微生物工程重点内容.ppt

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1、微生物工程的基本概念,利用微生物的特定性状和机能，通过现代化工程技术，生产有用物质或直接应用于工业化生产的技术体系；是将传统发酵与现代基因工程、细胞工程、代谢工程、生物信息工程和计算机控制等新技术结合并迅速发展起来的现代发酵技术。,微生物工程是渗透有工程学的微生物学，是发酵技术工程化的发展。,微生物工程发展简史,1、传统的微生物发酵技术天然发酵2、第一代微生物发酵技术 纯培养技术3、第二代微生物发酵技术深层培养技术4、第三代微生物发酵技术 代谢调控技术5、第四代发酵技术基因工程技术,微生物工程,微生物工程既基于生物学知识、又依托工程概念，解决的是生物技术产业化进程中的关键问题，被誉为工业生物技

2、术的核心。,借助于微生物进行产品开发或环境改造是微生物工程 的基本内容和目标，涉及到解决人类所面临的食品与营养、健康与环境、资源与能源等重大问题，为人类社会带来巨大经济和社会效益。,微生物工程的组成,菌种的选育培养基的配制、灭菌、扩大培养和接种发酵过程产品的分离提纯等,微生物发酵生产流程,微生物工程产品类型,1.微生物代谢产物发酵,2、微生物菌体的发酵,3、微生物的生物转化,初级代谢产物与菌体生长相伴随的产物，氨基酸、核苷酸、维生素、有机酸、溶剂菌体对其合成反馈控制严密，一般不过量积累次级代谢产物与菌体生长不相伴随，以初级代谢产物为原料而合成 抗生素、生物碱、毒素、胞外多糖等 结构常较复杂对环

3、境条件敏感,1.微生物代谢产物发酵,发酵生产产品的类型 目的,初级代谢产物primary metabolite,是指微生物通过代谢活动所产生的、自身生长和繁殖所必需的物质，如氨基酸、核苷酸、多糖、脂类、维生素等。通过初级代谢，能使营养物转化为结构物质、具生理活性物质或为生长提供能量，因此初级代谢产物，通常都是机体生存必不可少的物质，只要在这些物质的合成过程的某个环节上发生障碍，轻则引起生长停止，重则导致机体发生突变或死亡，是一种基本代谢类型。,次级代谢产物secondary metabolite,是指微生物生长到一定阶段才产生的化学结构十分复杂、对该生物无明显生理功能，或并非是微生物生长和繁殖

4、所必需的物质，如抗生素、毒素、激素、色素等。不同种类的微生物所产生的次级代谢产物不相同，他们可能积累在细胞内，也可能排到外环境中。,2、微生物菌体的发酵,SCP、药用真菌（冬虫夏草、茯苓等）生物防治制剂（如苏云金杆菌）活性乳酸菌制剂、食用和药用酵母,细胞的生长与产物的积累成平行关系，生长速率最大的时期也是产物合成最高阶段,3、微生物的生物转化,利用微生物细胞的一种或几种酶，对外源化合物的特定部位进行加工，如加入羟基、还原双键、脱氧或切断支链等。,转化的最终产物并不是微生物细胞利用营养物质经细胞代谢产生，而是微生物细胞的酶或酶系作用于底物的某一部位，进行特定部位的化学反应而形成。,反应最显著的特

5、点是特异性强，包括反应特异性、结构位置特异性、立体特异性,4）微生物特殊机能的利用 利用微生物消除环境污染利用微生物保持生态平衡 利用微生物探矿、冶金、石油脱硫等（氧化硫杆菌、排硫杆菌、脱氨硫杆菌、氧化亚铁硫杆菌（如芽孢杆菌属、土壤杆菌属）等。）利用基因工程菌生产动、植物细胞产品,工业微生物的特点,1、概念(什么是工业微生物)从来源于自然界大量的微生物中分离并筛选出有用菌种，再加以改良，贮存待用于生产的微生物称为工业微生物。通常在发酵过程作为活细胞催化剂,传统的工业微生物包括细菌、放线菌、酵母菌和霉菌四大类。,目前最有应用前景的工业微生物：基因工程菌株,2、工业微生物种类,2.1 原核细胞类微

6、生物:细菌、放线菌、立克次氏体、衣原体等2.2 真核细胞类微生物:酵母菌和霉菌，单细胞藻类、原生动物等2.1 非细胞类微生物（主要作为基因工程的载体）:RNA病毒（逆转录病毒）DNA病毒（腺病毒）3、微生物的特点3.1 种类多 3.2 分布广 3.3 体积小3.4 繁殖快 3.5 代谢强 3.6 易变异,（1）廉价原料、生长迅速、目的产物产量高。（2）易于控制培养条件，生产效率高。发酵周期较短。（3）抗杂菌和噬菌体的能力强。（4）菌种遗传性能稳定，不易变异和退化，不产生任何有害的生物活性物质和毒素，保证安全生产。（5）产品容易分离提纯。对于胞外产品，细胞膜具有良好的渗透性，或者细胞膜的渗透性可

7、以调节，细胞不易发生菌体自溶；对于胞内产品，要求菌体易分离和收集，菌体易破碎。,二、工业化菌种的要求,微生物与工业生产,二、人类是如何利用微生物进行工业生产的呢？（通过微生物工业生产想获得什么？）1.获取菌体物质，例如蛋白、脂肪和糖类。2.获取微生物的代谢产物，例如抗生素、乙醇、甘油等等。3.利用微生物的酶作为活化剂进行产品加工。,基因工程菌与传统工业微生物的差别,前者含有带外源基因的重组载体;而后者是单一的微生物细胞;前者需要发酵条件满足外源基因的表达，后者则只需要满足细菌本身的生长和代谢需要要获得高水平的产品，基因工程菌生产过程中往往使用高密度发酵基因工程菌发酵问题中最重要的两个问题是菌体

