干细胞与组织工程上.ppt

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1、上回说到:第6章 胚胎工程,Q1：简要介绍人类的辅助生殖技术。Q2：简要介绍哺乳动物性别控制的主要方法及 意义。,第 7 章干细胞与组织工程,什么是干细胞(stem cells),干细胞是具有自我复制和多项分化潜能的原始细胞，是机体的起源细胞，是形成人体各种组织、器官的祖先细胞。,干细胞的分类,按来源分类,按分化潜能分类,胚胎干细胞和成体干细胞的比较,定义:当受精卵分裂发育成囊胚时，内细胞团的细胞就是胚胎干细胞。,特点：具有很强的分化能力，可以无限增加，并且可以分化成全身多种细胞类型。,总结：它能长成动物的任何组织和器官,特点：在特定条件下，成体干细胞或者产生新的干细胞，或者按一定的程序进行分

2、化，形成新的功能细胞，从而使组织和器官保持生长和衰退的动态平衡。,What is a stem cell?,A:A cell that can make copies of itself AND make more specialized types of cellB:A cell that helps to fight against infections C:A cell that is specialized D:A cell that can produce all the cell types of the body,Where can scientists obtain stem

3、cells?,A:Only from an embryo B:Only from adult tissuesC:Only from the brain D:From an embryo or adult tissues,干细胞是研究的热点,2006年2月9日，国务院发布的国家中长期科学和技术发展规划纲要(2006-2020年)部署了四项重大科学研究规划，发育与生殖研究位列其中。,2007年欧盟经过长时间的辩论后决定拨款资助人类干细胞研究。而此前，美国总统布什首次动用否决权，驳回胚胎干细胞研究的法案，引起轩然大波。这个事件在科学、伦理和政治的揪扯下，愈演愈烈，最后终于引发了一场激烈的“文化战争”

4、。（视频1）,中国人对胚胎干细胞研究的看法比较一致,大多数中国人能够接受此项研究,主要是受儒家思想的影响。儒家很早以前就已经指出，人生出来的时候，人才开始。按照大多数中国人的看法，胚胎还不是人，不涉及人权问题。,7.1 胚胎干细胞（embryonic stem cells,ES细胞）,四个基本问题:什么是ES细胞？（定义）如何分离培养ES细胞（建系）如何鉴定ES细胞？ES细胞有何应用价值？,受精 卵裂 受精后72h 受精后5-7天精子+卵子 合子 卵裂球 桑椹胚 囊胚 blastocyst 滋养层胎盘及胎儿附属结构囊胚 内胚层消化道、呼吸道上皮和腺体；肝；胆；胰。内细胞团 中胚层结缔组织；血液

5、；肌肉；骨骼；泌尿生殖系统 外胚层体表结构；神经系统,人早期胚胎发育,A blastocyst is,A:A very early stage embryoB:A type of stem cellC:Part of the blood systemD:A type of brain cell,定义,胚胎干细胞?是从早期胚胎内细胞团(或生殖脊)分离，并经体外抑制分化培养所获得的干细胞。这些细胞能在体外进行长期培养增殖，且保持高度未分化状态和正常二倍体核型，具有发育的全能性，能分化出成体的所有种类的细胞（组织和器官），包括生殖细胞。,胚胎干细胞（embryonic stem cells,ES细胞

6、）胚胎生殖细胞（embryonic germ cells,EG细胞）,胚胎干细胞的研究历程,1981年，Martin Evans 鼠1995年，Thomson猴1998年，Thomson&Gearhart人,1981年，英国剑桥大学的Martin Evans等首次于用延迟着床的小鼠囊胚建立起未分化的ES细胞系,James A.Thomson在 Wisconsin大学领导一个研究小组从人胚胎组织中培养出了干细胞株。他们使用的方法是：人卵体外受精后，将胚胎培育到囊胚阶段，提取内细胞团，建立细胞株。经测试这些细胞株的细胞表面标志和酶活性，证实它们就是胚胎干细胞。(Science,1998(l282)

7、:1145-1147),John D.Gearhart在 Johns Hopkins大学领导另一个研究小组也从人胚胎组织中建立了干细胞株。他们的方法是：从受精后59周人工流产的胚胎中提取原始生殖细胞(primordial germ cell)。由此培养的细胞株，证实具有多能干细胞的特征。(PNAS,1998(l95):13726-13731),Scientists James Thomson and John Gearhart joined patient advocate Christopher Reeve to discuss stem cell research,霍金批评欧美人士试图禁止

8、人类胚胎干细胞研究,1999年12月，美国科学杂志公布了当年世界科学进展的评定结果，干细胞的研究成果列在举世瞩目耗资巨大的人类基因组工程之前，名列十大科学进展首位。2002年3月，美国麻省理工学院的科学家宣布，他们首次利用人体胚胎干细胞培育出毛细血管，证明了胚胎干细胞技术在治疗心血管疾病等领域的应用潜力。目前已有报导ES细胞能在适当条件下分化为心肌细胞，胰岛细胞，血管内皮细胞，肝细胞等。,新 进 展,胚胎干细胞的生物学特性,参见 7.1.4 ES细胞的鉴定,胚胎干细胞的建系,分离培养分离方法：(1)利用干细胞特征分离(2)免疫外科学方法(3)酶解法(4)显微外科学方法,(1)利用干细胞特征分离

