微生物的实验室培养复习课件.ppt

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1、课题1 微生物的实验室培养,专题2 微生物的培养与应用,1.提供合适的营养和环境条件,2.防止其他微生物污染,2.基本成分：,碳源、氮源、水、无机盐,3.特殊营养：（有些微生物需要）,（牛肉膏、酵母膏、蛋白胨中含有）,4.pH、氧气、二氧化碳、渗透压的需求：,一、培养基,如:生长因子(即细菌生长必需，而自身不能合成的化合物,如维生素、某些氨基酸、碱基等),按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。,1.概念：,不同的微生物往往需要采用不同的培养基配方,无机化合物：CO2、NaHCO3 等。有机化合物：糖类、脂肪酸、花生粉饼、石油、牛肉膏、蛋白胨等,无机化合物：N2、NH3、

2、铵盐、硝酸盐。有机化合物：尿素、牛肉膏、蛋白胨、酵母膏等,自养微生物,异养微生物,注：含C、H、O、N的有机物是异养型微生物的碳源、氮源、能源，如牛肉膏,硝化细菌,牛肉膏、酵母膏、动物组织提取液等,备注：(1)不同种类的微生物，对碳源的需要差别较大。(2)微生物最常利用的碳源是糖类，尤其是葡萄糖；最常利用的氮源是铵盐、硝酸盐。(3)对异养微生物来说，含 C、H、O、N 的化合物既是碳源又是氮源和能量来源。(4)微生物之所以需要补充生长因子，往往是由于缺乏合成这些物质所需要的酶或合成能力有限。,培养基的种类,不加凝固剂,加凝固剂，如琼脂,工业生产，增加某某菌的浓度或产物,微生物分离、鉴定、活菌计

3、数、保藏菌种,含化学成分不明确的天然物质,工业生产,培养基成分明确,分类、鉴定,在培养基中加入某种化学物质,以抑制不需要的微生物的生长,促进所需要的微生物的生长,培养、分离出特定微生物,在培养基中加入某种指示剂或化学药品,用以鉴别不同种类的微生物,鉴别不同种类微生物,选择培养基,液体培养基,固体培养基,培养基的种类,不加凝固剂,加凝固剂，如琼脂,工业生产，有利于微生物的大量繁殖，从而增加某某菌的浓度或产物、显微直接计数法,微生物分离、鉴定、培养菌落，进行活菌计数、保藏菌种、动植物的组织,液体培养基,固体培养基,平板划线法，用于微生物的分离（简单）稀释涂布平板法，用于微生物的分离(复杂),活菌计

4、数,在固体培养基上的接种方法？,加入青霉素(是抗生素，杀细菌)的培养基:不加氮源的无氮培养基:不加含碳有机物的无碳培养基:,几种选择培养基举例：,分离酵母菌、霉菌等真菌,分离固氮菌,分离自养型微生物,唯一碳源为纤维素的培养基,分解纤维素的细菌,1.无菌范围：,实验操作空间消毒,操作者的手、衣着消毒,实验用具灭菌,实验操作过程,2.消毒与灭菌?,酒精灯旁操作,超净工作台,关键是防止外来杂菌的污染,二、无菌技术,耐高温需保持干燥的 物品，160170 12小时,接种环、接种针等 金属用具,7075、30min 80、15min,100、56min,较为温和理化方法，,杀死部分有害菌体,（不包括芽孢

5、、孢子）,强烈的理化方法，,杀死所有微生物,（包括芽孢、孢子）,煮沸消毒法,巴氏消毒法,化学药剂,紫外线,灼烧灭菌,干热灭菌,酒精、氯气、石炭酸等,高压蒸汽灭菌,培养基，100KPa、121、1530min,关键是防止外来杂菌的污染,2.消毒与灭菌：,二、无菌技术,四、大肠杆菌的纯化培养,分散成单个细胞,形成单个菌落,3.功能：,单个或少数菌体,2.特征：,大小、形状、光泽度、颜色、透明度等。,鉴定菌种的重要依据,固体培养基上,大量繁殖,子细胞群体(菌落),1.定义：,制备牛肉膏蛋白胨固体培养基,1.计算：,培养基用量,依配方计算各成分的用量,2.称量：,3.溶化：,牛肉膏黏稠，用称量纸称取,

6、牛肉膏、蛋白胨易吸潮，要快、加盖,牛肉膏、称量纸、少量水加热溶解,取纸,蛋白胨、NaCl,琼脂,补水定容,4.调pH、分装、封口：,5.灭菌：,6.倒平板：,培养基、培养皿,倒平板,约50,倒置：防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染,灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基,倒置,1.培养基灭菌后，需要冷却到50 左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？答：可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。2.为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？答：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。3.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？答：平板冷凝后，皿盖