8、的高密度发酵和诱导条件的确定。,培养基的主要成分及作用 一、碳源,主要功能：1）为菌体的生长繁殖提供能源和合成菌体所 必需的成分；2）为合成目的产物提供所需的碳素成分,常用的碳源:,特殊情况下（如碳源贫乏时），蛋白质水解物或氨基酸等也可被微生物作为碳源使用。,二、氮源,有机氮源：豆饼（粕）粉、花生饼粉、鱼粉、蚕蛹粉、酵母粉、玉米浆、尿素等,无机氮源：铵盐、硝酸盐等（由于细胞内的含氮物质都以氨基或亚氨基的形式存在，故铵态氮可以直接用于合成细胞物质；而硝态氮需还原成氨后才能被利用）,分类：无机氮源和尿素、玉米浆等可被迅速利用，为速效氮；蛋白质氮则需先水解成肽和氨基酸后才能被吸收利用，属迟效氮 氮源

9、物质常对培养液pH产生影响 在常用的无机氮中，硫酸铵被菌体利用后会使培养液的pH下降，为生理酸性物质；硝酸钠被同化时则引起培养液pH上升，为生理碱性物质,三、无机盐和微量元素,磷酸盐：磷是某些蛋白质和核酸的组成成分磷酸盐在培养基中还具有缓冲作用微生物对磷的需要量一般为0.0050.01mol/L常用K3PO4、Na2HPO4、NaH2PO4,钾盐：钾不参与细胞结构物质的组成是许多酶的激活剂菌体生长所需钾量约为0.1g/L(以K2SO4计),微量元素：需量微少，但又不可缺少一般作为碳、氮源的农副产物天然原料中，本身含有，不必另加某些金属离子，特别是汞离子和铜离子，具有明显的毒性,硫酸镁：Mg 2

10、+是许多重要酶（如己糖磷酸化酶、异柠檬酸脱氢酶、羧化酶等）的激活剂镁离子能提高一些氨基糖苷类抗生素产生菌对自身所产的抗生素的耐受能力，如卡那霉素、链霉素、新生霉素等产生菌。硫存在于细胞的蛋白质中，是含硫氨基酸的组成成分硫是构成一些酶的活性基硫酸镁加入培养基中，在碱性条件下会形成氢氧化镁沉淀，配料时要注意。,四、生长因子,概念：微生物生长不可缺少的微量有机物质。,类别：维生素、氨基酸、嘌呤嘧啶及其衍物提供生长因子的农副产品原料1）玉米浆 用亚硫酸浸泡玉米而得的浸泡液的浓缩液，也是玉米淀粉生产的副产品 虽然主要用作氮源，但它含有丰富的氨基酸、核酸、维生素、无机盐等，常用作为提供生长因子的物质。2）

11、麸皮水解液：可代替玉米浆，蛋白质、氨基酸等营养成分比玉米浆少。用量一般为1%（以干麸皮计）左右3）糖蜜 甘蔗糖蜜、甜菜糖蜜均可代替玉米浆，但氨基酸等有机氮含量较低 甘蔗糖蜜用量为0.1%0.4%4)酵母：酵母膏、酵母浸出液、酵母粉5）其他：牛肉膏、蛋白胨、动物心、肝等组织浸液等都含有丰富的生长因子,五、水,生理功能：1）是微生物机体的重要组成部分2）进行代谢反应的介质3）营养物、代谢物、氧气等必须溶解于水后才能通过细胞表面进行正常的活动；4）水的比热高，能有效吸收代谢过程中放出的热，使细胞内温度不致骤然上升；同时水又是热的良导体，有利于散热，可调节细胞温度。,1、培养基分类：按培养基成分,1）

12、合成培养基：所用原料的化学成分明确、稳定 如葡萄糖、硫酸铵 适于研究菌种基本代谢和过程的物质变化等科研工作；在生产某些疫苗的过程中，为了防止异性蛋白质等杂质掺入，也常用合成培养基；营养单一、价格较高，不适于大规模生产,2）天然培养基：原料是一些天然动、植物产品 如花生饼粉、蛋白胨等 来源广泛（大多为农副产品）、营养丰富、价格低廉、适于工业化生产 一般不需要另加微量元素、维生素等物质 由于成分复杂，不易重复，如对原料质量等方面不加控制会影响生产稳定性3.半合成（组合）培养基：在合成培养基的基础上添加些天然成份，以更有效地满足微生物对营养物的需要 如马铃薯-蔗糖培养基,3、根据培养基用途来分,1）

13、孢子培养基：供菌种繁殖孢子的培养基，常用固体培养基。孢子培养基基本要求：基本要求是能使菌体迅速生长，产生较多优质孢子，且不易引起菌种发生变异。配制时需注意 A）营养不要太丰富（特别是有机氮源），否则不易产孢子。B）所用无机盐的浓度要适量，否则会影响孢子量和孢子颜色。C）注意pH和培养基的湿度。常用孢子培养基 麸皮培养基 小米培养基 大米培养基 玉米碎屑培养基 用葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏和食盐等配制的琼脂斜面培养基 注意：大米和小米常用作霉菌孢子培养基，因为它们含氮量少、疏松、表面积大，是良好的孢子培养基。2）种子培养基：供孢子发芽、生长和菌体繁殖的培养基。营养要求比较丰富和完全，氮源和维生素的含

