cDNA文库构建PPT课件.ppt
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1、cDNA文库的构建,现代生物技术讲座,主要内容,基因文库的概念及意义cDNA基因文库的类型几种cDNA文库的介绍SMART技术构建全长cDNA文库,一、基因文库的概念及意义,文库(library):指一种全体的集合。基因文库(gene library):是某一生物类型全部基因的集合,这些基因以克隆的形式存在(人工构建)。,基因文库与基因库(gene bank)区别基因文库与基因克隆,基因库是指某一生物群体中的全部基因。,基因克隆是只包含某些特定基因或DNA片段的克隆。基因文库中包含着为数众多的克隆,建成后可供随时选取其中任何一个基因克隆之用。,构建基因文库的意义,使生物的遗传信息以稳定的重组体
2、形式贮存起来;是一种分离克隆目的基因的主要途径;基因文库也是复杂基因组作图的重要依据。,根据基因类型(重组DNA片段的供体)基因组文库和cDNA文库 1、基因组文库,基因组文库(gene library):用重组DNA技术,将某种生物细胞的总DNA或染色体DNA切割成一定大小的片段,并与合适的载体重组后,然后转移到适当的宿主细胞中,通过细胞增殖而构成各个片段的无性繁殖系(克隆),这些存在于所有重组体内的基因组DNA片段的集合,即基因组文库。它包含该生物所有基因。根据DNA来源可分为核基因组文库、线粒体基因组文库和叶绿体基因文库,构建流程,抽提基因组DNA,鸟枪法制备DNA片段,DNA片段与载体
3、重组,转化宿主菌,筛选目的基因(核酸探针法、免疫结合法),基因文库,限制性内切酶,克隆、转化、培养、鉴定,基因组DNA,基因文库,基因组DNA文库,限制性内切酶,基因组DNA,基因重组,转化细菌,体外包装,特点及应用:包含所有遗传信息构建难度大(单拷贝基因、长片段基因)筛选难度大用于研究基因在基因组中的情况,基因组物理图谱的构建基因组序列分析基因在染色体上的定位克隆鉴定基因调控元件 基因组中基因的结构和组织形式分析,基因组DNA文库应用,结构基因,外显子,内含子,转录、加工修饰,mRNA,2、cDNA文库,cDNA 是指以 mRNA 为模板,在反转录酶的作用下形成的互补 DNA(简称 cDNA
4、)。,cDNA文库(complementary DNA library)以组织细胞中的mRNA为模板,反转录合成双链cDNA,各cDNA分子分别插入载体形成重组子,再导入宿主细胞克隆扩增。这些在重组体内的cDNA的集合即cDNA文库。代表特定细胞或组织中mRAN的文库,cDNA文库的构建:,自20世纪70年代中期首例cDNA克隆问世以来,构建cDNA文库已成为研究功能基因组学的基本手段之一。cDNA便于克隆和大量表达,它不像基因组含有内含子而难于表达,因此可以从cDNA文库中筛选到所需的目的基因,并直接用于该目的基因的表达。通过构建cDNA表达文库不仅可保护濒危珍惜生物资源,而且可以提供构建分
5、子标记连锁图谱的所用探针,更重要的是可以用于分离全长基因进而开展基因功能研究。因此,cDNA在研究具体某类特定细胞中基因组的表达状态及表达基因的功能鉴定方便具有特殊的优势,从而使它在个体发育、细胞分化、细胞周期调控、细胞衰老和死亡调控等生命现象的研究中具有更为广泛的应用价值,是研究工作中最常使用到的基因文库。,从1976年HOFSTETTER成功的构建了第一个cDNA文库以来,构建cDNA文库的技术方法经历了一个逐步发展完善的过程。初期cDNA文库,由于当时技术的限制,选用质粒载体存在着连接效率低、难以扩增和保存等缺点,而YOUNG和DAVIS重组载体为表达性文库构建和保存提供了质的飞跃。近年
