N2,有机物,CO2,铵盐、硝酸盐、有机氮,糖类等含碳有机物,有机物,氨,氨,CO2,N2,(二)微生物培养基,3.满足微生物生长的条件：,培养基除要提供上述几种主要营养物质外，还满足微生物生长的 pH、特殊营养物质 和氧气 等要求。,pH：真菌 5.06.0 细菌 6

7、.57.5 放线菌 7.58.5,(二)微生物培养基,3.满足微生物生长的条件：,特殊营养物质 概念：某些微生物正常生长代谢过程中必须从培养基中吸收的微量有机小分子；添加原因：微生物自身缺乏合成这些物质的酶或合成能力有限种类：各种维生素、氨基酸、碱基、核苷酸等例如：培养乳酸菌时需要添加维生素,生长因子,(二)微生物培养基,4.培养基的配制原则：,（1）目的明确选材料（代谢特征、用途）,（2）营养协调（注意营养物质的浓度和比例）,（3）pH适宜,(二)微生物培养基,（1）按物理性质划分：,5.培养基的种类：,（固体、半固体培养基需添加凝固剂，如琼脂；两者的差别是添加量的多、少）,（用于工业生产）

8、,（用于观察微生物的运动、鉴定菌种）,（用于微生物的分离、计数）,微生物在其表面生长可形成菌落,(二)微生物培养基,5.培养基的种类：,（2）按化学成分划分：合成培养基 天然培养基,用化学成分已知的化合物配制,含化学成分不明的天然物质，如酵母膏、牛肉膏,前者常用于实验室中对微生物的分类、鉴别；后者常用于大规模工业生产。,(二)微生物培养基,5.培养基的种类：,加入某化学物质，以抑制不需要的微生物的生长，促进所需要微生物的生长。,加入某种指示剂或化学药品配制而成的，用以鉴定不同种类的微生物。特定菌种显色，其他菌种不受抑制、但不显色。,（3）按用途划分：,（作用：分离微生物、进行选择培养）,（作用

9、：鉴别微生物）,青霉素,选择培养基,在基因工程中，对导入重组质粒的大肠杆菌的筛选,伊红美蓝,鉴别培养基,A,A,B,B,C,C,大肠杆菌在伊红美蓝培养基上菌落呈现黑色,常见的选择培养基举例：（1）添加：青霉素：抑制细菌、放线菌保留（分离）真菌，如霉菌、酵母菌高浓度NaCl：抑制多种细菌，分离金黄色葡萄球菌,(二)微生物培养基,5.培养基的种类：,（3）按用途划分：,常见的选择培养基举例：（2）缺少：培养基缺少有机碳源分离自养型微生物（利用CO2）培养基缺少氮源分离固氮微生物（利用N2）,(二)微生物培养基,5.培养基的种类：,（3）按用途划分：,培养基的种类,不加凝固剂,加凝固剂，如琼脂,工业

10、生产,观察微生物的运动、分类鉴定,微生物分离、鉴定、活菌计数、保藏菌种,含化学成分不明确的天然物质,工业生产,培养基成分明确,分类、鉴定,在培养基中加入某种化学物质,以抑制不需要的微生物的生长,促进所需要的微生物的生长,培养、分离出特定微生物,在培养基中加入某种指示剂或化学药品,用以鉴别不同种类的微生物,鉴别不同种类微生物,选择培养基,液体培养基,半固体培养基,固体培养基,P84,练习,1.不能作为异养微生物碳源的是（）A牛肉膏B含碳有机物C石油D含碳无机物,D,2.自养型微生物与异养型微生物的培养基的主要差别是（）A碳源B氮源C无机盐D生长因子,A,解析：自养型微生物与异养型微生物的主要差别

11、在于自养型微生物可以利用无机碳，异养型微生物只能以有机碳作为碳源所以两种培养基的主要差别在于碳源,3.下列关于生长因子的说法中，不正确的一项是（）A是微生物生长不可缺少的微量有机物B是微生物生长不可缺少的微量矿质元素C主要包括维生素、氨基酸和碱基等D一般是酶和核酸的组成成分,B,4.通过选择培养基可以从混杂的微生物群体中分离出所需的微生物。在碳源为纤维素的培养基上，大部分微生物无法生长；在培养基中加入青霉素，可以抑制细菌和放线菌。利用上述方法能从混杂的微生物群体中分别分离出（）大肠杆菌霉菌放线菌纤维素分解菌A.B.C.D.,解析：选A。本题考查了微生物分离知识。纤维素分解菌可以利用纤维素，大部

12、分微生物却不能；培养基中加入青霉素可以抑制细菌和放线菌，但霉菌能够生长。,（三）无菌技术,获得纯净培养物的关键(目的）是 防止外来杂菌的入侵。,1.无菌技术的概念,无菌技术泛指在培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染的方法。,（三）无菌技术,2.无菌技术包括：（1）对实验操作空间、操作者的衣着和手进行 清洁和消毒；（2）将培养器皿、接种用具和培养基等器具进行 灭菌；（3）为避免周围微生物污染，实验操作应在 酒精灯火焰附近 旁进行；（4）避免已灭菌处理的材料用具与 周围物品 相接触。,思考无菌技术除了防止培养物被污染外，还具有什么目的？P15旁栏思考,有效避免操作者自身被微生物感染,思考：消毒和灭