14、量也要高些，但总浓度以略稀薄为好，这样可达较高的溶解氧，供大量菌体生长和繁殖。种子培养基的成分要考虑在代谢过程中能维持稳定的pH，其成分还要根据不同菌种的主要特征而定。3）发酵培养基：供菌体生长、繁殖和合成大量代谢产物用的培养基。要使种子接入后能迅速生长，达到一定的菌体浓度又要使长好的菌体能迅速合成所需产物。因此发酵培养基的组成除有菌体生长所必需的元素和化合物外，还要有合成产物所需的特定元素、前体和促进剂等。,基础培养基：是含有一般微生物生长繁殖所需的基本营养成分的培养基；加富培养基：在基本培养基中加入某些特殊的营养物质，如血、血清、动植物组织液或其他营养物质（或生长因子）的一类营养丰富的培养

15、基。富集培养基：用来富集（使数量上占优势）和分离某种特定微生物或用以培养营养要求苛刻的微生物.选择培养基：具体说，是加入相应的特殊营养物质或有抑菌性的化学物质,以抑制不需要的微生物的生长,而促进所需微生物的生长。用于将某种或某类微生物从混杂的微生物群体中分离出来.鉴别培养基：用于鉴别不同类型微生物的培养基。在普通培养基中加入能与某种代谢产物发生反应的指示剂或化学药品，从而产生某种明显的特征性变化，以区别不同的微生物以便于根据目的选择性挑取或计数等。,小结,培养基的类型 分类依据 类型 营养物质来源 天然、合成、半合成 培养基物理状态 液体、固体、半液体 培养基的成分和目的 基本、完全、鉴别、选

16、择 生产工艺的要求 孢子(Spore)、种子、发酵培养基的用途：筛选菌种、保藏菌种、检验杂菌、培养种子、发酵生产等,巴斯德效应 Pasteur effect,1861年巴斯德(L.Pasteur)在研究酵母的酒精发酵量和氧分压之间的关系中发现在厌氧条件下,向高速发酵的培养基中通入氧气,则葡萄糖消耗减少,抑制发酵产物积累的现象称为巴斯德效应。即呼吸抑制发酵的作用。,在好氧条件下，酵母发酵能力下降。,磷酸果糖激酶，是变构酶，受ATP，柠檬酸及其他高能化合物抑制，被AMP,ADP激活；在好气条件下，糖代谢进入TCA，产生柠檬酸并通过氧化磷酸化生成大ATP，细胞内柠檬酸生成增加，反馈抑制磷酸果糖激酶的

17、合成，阻遏作用由于ATP反馈抑制此酶的活性而加强；由于磷酸果糖激酶受抑制，导致6-磷酸果糖积累，当反应6-磷酸葡萄糖6-磷酸果糖达到平衡，醛糖和酮糖的摩尔比=7:3，导致6-磷酸葡萄糖积累，反馈抑制己糖激酶，抑制葡萄糖进入细胞内，导致葡萄糖利用率降低；好气条件下丙酮酸激酶的活性降低，此酶受磷酸果糖激酶催化生成的1,6-二磷酸果糖的激活，丙酮酸激酶活性降低，导致磷酸烯醇丙酮酸积累，反馈抑制己糖激酶；,在厌氧发酵过程中，丙酮酸在不同的受氢体的作用下产物会不同，也就是说在不同酶的催化下会获得不同的产物，都有哪些酶和哪些产物？乳酸脱氢酶-乳酸丙酮酸脱羧酶-乙醛-乙醇脱氢酶-乙醇丙酮酸脱氢酶-乙酰CoA

18、-丁酰 CoA丁醛-丁醇丙酮,什么是好氧发酵和厌氧发酵，其主要代表产品有哪些好氧发酵：发酵时需要氧的参与，而且在氧气充足的条件下发酵效率更高 代表产品：链霉素、氯霉素、金霉素、土霉素、四环素厌氧发酵：发酵时不需要氧的参与，氧气可能会对发酵产生不良影响 代表产品：酒精、丙酮、丁醇、甘油,A.亚硫酸盐法甘油发酵（酵母第二型发酵）,C6H12O6+NaSHO32CH2OHCHOHCH2OH+CH3CHOHOSO2Na+CO2,在酵母中，乙醇脱氢酶活力很强，在该酶的作用下，乙醛作为受氢体而被还原成乙醇，因此，在乙醇发酵中，甘油生成量很少。如果改变发酵条件或者加入某种抑制剂，阻止乙醛作为受氢体，就可以积

19、累大量甘油，如在发酵醪中加入亚硫酸氢钠，与乙醛起加成反应生成难溶的乙醛亚硫酸氢钠加成物。这样乙醛不能作为受氢体，必须有磷酸二羟丙酮作为受氢体，生成大量甘油，即转为甘油发酵，也叫做酵母第二型发酵。,B.碱法甘油发酵(酵母第三型发酵),2C6H12O6+H2O2CH2OHCHOHCH2OH+C2H5OH+CH3COOH+2CO2,当酵母在碱性（PH7.6）条件下进行发酵，所生成的乙醛也不能作为受氢体，两个乙醛分子起歧化作用，相互氧化还原，生成等量的乙醇和乙酸，这时，硫酸二羟丙酮又成为NADH+H+的受氢体，总的产物为甘油，乙酸，乙醇，和CO2.,总反应式为:C6H12O6+2ADP+2H3PO42