6、来,cDNA文库构建的新方法层出不穷,但其共同目的是使cDNA文库更加迅速、高效满足研究的需要。,cDNA文库优点,(1)使遗传物质为RNA病毒可建立文库;(2)因克隆数比基因组文库少得多,易于筛选;(3)从分化特异的细胞的cDNA文库中可分离到特异表达的基因。(4)建库时已排除了其它的RNA,使假阳性率减低。(5)cDNA文库可在细菌中表达,可用多种策略进行筛选。,cDNA 文库便于克隆和大量扩增,可以从 cDNA 文库中筛选到所需目的基因,并用于该目的基因的表达。,一个细胞在任何时间可以产生几千种不同的蛋白质,所有的蛋白质都有相应的mRNA分子。为了鉴别其中任何一个mRNA分子,每一单独m
7、RNA的克隆都得考虑,但是mRNA不能直接用于克隆,因为它很不稳定,因此,可以合成与选定组织中所有mRNA互补的DNA分子(complementary DNA,cDNA)。信息量远小于基因组文库,注意,(1)细胞中不同mRNA的丰度不同,低丰度的mRNA要求很高的克隆数(要用公式来计算)。(2)有的基因表达具有严格的时空性,要获得其mRNA并非易事。用不同发育阶段,或不同组织细胞中的mRNA制备的cDNA文库会包含一些共同和特异序列。这可用于分离差异表达的基因。(3)cDNA文库的DNA无内含子、调节元件和基因间DNA。不能用于基因结构和调节的研究。一个基因经不同的剪接可产生不同的部分重叠的c
8、DNA克隆。,3、cDNA文库和基因组文库的区别,时效性 cDNA 文库代表某一时期特定细胞或组织中mRAN,是转录水平,仅反映某一时期特定组织表达的功能基因,不是全部基因;而基因组文库包含该生物所有基因,序列组成不同 cDNA 文库无间隔序列和调控区等非编码区;基因组文库可真实显示基因组的全部结构信息,由于制备DNA片段的切点是随机的,所以每一克隆内所含的DNA片段既可能是一个或几个基因,也可能是一个基因的一部分或除完整基因外还包含着两侧的邻近DNA顺序。,两种文库均有应用,如何选择 根据试验目的,在分离植物RNA、病毒基因、研究植物功能蛋白序列、分离植物特定发育阶段或特特异表达的基因时应用
9、cDNA文库;在研究mRNA不存在的序列及基因组作图时必须构建基因组文库。,亚克隆文库,将人工染色体文库或粘粒文库中克隆的大片段DNA用鸟枪法(shot gun)随机小片段化,然后用这些随机小片段建立的DNA文库,二、cDNA基因文库的类型,依据起始mRNA是否经过标准化预处理:非标准化cDNA文库和标准化cDNA文库文库功能:克隆文库和表达文库 载体类型:质粒、噬菌体、粘粒和人工染色体文库根据文库构建过程中是否对克隆进行过全长选择分为普通cDNA文库和全长cDNA文库 依据第一链反转录引物不同分为随机引物cDNA文库和Oligo d(T)cDNA文库,(一)非标准化cDNA文库和标准化cDN
10、A文库,依据起始mRNA是否经过标准化预处理,可将文库分为非标准化cDNA文库(unnormalized cDNA library)和标准化cDNA文库(normalized cDNA library);前者反映了组织中所有基因的表达水平,适于基因表达谱分析,但文库中冗余较高,发现新基因效率低。后者往往经过杂交(均一化)、扣除杂交(subtractive hybridization)、抑制性扣除杂交(suppression subtractive hybridization)处理,不能反映建库材料的基因表达情况,不能用于表达谱构建,但是新基因发现效率提高了。在研究基因功能和表达调控时,建立减法