7、上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。,思考讨论（课P17）,4.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？答：空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。,学生看课P18平板划线法的操作,在给学生看平板划线法的视频,制备牛肉膏蛋白胨固体培养基,纯化大肠杆菌：,接种方法:平板划线法：,菌种,划3个平板,1个不划线,1.接种：,接种环,防止划破培养基？,（重复实验）,（空白对照）,四、大肠杆菌的纯化

8、培养,平板划线时不能划破培养基，为什么？,一旦划破，会造成划线不均匀，难以达到分离单菌落的目的；二是存留在划破处的单个细胞无法形成规矩的菌落，菌落会沿着划破处生长，会形成一个条状的菌落。,问题讨论,1.为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？,是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物,杀死上次残留的菌种，保证使下一次划线时，菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。,及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。,操作的第一步灼烧接种环：,每次划线之前都要灼烧接

9、种环：,在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环：,灼烧接种环之后，要冷却后才能伸入菌液，以免温度太,高杀死菌种。,划线时最后一区域不要与第一区域相连。,问题讨论,问题讨论,2.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？,3.在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？,答：以免接种环温度太高，杀死菌种。,答：划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。,6支试管，分别加入9ml无菌水,101,102,103,104,105,106,接种方法:稀释涂布平板法：

10、,a.梯度稀释菌液：,菌液,微量 移液器,稀释涂布平板法：,a.梯度稀释菌液：,b.涂布平板：,不超过0.1ml,1个不涂布作空白对照,滴,灼,冷,涂,各梯度分别涂布3个平板(重复组，取平均值),平板划线法,稀释涂布平板法：,问题讨论,涂布平板的所有操作都应该在火焰附近进行。结合平板划线与系列稀释的无菌操作要求，想一想，第2步应如何进行无菌操作？,答：应从操作的各个细节保证“无菌”，例如，酒精灯与培养皿的距离要合适，吸管头不要接触任何其他物体、吸管要在酒精灯火焰周围，等等,平板划线法：,稀释涂布平板法：,2.培养：,将接种后的培养基和一个未接种的培养基,放入37恒温箱中培养12h24h后，,观

11、察并记录,四、大肠杆菌的纯化培养,接种方法,下面对发酵工程中灭菌的理解不正确的是()A.防止杂菌污染 B.消灭杂菌 C.培养基和发酵设备都必须灭菌 D.灭菌必须在接种前,B,灭菌的目的是防止杂菌污染，但实际操作中不可能只消灭杂菌，而是消灭全部微生物。,灭菌必须在接种前，如果接种后再灭菌就会把所接菌种也杀死。,灭菌的目的,发酵所用的微生物是灭菌后专门接种的,五、课题成果评价,培养12 h与24 h后的大肠杆菌菌落的大小会有明显不同，及时观察记录的同学会发现这一点。,（一）培养基的制作是否合格,如果未接种的培养基在恒温箱中保温12 d后无菌落生长，说明培养基的制备是成功的，否则需要重新制备。,（二

12、）接种操作是否符合无菌要求,如果培养基上生长的菌落的颜色、形状、大小基本一致，并符合大肠杆菌菌落的特点，则说明接种操作是符合要求的；如果培养基上出现了其他菌落，则说明接种过程中，无菌操作还未达到要求，需要分析原因，再次练习。,（三）是否进行了及时细致的观察与记录,1.临时保藏：,试管固体斜面培养基上,4,2.长期保存：,菌种易被污染、变异,甘油管藏,1ml甘油1ml菌液,20,六、课题延伸（菌种的保藏）,本课题知识小结,微生物的实验室培养,培养基,无菌技术,制备牛肉蛋白胨固体培养基,纯化大肠杆菌,结果分析与评价,培养基的类型,培养基的营养物质,避免杂菌污染的方法,实验室常用的消毒方法,实验室常

13、用的灭菌方法,平板划线法,稀释涂布法,（步骤）,例3右表是某微生物培养基成分，请据此回答：（1）表中营养成分共有 类。（2）右表培养基可培养的微生物类型是。,自养型微生物,3,（3）若除去成分（NH4)2SO4，加（CH2O），该培养基可用于培养。（5）不论何种培养基，在各种成分都溶化后分装前，要进行是。（6）右表中各成分重量确定的原则是。（7）若右表培养基用于菌种鉴定，应该增加的成分是。,固氮微生物,调整pH,依微生物的生长需要确定,琼脂（或凝固剂）,课题2土壤中分解尿素的细菌的分离与计数,一、课题背景,1、尿素的利用,尿素是一种重要的农业氮肥。尿素不能直接被农作物吸收。土壤中的细菌将尿素分