20、CH3CHOHCOOH+2ATP+135.56KJ理论转化率:290/180100%=100%,乳酸链球菌、酪乳杆菌、保加利亚乳杆菌、德氏乳杆菌,同型乳酸发酵是指发酵终产物中90以上为乳酸的乳酸发酵过程。,同型乳酸发酵(Homofermentation of lactic acid patheay),糖酵解途径（EMP）,丙酮酸脱氢酶,异型乳酸发酵Heterofermentation of lactic acid patheay,总反应式为:C6H12O6CH3CHOHCOOH+CH3CH2OH理论转化率:90/180100%=50%,磷酸戊糖途径（HMP)肠膜明串珠菌、葡聚糖明串珠菌,是指发

21、酵终产物中除乳酸外，还有乙醇、乙酸和二氧化碳等成分的乳酸发酵过程。,磷酸解酮酶,双歧途径Bifidum patheay,总反应式为:2C6H12O62CH3CHOHCOOH+3CH3COOH理论转化率:(290)/(2180)100%=50%,磷酸解酮酶途径（HK）,6-磷酸果糖酮解酶,5-磷酸木酮糖磷酸酮解酶,柠檬酸生物合成途径,丙酮酸羧化酶,丙酮酸脱氢酶,柠檬酸合成酶,第一个调节酶是磷酸果糖激酶（PFK）,柠檬酸和ATP对该酶有抑制,生产菌需要解除该抑制作用,AMP、无机磷以及NH4+对该酶有活化作用,NH4+有效解除柠檬酸和ATP对该酶的抑制，NH4+浓度与柠檬酸生产速度有密切关系，正是

22、细胞内NH4+浓度升高，使PFK对细胞内积累的大量柠檬酸不敏感。故生产上通过添加铵盐来提高柠檬酸产量,磷酸果糖激酶,1.糖酵解及丙酮酸代谢的调节,Mn2+的影响：,Mn2+缺乏,HMP和TCA循环酶水平低，生长期菌丝体的蛋白质、核酸和脂肪含量明显减少，氨基酸和NH4+水平升高,Mn2+缺乏,可能干扰蛋白质合成，导致蛋白质分解,NH4+水平升高,减少柠檬酸对PFK的抑制,Mn2+缺乏高糖,NH4+,GluGlnOrnArg氨基丁酸,蛋白质和RNA转换过程中细胞蛋白的再合成受损伤,1.糖酵解及丙酮酸代谢的调节,丙酮酸羧化酶和丙酮酸脱氢酶的平衡,1.糖酵解及丙酮酸代谢的调节,丙酮酸羧化酶,丙酮酸脱氢

23、酶,柠檬酸合成酶是TCA循环第一个酶。但黑曲霉中柠檬酸合成酶没有调节作用。,大量生成草酰乙酸是积累柠檬酸的关键。丙酮酸羧化酶和柠檬酸合成酶基本上不受代谢调节的控制或其控制及微弱，而且这两个反应的平衡保证了草酰乙酸的提供，增加了柠檬酸的合成能力。,2.三羧酸循环的调节柠檬酸合成酶,顺乌头酸水合酶是催化柠檬酸-顺乌头酸正逆反应的酶，作用需要Fe2+。（1）添加Fe2+络合物（2）筛选该酶缺失或活力降低的菌株（3）随着柠檬酸的积累，高酸环境可进一步造成顺乌头酸水合酶和异柠檬酸脱氢酶失活,2.三羧酸循环的调节顺乌头酸水合酶,2.三羧酸循环的调节NAD和NADP-异柠檬酸脱氢酶,黑曲霉中只有一种NAD-

24、异柠檬酸脱氢酶，且活力很低。NADP-异柠檬酸脱氢酶有两种：（1）细胞质中的不受柠檬酸抑制（2）线粒体中受生理浓度柠檬酸抑制。,一旦柠檬酸积累到一定水平，就能抑制其自身的进一步分解，从而促进自身的积累,2.三羧酸循环的调节-酮戊二酸脱氢酶,在黑曲霉柠檬酸产生菌中，TCA循环的一个显著特点是，-酮戊二酸脱氢酶的合成受葡萄糖和NH4+的阻遏。因此当以葡萄糖为碳源时，在柠檬酸生成期，菌体内不存在-酮戊二酸脱氢酶或活力很低。,-酮戊二酸脱氢酶催化的反应是TCA循环中唯一不可逆反应，一旦-酮戊二酸脱氢酶丧失，就会引起：TCA循环中的苹果酸、富马酸、琥珀酸是由草酰乙酸逆TCA循环生成，使TCA循环成“马蹄

25、形”。-酮戊二酸又抑制异柠檬酸脱氢酶的活性。,乙酰CoA和草酰乙酸结合生成柠檬酸过程中要引进一个氧原子，因此氧也可以看作为柠檬酸生物合成底物。它对柠檬酸发酵的作用为：,(1)氧是发酵过程生成的NADH2重新氧化的氢受体。(2)近来的研究发现，黑曲霉中除了具有一条标准呼吸链以外，还有一条侧系呼吸链。,2.三羧酸循环的调节-氧对柠檬酸积累的调节,当缺氧时，只要很短时间中断供氧，就会导致此侧系呼吸链的不可逆失活，而导致柠檬酸产酸急剧下降。,2.三羧酸循环的调节氧对柠檬酸积累的调节,柠檬酸的积累机制小结：,Mn2+缺乏抑制蛋白合成NH4+，形成一条呼吸活动强的不产生ATP的侧呼吸链，解除磷酸果糖激酶的