11、文库是一个很好的策略。它是通过野生行DNA和缺失型DNA,或不同时空、不同环境条件下的两种CDNA样品反复杂交,去处杂交体后,将剩余的DNA或CDNA片段进行克隆而构建的文库。,(二)根据文库的功能分:克隆文库和表达文库,(1)克隆文库 由克隆载体构建,载体具有复制子、多克隆位点及选择标记,可通过细菌培养使克隆片段大量增殖。克隆基因主要利用核酸探针,可用蛋白质序列或同源序列。,(2)表达文库 由表达载体构建,载体除具有克隆载体的元件外,还具有控制基因表达的序列,如启动子、SD序列、ATG、终止子等,可在宿主细胞内表达出克隆片段的编码序列,它可分为融合蛋白表达载体和天然蛋白表达载体。分离基因时,
12、由于克隆片段的基因表达产物蛋白质具有抗原性和生物活性,所以除核酸探针外,还可用免疫学探针和生物功能进行筛选。表达文库适合于那些不知道蛋白质的氨基酸序列、不能用核酸类探针筛选的目的基因分离。,(三)不同载体文库,主要有质粒、噬菌体、粘粒和人工染色体四大类,每类中由有许多不同的载体,不同的载体适于构建不同的基因文库。质粒文库 噬菌体文库 粘粒文库 人工染色体文库,构建文库的载体,1.噬菌体载体基础:裸露的噬菌体重组DNA转化宿主细胞或包装后转染宿主细胞。载体筛选:在细菌菌苔中形成噬菌斑。重组筛选:插入载体通过可见标记的插入失活(cI基因的打断阻止溶源性,产生的噬菌体更清澈;现代的载体携带lacZ基
13、因,以兰-白筛选)。,置换载体Spi-表型(对P2感染敏感性消失)是中心“填充片段”gam和red基因座丢失引起的。供体DNA的大小:插入载体:0-10kbp;置换载体:9-23kbp。插入大小范围被有效形成噬菌斑的野生型基因组 75-105所限制。主要应用:插入载体:cDNA克隆和表达文库;噬菌体展示。置换载体:基因组DNA克隆。,2.粘粒(cosmid)载体基础:包含噬菌体cos位点的质粒;导入宿主:经体外包装,再转染宿主细胞;载体筛选:类似于质粒重组筛选:可见标记插入失活和小片段插入的阳性筛选;供体DNA大小:30-45kbp。插入大小范围被有效形成噬菌斑的野生型基因组 75-105所限
14、制。主要应用:基因组文库构建。,3.质粒载体构建cDNA文库,4.大容量克隆载体,(1)细菌人工染色体(bacterial artificial chromosomes,BACs,fosmids)基础:大肠杆菌F质粒导入宿主:电转化载体筛选:显性选择标记重组筛选:插入片段大小供体DNA大小:300kbp主要应用:大基因组分析评论:低频率的重排和嵌合分子。载体在每个细胞中维持一个或两个拷贝,产生少量供体DNA。,(2)P1载体和P1人工染色体(P1 artificial chromosomes,PACs)基础:噬菌体P1导入宿主:体外包装和转导载体筛选:显性选择标记重组筛选:应用对致死标记的打断
15、进行阳性筛选供体DNA大小:约100kbp主要应用:大基因组分析评论:重排和嵌合分子少。载体维持低拷贝,但可以通过诱导噬菌体P1溶菌循环扩增。,(3)酵母人工染色体(yeast artificial chromsomes,YACs)基础:酿酒酵母中心粒、端粒和ARS导入宿主:转化酵母原生质体载体筛选:显性筛选标记(营养缺陷型的恢复)重组筛选:插入片段大小供体DNA大小:2000kbp主要应用:大基因组分析,YAC转基因小鼠评论:YAC的缺点是高频率的自发缺失,和克隆的嵌合化。重组载体的大小,需要电泳分析,有时难以区分内源性染色体。YAC维持低拷贝。,随机引物cDNA文库和Oligo d(T)c