13、菌的区别？哪一个更彻底？什么时候需要消毒，什么时候需要灭菌？,消毒是指使用较为温和的物理或化学方法仅杀死物体表面或内部的部分微生物营养体（不包括芽孢和孢子）。灭菌是指使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。,灭菌效果更彻底，用于各种金属、玻璃器具。,消毒用于各种实验操作空间、操作者的衣着和手。,（三）无菌技术,2.无菌技术包括：,消毒与灭菌的比较,3.消毒方法：,煮沸消毒法：,巴氏消毒法：,化学药剂消毒法:,紫外线消毒法：,煮沸消毒法：,在100煮沸56min可以杀死微生物细胞和一部分芽孢。,3.消毒方法：,巴氏消毒法：,对于一些不耐高温的液体，如牛奶，在70-75 煮30

14、min或在80 煮15min，可以杀死牛奶中的微生物。,化学药剂消毒法:,用70%酒精擦拭双手、用氯气消毒水源。,紫外线消毒法：,表面灭菌和空气灭菌等使用 紫外线 灭菌法，所用器械是 紫外灯。照射30min，可先喷洒石炭酸或煤酚皂溶液加强消毒效果。,（三）无菌技术,4.灭菌方法：,（1）灼烧灭菌法：用于金属用具（接种环、接种针）、试管口和瓶口的灭菌；,灼烧灭菌,微生物的接种工具(接种环、接种针)或其他金属用具直接在火焰的充分燃烧层灼烧,注意适用范围,(1)灼烧灭菌(2)干热灭菌(3)高压蒸汽灭菌,（三）无菌技术,4.灭菌方法：,（2）干热灭菌法：能耐高温的需要保持干燥的物品,如玻璃器皿、金属用

15、具的灭菌，所用设备是 干热灭菌箱；,160170，12小时,（三）无菌技术,4.灭菌方法：,（3）高压蒸汽灭菌法：用于培养基、无菌水等的灭菌，所用设备是 高压蒸汽灭菌锅。,高压灭菌锅,121，100kPa，15-30分钟,本实验用牛肉膏蛋白胨固体培养基进行大肠杆菌的纯化培养，可分为制备培养基和纯化大肠杆菌两个阶段。,二、实验操作,又称牛肉浸膏，是采用新鲜牛肉经过剔除脂肪、消化、过滤、浓缩而得到的一种棕黄色至棕褐色的膏状物。,牛肉膏,二、实验操作（一）制备牛肉膏蛋白胨固体培养基,1.计算：,2.称量：,3.溶化：加水定容，调pH,4.灭菌：,5.倒平板：（或搁置斜面）,包好再高压蒸汽灭菌（121

16、，100kPa，15-30分钟）。斜面培养基需先分装，加棉塞，再包好、灭菌。,培养基冷却到50，酒精灯火焰旁操作。,称量,调pH,培养基分装,1/5,加棉塞,2/3,包扎,灭菌,搁置斜面,斜面不超过试管总长的1/2,倒平板,夹,倒,灼,倒,答：可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。,2.为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？,答：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。,问题讨论,1.培养基灭菌后，需要冷却到50 左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？,3.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？,4.在倒平板的过程中，如果不小心将培养

17、基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？,答：平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。,答：空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。,关于制备牛肉膏蛋白胨固体培养基的叙述中，错误的是（）A.操作顺序为计算、称量、溶化、倒平板、灭菌B.牛肉膏溶化并与称量纸分离后，用玻棒取出称量纸C.待培养基冷却至50左右时，进行倒平板D.待平板冷却凝固约5min10min后，将平板倒过来放置,解析：选A。本题考查了牛肉膏蛋白胨固

18、体培养基的制备过程。其顺序为：计算称量溶化灭菌倒平板，故A项错误。,【提醒关于斜面培养的问题】配制斜面培养基中，试管要加塞棉塞的目的是保持通气并防止杂菌感染。试管培养基形成斜面的作用是增大接种面积。,（二）纯化大肠杆菌：,1.纯化培养技术：,自然环境中，微生物混在一起生长，要想纯培养，首先要将单个细胞与其他细胞分离开，进而培养成可见的群体（即菌落）。,2.常见接种方法：（高频考点）,平板划线法：主要用于纯化培养稀释涂布平板法：主要用于分离菌种并计数,（二）纯化大肠杆菌：,其他接种方法：斜面接种、穿刺接种这些技术的操作方法各不相同，但其核心都是：_,防止杂菌污染，保证培养物的纯度,（二）纯化大肠