26、代谢调节，促进EMP途径畅通。丙酮酸羧化酶是组成型酶，不被调节控制，草酰乙酸合成有保证。丙酮酸氧化脱羧生成乙酰CoA和CO2的固定两个反应的平衡，以及柠檬酸合成酶不被调节，增强了合成柠檬酸的能力。,柠檬酸的积累机制小结：,顺乌头酸水合酶在催化时建立了以下平衡：柠檬酸：顺乌头酸：异柠檬酸=90：3：7，同时控制Fe2+含量时，顺乌头酸酶活力降低，使柠檬酸积累。随着柠檬酸积累，pH降低到一定程度时，使顺乌头酸酶和异柠檬酸脱氢酶失活，更有利于柠檬酸的积累。,柠檬酸的积累机制小结：,-酮戊二酸脱氢酶的合成受葡萄糖和NH4+的阻遏。因此当以葡萄糖为碳源时，在柠檬酸生成期，菌体内不存在-酮戊二酸脱氢酶或活

27、力很低。-酮戊二酸抑制异柠檬酸脱氢酶的活性，促使柠檬酸的积累,柠檬酸发酵过程的控制要点,（1）控制Mn2+、NH4+浓度，解除柠檬酸对PFK的抑制，使EMP畅通无阻。,（3）控制培养基中的Fe2+的浓度，使顺乌头酸水合酶失活。,（2）控制溶氧，防止侧系呼吸链失活。,氨基酸发酵的代谢调控,1控制旁路代谢2降低反馈作用物的浓度3消除终产物的反馈抑制与阻遏4控制细胞渗透性5控制发酵的环境6促进ATP的积累以利氨基酸的生物合成,一、谷氨酸生物合成途径及调节机制,3mol醋酸：1mol柠檬酸生成的柠檬酸一半转化为异柠檬酸酵母N源耗尽后开始烷烃发酵，低浓度AMP抑制NAD-异柠檬酸脱氢酶的活性，柠檬酸大量

28、合成并积累。此时顺乌头酸水合酶催化反应平衡为：柠檬酸：异柠檬酸：顺乌头酸=90：7：3。细胞质中积累大量异柠檬酸。,谷氨酸生产菌中存在2个糖酵解途径EMP/HMP,生物素参与糖代谢作用：增加糖代谢的速度,丙酮酸积累,亚砷酸抑制,EMP途径：HMP途径90：10,黄色短杆菌,产氨短杆菌,TCA循环,柠檬酸合成酶,乌头酸酶,异柠檬酸脱氢酶,拮抗,氟乙酸,氟乙酸抗性株,谷氨酸产量升高,氟乙酸是乌头酸酶的专一抑制剂,酮戊二酸脱氢酶活力低,酮戊二酸积累,NH4+,谷氨酸脱氢酶,谷氨酸,-酮戊二酸脱氢酶,ATP,3C6H12O66C3H4O36CH3COOH6CO26CH3COOH+2NH3+3O22C5

29、H9O4N+2CO2+6H2O,以葡萄糖为原料的谷氨酸发酵中，特别是在谷氨酸生成期DCA循环应关闭,异柠檬酸裂解酶,TCA循环的中间产物,异柠檬酸脱氢酶,异柠檬酸裂解酶,抑制,黄色短杆菌,Km0.01mmol/L,Km0.8mmol/L,有机酸浓度低时DCA循环有机酸浓度高时TCA循环,DCA循环,异柠檬酸脱氢酶,CO2固定,在生产菌中检出CO2固定反应酶活性,磷酸烯醇丙酮酸(PEF)羧化酶和苹果酸酶,谷氨酸对糖的转化率达到81.7%,PEP,乙酰CoA,草酰乙酸、,PEP羧化酶,丙酮酸激酶,PEP浓度低时乙酰CoA与二磷酸果糖不能激活PEP羧化酶分解乙酰CoA浓度增加，与二磷酸果糖共同激活P

30、EP羧化酶，CO2固定,增加TCA循环中间产物浓度天冬氨酸 反馈抑制PEP羧化酶分解防止草酰乙酸当乙酰CoA氧化 ATP 丙酮酸激酶抑制CO2固定,氨的导入,合成谷氨酸的反应有3种：,+,-酮戊二酸,+,天冬氨酸或丙氨酸,谷氨酸转氨酶,-酮戊二酸,+,-酮戊二酸,+,谷氨酰胺,NADPH,+,2谷氨酸,NADP,+,谷氨酸合成酶,谷氨酸脱氢酶是合成积累谷氨酸的主要酶,谷氨酸转氨酶活力低，转氨作用可以不考虑,谷氨酸合成酶由于不受高浓度谷氨酸抑制，其作用值得重视,谷氨酸,+,-酮戊二酸,+,天冬氨酸或丙氨酸,-酮戊二酸,+,谷氨酸,-酮戊二酸,+,为何谷氨酸合成酶在合成谷氨酸过程中值得重视？,谷氨

31、酸合成酶的KmNH4+只有谷氨酸脱氢酶的1/10，当环境中NH4+浓度很低时，由该途径合成谷氨酸。当细胞内谷氨酸浓度高时，反馈抑制谷氨酸脱氢酶活性，但不抑制谷氨酸合成酶。,异柠檬酸脱氢酶（NADP）与谷氨酸脱氢酶（NADPH+H+）形成共轭体系，在活细胞中异柠檬酸脱氢酶活性总比谷氨酸脱氢酶低,谷氨酸,为何说NADP浓度是限速因子，决定谷氨酸的产量？,生物素和NH4+对谷氨酸发酵如何影响？,细胞膜通透性控制,结论：谷氨酸分泌是由细胞膜控制的。结论：细胞膜的谷氨酸通透性受细胞膜的 磷脂含量控制,菌种选育模型,细胞膜通透性,细胞膜磷脂含量,控制油酸合成控制甘油合成控制磷脂合成,生物素缺陷型,阻断不饱