16、DNA文库,依据第一链反转录引物不同分为随机引物cDNA文库和Oligo d(T)cDNA文库。目前,随机引物cDNA文库使用较少。Oligo d(T)cDNA文库获得的克隆含有基因的3端非翻译区。因为不含有编码序列,受到的选择压力比较小,多态性程度较高,适用于发现新的多态性STS位点。同时可以减少文库构建过程中基因组DNA和其它种类RNA对文库的污染。但是传统的Oligo d(T)cDNA文库难于获得较长基因的全长cDNA;同时长度不等的polyA尾巴的存在会影响后期3端测序。为此应分别通过全长库构建技术和使用锚定引物Oligo d(T)VN或者兼并的锚定引物Oligo d(T)VN来减少p
17、olyA长度。,三、几种cDNA文库的介绍,经典 cDNA 文库全长cDNA文库均一化 cDNA 文库差减 cDNA 文库(Subtractive cDNA library)全长差减均一化cDNA文库 固相 cDNA 文库构建,(一)经典 cDNA 文库构建的基本原理,用 Oligo(dT)作逆转录引物,或者用随机引物,给所合成的 cDNA 加上适当的连接接头,连接到适当的载体中获得文库。其基本步骤包括:(1)RNA 的提取(例如异硫氰酸胍法,盐酸胍有机溶剂法,热酚法等等,提取方法的选择主要根据不同的样品而定),要构建一个高质量的 cDNA 文库,获得高质量的 mRNA 是至关重要的,所以处理
18、 mRNA 样品时必须仔细小心。由于 RNA 酶存在所有的生物中,并且能抵抗诸如煮沸这样的物理环境,因此建立一个无 RNA 酶的环境对于制备优质 RNA 很重要。,(2)合成 cDNA 在获得高质量的 mRNA 后,用反转录酶 Oligo(dT)引导下合成 cDNA 第1链,cDNA 第2链的合成(用 RNA 酶 H 和大肠杆菌 DNA 聚合酶 I,同时包括使用 T4 噬菌体多核苷酸酶和大肠杆菌 DNA 连接酶进行的修复反应),(3)合成接头的加入、将双链 DNA 克隆到载体中去、分析 cDNA 插入片断,扩增 cDNA 文库、对建立的 cDNA 文库进行鉴定。这里强调的是对载体的选择,常规用
19、的是 噬菌体,这是因为 DNA 两端具有由12个核苷酸的粘性末端,可用来构建柯斯质粒,这种质粒能容纳大片段的外源 DNA。,高质量mRNA的制备,反转录生成cDNA,与噬菌粒载体分子相连接,噬菌粒的包装,cDNA噬菌粒文库的主要步骤:,1、高质量mRNA的制备,用试剂盒提取总RNA,加入与生物素相连的寡聚(dT)引物温育,加入与微磁球相连的抗生物素蛋白,用磁场吸附通过寡聚(dT)引物与抗生物素蛋白及强力微磁球相连的mRNA,洗脱得到mRNA,2、反转录生成cDNA,以寡聚dT或随机6核苷酸为引物,反转录酶,cDNA第一链,以cDNA第一链为模板合成cDNA第二链,加接头准备与载体连接,为了得到
20、有方向性的cDNA应该接上不同的接头,加入带有酶切位点的寡聚dT引物,高活性的反转录酶,合成cDNA的第一链,合成cDNA第二链,用RNase H分解RNA链,加Eco RI接头,用Xho I内切酶切割,得到双接头有方向性的cDNA,(5CTCGAG),3、与噬菌体载体分子相连接,带有接头的cDNA,噬菌粒DNA,经内切酶切割,含有cDNA插入片段的重组噬菌粒DNA,4、噬菌粒的包装,含有cDNA插入片段的重组噬菌粒DNA,体外蛋白质外壳的包装反应,有侵染和复制能力的成熟噬菌体,进行基因组学的研究,含有某种组织或器官的噬菌粒文库,经典 cDNA 文库优缺点,经典 cDNA 文库的构建虽然高效、