19、杆菌：,2.常见接种方法：,(1)平板划线法：,通过接种环在固体培养基表面连续划线操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。在数次划线后培养，可分离到由一个细胞繁殖而来的菌落。此法主要用于纯化培养,接种环,.连续划线，.逐步稀释.,将接种环放在火焰上灼烧，直到接种环_,在_旁冷却接种环，并打开棉塞,将试管口通过火焰,.将已_的接种环伸入菌液中蘸取一环菌液,左手将皿盖打开一条缝隙，右手将沾有菌种的接种环迅速伸入平板内，划_条平行线，盖上皿盖。注意不要划破培养基。,.将试管通过火焰，并塞上棉塞,火焰,冷却,三至五,灼烧接种环，待其冷却后，从第一区域划线的_开始往第二区域内划线。重复以上操作，在

20、三、四、五区域内划线。注意不要将最后一区的划线与第一区相连。,末端,烧红,将平板_放入培养箱中培养。,倒置,平板划线,（二）纯化大肠杆菌：,2.常见接种方法：,(1)平板划线法：,接种过程中哪些步骤保证了无菌操作？对接种环、瓶(皿)口及时进行灼烧灭菌；迅速进行操作；将划线后的平板倒置。,思考,为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？,第一步灼烧：消灭接种环上的微生物避免污染培养物；每次划线前灼烧：为了杀死上一次划线结束后，接种环残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种

21、的数目逐渐减少，以便得到菌落。操作结束后灼烧：杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境及感染操作者。,思考,在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？,避免接种环温度太高，杀死菌种,在作第二次及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？,划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐渐减少，最终得到由单个细菌繁殖而来的菌落。,（二）纯化大肠杆菌：,2.常见接种方法：,(2)稀释涂布平板法：,将菌液进行一系列的梯度稀释后，分别涂布到固体培养基表面。稀释度足够高时，能培养出单个菌落。主要用于分离菌种并计数。,涂布器,

22、.梯度稀释，.分别涂布.,将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中,取少量稀释液滴加到培养基表面,待酒精燃尽后冷却810s,将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃灼烧,用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀,稀释涂布平板法,思考：,对涂布器、瓶(皿)口及时进行灼烧灭菌；吸管头不要接触任何物体；在火焰周围迅速操作。,接种过程中如何进行无菌操作？,三、结果分析与评价,思考：若将接种后的培养基和一个未接种的培养基都放在37 恒温箱中，培养一天，观察到如下结果，请分析可能的原因。,1.在培养时，培养皿是否需要倒置？,需要,三、结果分析与评价,未接种培养基的作用是对照，应该没有菌落生长，若

23、有菌落，说明培养基灭菌不彻底或被污染。,2.未接种的培养基表面有菌落生长，说明了什么？,三、结果分析与评价,3在培养基上观察到了不同形态的菌落，可能的原因是？,不同的菌落代表不同的微生物；产生原因可能是培养基或接种过程中有其它微生物污染。,4.培养12h和24h后观察到的实验结果相同吗？,菌落大小：变大；菌落分布位置：不变。,四、课题延伸：1菌种的临时保存：将菌种接种到试管的固体斜面培养基，放入4冰箱中保存。以后每36个月，要将菌种转移到新的培养基。,四、课题延伸：,2菌种的长期保存：3ml甘油瓶中装入1ml甘油后灭菌，再加入1ml菌液，混匀后放入-20冷冻箱保存。,微生物的实验室培养,总结,

24、【典例解析】,例:关于微生物营养物质的叙述中，正确的是()A.是碳源的物质不可能同时是氮源 B.凡碳源都提供能量 C.除水以外的无机物只提供无机盐 D.无机氮源也能提供能量,解析：不同的微生物，所需营养物质有较大差别，要针对微生物的具体情况分析。对于A、B选项，它的表达是不完整的。有的碳源只能是碳源，如二氧化碳；有的碳源可同时是氮源，如NH4HCO3；有的碳源同时是能源，如葡萄糖；有的碳源同时是氮源，也是能源，如蛋白胨。对于C选项，除水以外的无机物种类繁多，功能也多样。如二氧化碳，可作为自养型微生物的碳源；NaHCO3，可作为自养型微生物的碳源和无机盐；而NaCl则只能提供无机盐。对于D选项，

25、无机氮源提供能量的情况还是存在的，如NH3可为硝化细菌提供能量和氮源。,D,例2.下面对灭菌的理解不正确的是()A.防止杂菌污染B.消灭杂菌C.培养基和发酵设备都必须灭菌 D.灭菌必须在接种前,B,右表是某微生物培养基成分，请据此回答：（1）右表培养基可培养的微生物类型是。（2）若不慎将过量NaCl加入培养基中。如不想浪费此培养基，可再加入，用于培养，,自养型微生物,含碳有机物,金黄色葡萄球菌,（3）若除去成分，加入（CH2O），该培养基可用于培养。（4）表中营养成分共有 类。（5）不论何种培养基，在各种成分都溶化后分装前，要进行的是。（6）右表中各成分重量确定的原则是。（7）若右表培养基用于菌种鉴定，应该增加的成分。,固氮微生物,3,调整pH,依微生物的生长需要确定,琼脂（或凝固剂）,