32、和脂肪酸的合成,磷脂含量减少，影响细胞膜的合成,饱和脂肪酸表面活性剂,对生物素有拮抗,阻断脂肪酸的合成,影响细胞膜的合成,在对数生长期添加青霉素,抑制细胞壁合成,细胞膜损伤,甘油缺陷型,磷脂的合成受阻,影响细胞膜的合成,油酸缺陷型,阻断不饱和脂肪酸的合成,影响细胞膜的合成,菌种选育模型,(1)细胞生长期到抗生素产生期的过渡 次级代谢产物是在菌体生长到达相对静止期才产生。在细胞生长阶段,负责次级代谢产物合成的酶处于抑制状态。A.诱导因子在生长期末积累或从外源加入;B.初级代谢的终产物耗尽解除反馈阻遏作用;C.易被利用的糖源分解代谢物被利用后,便解除了阻遏作用;D.高能化合物ATP形成减少后，阻遏

33、作用也就解除;E.在生长期，RNA聚合酶只能启动生长期基因的转录作用；当生长停 止后,酶的结构改变,允许RNA聚合酶启动生产期基因的转录作用,负责抗生素合成的酶开始生成。,抗生素生物合成的调节机制,(3)分解代谢产物的调节控制,碳、氮分解代谢产物(如葡萄糖)阻遏和抑制作用,抑制抗生素合成。在抗生素发酵过程中，若供给高浓度的无机氨态氮或其他容易被利用的氮源，会促进菌体生长，强烈抑制抗生素的合成。,葡萄糖效应glucose effect,(2)酶的诱导作用在抗生素合成期,参与次级代谢的有些酶是诱导酶。需要底物或底物的结构类似物(外源和内源诱导剂)。,(3)分解代谢产物的调节控制,解除分解产物阻遏的

34、方法:A.选育对葡萄糖代谢产物类似物抗性突变型;B.培养过程中利用缓慢的碳源和氮源,连续流加葡萄糖和无机氨态氮;C.使用含有慢慢向培养基内渗透营养物质的颗粒。,（4）磷酸盐的调节,1抗生素只有在磷酸盐含量控制在生长的“亚适量”时才能合成。2磷酸盐抑制抗生素合成的机制可能有以下方面：A.抑制或阻遏抗生素生物合成途径中有关酶的活力和合成。B.改变代谢途径。(HMPEMP，减少抗生素的芳香族前体合成)C.磷酸盐可调节细胞内ATP的形成。,(5)初级代谢产物的调节,A.有一条共同的合成途径,当初级代谢产物积累时,反馈抑制了某一步反应的进行,而最终抑制了次级代谢产物的合成。B.初级代谢产物直接参与次级代

35、谢产物的生物合成,反馈抑制了它自身的合成时,必然也同时影响了次级代谢产物的合成。如缬氨酸是合成青霉素的前体，其生物合成受到反馈调节，必然对青霉素的合成有影响。,(6)次级代谢产物的自身反馈调节,抗生素本身的过量积累，存在着与初级代谢相似的反馈调节现象。如氯霉素、卡那霉素、泰乐菌素、制霉菌素、瑞斯托霉素等抗生素都对本身的合成有抑制作用。产生菌抗生素的生产能力与自身抑制所需抗生素浓度呈正相关性。因此要选育生产能力强的抗反馈调节的突变菌株。,(7)细胞膜透性的调节,细胞膜的通透性影响胞内合成及代谢物分泌和发酵产物收获。例：在青霉素发酵中,生产菌细胞膜输入硫化物能力的大小影响青霉素发酵单位的高低。诱变

36、选育出来的青霉素高产菌株中，改变了细胞膜的通透性，使硫酸盐更容易透过细胞膜，提高了胞内硫酸盐浓度，进而促进了青霉素前体物半胱氨酸的合成，最终提高了青霉素的产量。,(8)次级代谢的能荷调节,A.能荷调节机制对次级代谢途径的控制是有效的。B.抗生素生产菌株的ATP含量在生长期中迅速增加,而在抗生素形成期ATP含量迅速下降,并保持在较低的水平上。高ATP含量不利于抗生素的积累。C.磷酸盐可通过增加ATP的含量来影响抗生素的生产。,（9）金属离子和溶解氧的调节,在多数情况下，微量的金属离子是参与次级代谢产物合成酶的活化因子，甚至有时在转录和转译水平上起作用。如，Mg2+可增加卡那霉素合成中的卡那霉素乙

37、酰化酶、乙酰卡那霉素胺基化酶和弗氏链霉菌的碱性磷酸酶的活力，促进这些酶的合成。有些金属离子（如Mg2+和Ca2+等）可解除产生菌（卡那霉素、新生霉素和链霉素等产生菌）对所产抗生素的特异性吸附作用，使抗生素从菌丝上游离下来，促进产物分泌。还有一些金属离子（如Mg2+）可增加产生菌对所产抗生素的抗性。次级代谢产物的发酵过程需要适量的溶解氧，溶解氧的降低影响次级代谢产物的生物合成。例如，由青霉素N进行头孢菌素合成时，氧分压的增大促进头孢菌素的合成，同时降低搅拌速度合成量则减少。,什么是发酵动力学？,研究内容：微生物生长过程中的质量和能量平衡，发酵过程中菌体生长速率、基质消耗速率和产物生成速率的相互关