21、简便,但文库克隆的片段一般较小,单个克隆上的 DNA 片段太短,所能提供的基因信息很少,大多需要几个克隆才能覆盖一个完整的全基因的 cDNA。,(二)全长cDNA 文库构建的原理,为了克隆到真正的 cDNA 全长,建立富含全长的 cDNA 文库具有重要意义。为此,必须克服仅用 mRNA 的 Poly(A)尾合成以及由普通逆转录酶作用特点所导致的局限性。全长 cDNA 文库,是指从生物体内一套完整的 mRNA 分子经反转录而得到的 DNA 分子群体,是 mRNA 分子群的一个完整的拷贝。全长 cDNA 文库不仅能提供完整的 mRNA 信息,而且可以通过基因序列比对得到 mRNA 剪接信息,此外,
22、还可以对蛋白质序列进行预测及进行体外表达和通过反向遗传学研究基因的功能等。,cDNA文库的组建:,反转录引物和反转录酶,为了避免oligo(dT)作为cDNA第一链合成的引物造成的cDNA短截现象,人们对第一链引物末端的两个碱基作了改进(dT)nVN,其中V可以是A,C或G,N则为A.T.C,G中的任意一种碱基,这就避免了由于mRNA内部存在寡聚(T)而造成的cDNA对应于mRNA的3端出现的短截现象。传统的逆转录酶AMV和MMLV等都不能逆转录出很长的cDNA.Superscript II TM(Gibco BRL)的推出,使逆转录出更长的cDNA成为可能。(Caminci et a1.,2
23、000)研究表明一些糖类如海藻糖能有效提高反转录酶和其它一些酶类的活性,并能提高酶的最适反应温度,从而为打破mRNA的二级结构,提高反转录的效率提供了可能。,5端帽子结构,真核生物的mRNA与原核生物不同,其5端有一个特殊的甲基化帽子结构,5端帽子结构就成为人们构建全长cDNA文库,寻找突破口的主要目标。全长cDNA文库的构建方法都是基于5端帽子结构的特殊性研究出来的。其中代表性的方法有:Oligo-capping(Suzuki et a1.,1997;Marugama et a1.,1994),CAPture法(Edery et a1.,1995),SMARTTM法(Y.Y et a1.,2
24、001),CAP-Trapper法(Carninci et a1.,1996),Capselect(Schmidt et a1.,1999),Oligo-capping,此方法又叫做寡聚核糖核酸单链连接法(SSLLM)(Single-Strand Linker Ligation Method/SSLLM).1994年,Maruyama等人首先取得了突破。他们利用5帽子的结构特点,用细菌碱性磷酸酶(BAP)去除无5端mG保护的、部分降解的、不完整mRNA末端的游离磷酸基团,再用烟草酸性磷酸酶(TAP)去除5的mG结构仅保留一个5P,合成一段寡核糖核酸,用T4 RNA连接酶连接到经过处理的mRNA
25、S端的5P上,然后利用修饰的oligo(dT)作逆转录,并进行PCR反应,称为oligo capping。,该方法的优点在于为反转录第一链cDNA达到全长设定了标准,从而有利于全长cDNA的富集。理论上由于利用了PCR技术会导致基因的拷贝数得到极大的扩增,从而利用极少量的起始材料就可以建库。该方法存在的不足有以下四点:a.实际操作中,反应的效率比理论上的大大降低,所以需要的起始材料非常大。b.各种酶对反应模板底物有一定的倾向性,以及PCR反应在模板的量和长度上的选择性,所以会导致在文库中某种类型的克隆的富集,因此,不能真实地反映组织中各种基因的存在情况,同时会在以后的测序反应中产生冗余性。c.
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