14、解成氨之后才能被植物利用。,2、细菌利用尿素的原因,土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成脲酶,尿素是培养基中的唯一氮源，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，以尿素作为氮源，才能生长。缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生长发育繁殖，而受到抑制，所以用此培养基就能够选择出分解尿素的微生物。,5、该培养基选择分解尿素的微生物的原理,选择培养基：在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。,1、显微镜直接计数：,利用血球计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。,.统计菌落数目：,不能区分死菌与活菌；不适于对运动细菌的计数；需要相对高的细

15、菌浓度；个体小的细菌在显微镜下难以观察；,缺点,2.间接计数法（活菌计数法）原理：在稀释度足够高时，微生物在固体培养基上所形成的一个菌落是由一个单细胞繁殖而成的，即一个菌落代表原先的一个单细胞。常用方法：稀释涂布平板法。,每克样品中的菌落数(CV)M其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(ml)，M代表稀释倍数。,注意事项为了保证结果准确，一般选择菌落数在30300的平板上进行计数。为使结果接近真实值可将同一稀释度加到三个或三个以上的平皿中，经涂布，培养计算出菌落平均数。(即设置重复组求平均数)统计的菌落往往比活菌的实际数目低。,（一）土壤取样,（二

16、）制备培养基,（三）土壤样品的稀释,（四）取样涂布,（五）微生物的培养与观察,（八）鉴定,（七）细菌的计数,二.实验的操作流程,（六）鉴定：筛选后必鉴定 鉴别培养基：加入某种指示剂或化学药品，不影响微生物的生存1、酚红培养基：鉴定分解尿素的细菌。原理：脲酶催化尿素分解成氨培养基碱性增强 酚红变红脲酶阳性2、伊红美蓝培养基：鉴定大肠杆菌原理：代谢产物与伊红美蓝结合 菌落呈黑色并带有金属光泽。,属鉴别培养基，它并没有促进大肠杆菌的生长和抑制其他微生物的生长,接种,不接种,接种,接种,需将未接种的选择培养基同时进行培养,需设立牛肉膏蛋白胨培养基进行接种后培养，观察两种培养基上菌落数目、进行对比得出结

17、,金版P21 实验设计原则(1)设立重复组：统计某一稀释度下平板上的菌落数时，要至少涂布三个平板作重复组，增强实验结果的说服力与准确性。(2)设立两种对照组：,栏目链接,四.结果分析与评价,2,2,分解纤维素的微生物的分离,2.纤维素酶 纤维素酶是一种复合酶，一般认为它至少包括三种组分，即C1酶(外切酶)、CX酶(内切酶)和葡萄糖苷酶，前两种酶使纤维素分解成纤维二糖，第三种酶将纤维二糖分解成葡萄糖。,3.纤维素的分解：土壤中某些微生物(真菌、放线菌及细菌)能够产生纤维素酶,把纤维素分解为葡萄糖，后再利用。,(三)、实验设计,土壤取样,选择培养,梯度稀释,将样品涂布到鉴别培养基,挑选菌落,什么样

18、的环境取样?,培养的目的?选择培养基的特点?,挑选什么样的菌落?,鉴别培养基的特点?如何鉴别?,根据：微生物对生存环境的要求，到相应环境中去找；,目的：增加纤维素分解菌的浓度，以确保能够从样品中分离到所需要的微生物；,刚果红染色法,【资料三】刚果红染色法,方法一：先培养微生物，再加入刚果红进行颜色反应,方法二：在倒平板时就加入刚果红,漂洗作用,氯化钠可以使结合不牢的刚果红洗去,这样就留下大大小小的透明圈,大的透明圈当然分解纤维素的能就强。,方法一中NaCl溶液的作用？,颜色反应基本上是纤维素分解菌的作用,操作繁琐刚果红会使菌落之间发生混杂,操作简便不存在菌落混杂问题,产生淀粉酶的微生物也产生模

19、糊透明圈，有些微生物能降解色素，形成明显的透明圈。,思考：这两种方法各有哪些优点与不足,方法一：先培养微生物，再加入刚果红进行颜色反应,方法二：在倒平板时就加入刚果红,将细菌涂布在只有尿素做氮源的选择培养基上,将细菌涂布在只有纤维素粉做碳源的选择培养基上,固体培养基,液体培养基,筛选菌株,选择培养,浓缩所需微生物,在细菌分解尿素的化学反应中，细菌合成的脲酶将尿素分解成了氨，氨会使培养基的碱性增强，pH升高。在培养基中加入酚红指示剂，如果pH升高指示剂会变红,刚果红可以与纤维素形成红色复合物，当纤维素被纤维素酶催化分解后红色复合物无法形成，培养基上就会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈,观察菌落周围是否有着色的环带出现来鉴定尿素分解菌,观察菌落周围是否出现透明圈来筛选纤维素分解菌,脲酶检测法,刚果红染色法,酚红培养基,刚果红染色法,可根据是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌,透明圈大的，分解纤维素的能力就强啦,刚果红染色法,