38、系，环境因素对三者的影响以及影响反应速度的条件。,发酵动力学：发酵过程中菌体生长、基质消耗、产物生成的动态平衡及其内在的规律。,发酵分类（按发酵动力学原则）Gaden 分类法型生长联系型（简单发酵型）型部分生长联系型（中间发酵型）型非生长联系型（复杂发酵型）,型生长联系型（简单发酵型）,产物直接由碳源代谢而来，产物生成速率的变化与微生物对碳源利用速度的变化相平行，产物生成和糖的利用有直接的化学计量关系，产物形成与微生物生长相偶联。,酒精发酵 酵母菌体培养,型部分生长联系型（中间发酵型）,产物不是碳源的直接氧化产物，而是菌体内生物氧化过程的主流产物，碳源既供微生物的生长又供产物生成，糖的消耗主要

39、在微生物的旺盛生长阶段和产物最大形成期，但糖的消耗与产物合成无直接计量关系，产物生成与微生物的生长部分偶联。,黑曲霉 柠檬酸发酵 土霉素生产,型非生长联系型（复杂发酵型）,产物合成与碳源利用无准量关系，产物生成量远远低于碳源消耗量，产物生成在菌体和基质消耗完以后才开始，与生长不偶联，所形成产物均是次级代谢产物。,青霉素和链霉素生产,1.生长速率,细胞浓度，g/L,限制性基质浓度，g/L,抑制剂浓度g/L,生长速率,g/(Lh),产物形成动力学,1生长联系型模式（初级代谢产物）,当底物以化学计量关系转变成单一的一种产物P时，产物形成速率与生长速率成正比,2非生长联系型模式（次级代谢产物）,产物的

40、形成速率只和细胞浓度有关,3复合模式,比生产速率，单位菌体的产物生成速率，g产物/（g细胞h)或1/h,对于生长联系型，比生长速率与比生产速率成正比对于非生长联系型，比生长速率与比生产速率无关,比生长速率,比生长速率：单位菌体的生长速率，时间的倒数一般以1/h表示。,与多种因素有关，随温度、pH、基质浓度等条件改变,比生长速率与基质浓度的关系,Monod方程,底物饱和(亲和）常数,最大比生长速率,一级反应,当限制性底物浓度非常小时,比生长速率与限制性底物浓度成正比，微生物的生长显示为一级反应,零级反应,当限制性底物浓度很大时,比生长速率达到最大比生长速率，菌体的生长速率与底物浓度无关，而与菌体

41、浓度成正比，微生物显示为零级反应。,饱和常数KS的物理意义,KS为比生长速率等于最大比生长速率的一半时的底物浓度,同一微生物菌体，对不同的基质具有不同的饱和常数KS，而具有最小KS值的底物为微生物生长的天然底物。,KS的大小反映了比生长速率对底物浓度的敏感性。当KS较大时，值变化小，微生物对基质的敏感性小当KS较小时，值变化大，微生物对基质的敏感性大,生长得率与产物得率,生长得率消耗每单位数量的基质所得到的菌体量,产物得率 消耗每单位数量的基质所得到的产物量,理论生长得率和表观生长得率,理论得率 只考虑细胞合成时细胞对底物的得率叫做生长的理论得率。表观得率 既考虑合成又考虑细胞维持时细胞对底物

42、的得率叫做生长的表观得率。,理论生长得率与表观生长得率的区别和联系,理论得率只取决于细胞的组成与合成途径与生长速率无关，表观得率与生长速率及培养条件有关在生长速率较高时，生长速率很低时，表观得率可在培养过程中随时测定，而理论得率不能直接测定,第三节 发酵培养方法,深层液体发酵liquid submerged fermentation,深层液体发酵是把菌种接种到发酵罐中，使菌体细胞游离悬浮在液体培养基中，并进行生长和将原料转化为产物的发酵方法。深层液体发酵一般需要通入空气并进行搅拌，是传统的微生物发酵培养方法。,分批发酵batch culture,在一个密闭系统内投入有限数量的营养物质后，接入少

43、量的微生物菌种进行培养，使微生物生长繁殖，在特定的条件下只完成一个生长周期的微生物培养方法。,分批发酵 batch culture,在发酵开始时，将微生物菌种接入已经灭菌的培养基中，在微生物最适宜的培养条件下进行培养，在整个培养过程中，除氧气的供给、发酵尾气的排出、消泡剂的添加和控制pH需加入的酸或碱外，整个培养系统与外界没有其他物质的交换。,分批发酵特点：,1.培养基一次灭菌，一次投料，容易实现无菌状态2.易于操作控制，产品质量稳定3.培养浓度较高，易于产品分离4.辅助时间较多，设备生产能力低,补料分批发酵（流加培养）fed-batch culture,先将一定量的培养液装入反应器中，在适宜

44、的条件下接种细胞，进行培养，细胞不断生长，产物也不断形成。随着细胞对营养物质的不断消耗，向反应器中不断补充新的营养成分，使细胞进一步生长代谢，到反应终止时取出整个反应系。,补料内容和原则,内容：碳源氮源微量元素和无机盐诱导物,原则：控制微生物的中间代谢，使之向着有利于产物积累的方向发展。,分批补料发酵的特点：,可解除底物抑制和分解代谢物的阻遏防止某些限制性营养成分在培养过程中被耗尽而影响细胞的生长和产物的形成可以避免在分批发酵中因一次投料过多造成细胞大量生长而产生的一切影响，改善发酵液流变学的性质,连续发酵continuous culture,以一定的速度向培养系统内添加新鲜的培养基，同时以相

45、同的速度流出培养液，从而使培养系统内培养液的量维持恒定，使微生物细胞能在近似恒定状态下生长的微生物发酵方式,微生物细胞的生长速率、产物代谢均处于恒定状态，可以达到稳定、高速培养微生物细胞或产生大量的代谢产物的目的,连续发酵特点：,1.维持低基质浓度，避免有毒代谢物积累2.设备生产能力高、易于实现自动控制和劳动生产率高3.很难保证长期的无菌操作，菌种易发生变异4.培养浓度较低，不易于产品分离,三种不同发酵工艺适用的范围。分批发酵：发酵过程不存在明显的底物抑制，发酵周期长补料分批发酵：存在底物抑制的发酵生产，营养物浓度高导致副作用的发酵生产。连续发酵：菌体比生长速率较高的发酵生产，不易杂菌污染的发

46、酵生产。,连续培养模型,全混式（COST）进料液出料反应器中无浓度梯度流出液物料反应器中物料,连续培养模型,活塞流式（PFR）物料先进先出细胞浓度和营养组分浓度沿反应器轴向变化，径向无变化反应器各处各组分浓度不随时间变化,单级连续培养,洗出 当稀释率提高到使反应器中底物浓度S接近进料液中的底物浓度SO时，反应器中细胞浓度将趋于零，整个连续培养过程也就完全破坏了。称为洗出现象。,连续过程的最大稀释率也称为临界稀释率：发生洗出时的稀释率DC,工业生产使用发酵罐的基本条件,(1)应具有严密的结构。(2)良好的液体混合特性。(3)较高的传质、传热速率。(4)具有配套而又可靠的检测、控制仪表。,3按容积

47、分类：500L以下的是实验室发酵罐；500-5000L是中试发酵罐；5000L以上是生产规模的发酵罐。密闭厌氧发酵罐：酒精、乳酸通气好氧发酵罐：柠檬酸、谷氨酸,2.按照发酵罐设备特点分类：机械搅拌通风发酵罐：循环式：伍式发酵罐，文氏管发酵罐 非循环式：通风式发酵罐和自吸式发酵罐 非机械搅拌通风发酵罐：循环式：气提式、液提式发酵罐 非循环式：排管式和喷射式发酵罐。,密闭厌氧发酵罐,搅拌器,搅拌器有平叶式、弯叶式、箭叶式三种其作用是打碎气泡，使氧溶解于醪液中，从搅拌程度来说，以平叶涡轮最为激烈，功率消耗也最大，弯叶次之，箭叶最小。,机械搅拌发酵罐的结构,1、罐体 2、搅拌器和挡板 3、消泡器 4、

48、联轴器及轴承 5、变速装置 6、空气分布装置7、轴封 8、冷却装置,2、微生物工程下游工程的一般程序,改变发酵液 性质，固液分离以及细胞破碎,提取（初步纯化）目的是除去与目标产物性质差异大的杂质,精制（高度纯化）是采用对产品有高度选择性的分离技术，除去与产物化学性质和物理性质相近的杂质,最终获得质量合格的产品,2.下游加工过程的一般流程,产品的收得率和质量控制。,复习题：,发酵液,细胞破碎,固液分离,预处理,初步提纯,精制,成品,（加热、调pH、凝集、絮凝）,（过滤、离心分离、膜分离),（匀浆、研磨、酶解）,（沉淀、吸附、萃取、离子交换、膜分离）,（重结晶、色谱分离、电泳）,（浓缩、无菌过滤、

49、干燥、成型）,1）发酵液预处理的意义和方法,目的：分离菌体和其他悬浮颗粒，除去部分可溶性杂质和改变滤液的性质，以利于提取和精制后继各工序的顺利进行。方法选择：根据对产品的要求来选择,1采用絮凝或凝聚的方法，设法增大悬浮液中固体粒子的大小，提高其沉降速度；2或采用稀释、加热等方法降低黏度，以利于过滤,2.改善发酵液过滤特性的物理化学方法,通过对发酵液进行适当的预处理，即可改善其流体性能降低滤饼比阻，提高过滤与分离的速率1）降低液体粘度：加水稀释法 升高温度2）调整pH：3）凝聚与絮凝：凝聚：指在电解质作用下，由于胶粒之间双电层电排斥作用降低，电位下降，而使胶体体系不稳定的现象。絮凝：指在某些高分

50、子絮凝剂存在下，基于桥架作用，使胶粒形成较大絮凝团的过程。4）加入助滤剂：助滤剂是一种不可压缩的多孔微粒，它能使滤饼疏松，吸附胶体，扩大过滤面积，滤速增大。常用的助滤剂有硅藻土、纤维素、石棉粉、珍珠岩、白土炭粒、淀粉等，其中最常用的是硅藻土。5）加入反应剂：,复习题：,1.常用的层析技术包括：离子交换层析、亲和层析、分子筛层析、分配层析。2.产生均一结晶的条件1纯度高2.饱和介稳态3.合适的温度和溶剂3.电泳分离的原理1.电泳淌度2.分子筛效应,常见层析技术的总结,影响发酵过程的主要因素,温度pH溶解氧菌体浓度和基质浓度二氧化碳和呼吸商泡沫,温度,控制措施：发酵温度的确定应根据发酵的不同阶段，