9、流式细胞仪分离法,被Hoechst33342 和Rhodamine123低染细胞膜表面特殊标志：SSEA-3SSEA-4TRA-1-60TRA-1-81,(2)免疫外科学方法去除滋养层细胞,分离方法,(3)酶解法：酶消化去除滋养层细胞后培养(4)显微外科学方法：去除滋养层细胞后培养,ES细胞的分化抑制培养,在ES细胞的培养过程中，一方面要给以足够的营养物质以满足其增殖的需要，另一方面要抑制其分化，其中前者由基础培养基来解决，后者则由分化抑制物来完成。,分化抑制物的选择,目前有三种分化抑制物比较常用：饲养层（feeder layer）条件培养基（conditioned medium，CM）白血病

10、抑制因子（leukemia inhibitory factor,LIF）,饲养层细胞 feeders,是将选用的细胞经射线照射或经丝裂霉素C（mitomycin C）处理而阻断其有丝分裂所得到的细胞层。常用的有STO（一种已成系的小鼠成纤维细胞）、原代小鼠胎儿成纤维细胞、同源胎儿成纤维细胞和子宫上皮细胞，其中前两种比较常用。,饲养层细胞要铺满,抑制分化的因子白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor,LIF)ES细胞培养常用含有LIF的培养基（高糖）和饲养层细胞来阻止细胞的分化,条件培养基：是将大鼠肝细胞等细胞培养一定时间后，回收细胞培养液，经一系列处理后制为贮存液，

11、使用时以一定比例加到ES细胞培养基中。许多实验室经常用条件培养基取代饲养层来维持ES细胞。其优点是使ES细胞直接利用培养细胞分泌到培养液中的生长因子，可消除饲养层细胞的干扰，免受丝裂霉素C致癌剂的影响，而且操作比较简单。,建 系,胚胎干细胞建系(flash2),胚胎干细胞集落,小结:胚胎干细胞的建系过程,（1）细胞形态特征、取材部位（2）细胞表面的特殊标志（3）细胞内干细胞标志基因的表达（4）端粒酶（5）核型分析 体内分化（6）分化潜能 体外分化 嵌合体:小鼠胚胎干细胞已经制备嵌合体,胚胎干细胞的鉴定,形态学鉴定：典型的ES细胞体积较小，有一个大核，核内有一个或多个明显的核仁，胞质较少。细胞之

12、间界限不清晰，紧密聚集呈鸟巢状克隆。,胚胎干细胞克隆,胚胎干细胞的特性,细胞内干细胞标志基因的表达,碱性磷酸酶染色，呈阳性,免疫组织化学染色,RTPCR分析,核型保持正常,分化能力检测,ES细胞具有发育全能性，这是其区别于其它细胞的显著特点。ES细胞一旦脱离饲养层或除去分化抑制物后进行培养，会自发分化为多种细胞。在某些物质的诱导下，一些特定基因的表达会受到调节，从而使ES细胞发生定向分化。,分化能力,分化能力检测,体外分化试验：将所培养的细胞制成悬液在铺有明胶的培养皿中培养，则贴壁生长的ES细胞会自发地分化为各种细胞，而悬浮生长的ES细胞会形成简单类胚体，然后进一步形成囊状胚体。体内分化试验：

13、将一定量培养的ES细胞注入同源动物的皮下，过一段时间后会形成组织瘤，且组织瘤内有三个胚层的细胞存在。核移植检测：将培养的细胞作为核供体注入去核卵母细胞中，观察重构胚是否正常发育。嵌合体形成检测：将培养的细胞与受体胚胎结合并移植入同期假孕受体，ES细胞可参与受体胚胎的发育从而得到嵌合体动物，然后通过毛色判断，或同工酶检测。,胚胎干细胞,神经细胞,脂肪细胞,心肌细胞,上皮细胞,适当条件,体外定向分化,改变生长环境,处理塑料平皿、加入特定生长因子等,（1）加入诱导细胞分化的因子或化学物质，如VGEF、bFGF、DMSO和RA等（2）将ES细胞与特定的细胞共培养（3）将某种分化诱导因子的基因转入ES细

14、胞内,干细胞诱导分化的常用方法,胚胎干细胞的体外定向诱导分化：胎牛血清，骨髓基质细胞共培养胚胎干细胞造血细胞 RA胚胎干细胞神经细胞 DMSO胚胎干细胞肌肉细胞 TGF-B1,VEGF,bFGF胚胎干细胞血管和内皮细胞 RA+胰岛素+T3胚胎干细胞脂肪细胞 BMP-2,BMP-4胚胎干细胞软骨细胞 地塞米松，磷酸甘油胚胎干细胞骨细胞 基因转染胚胎干细胞胰岛素分泌细胞,胚胎干细胞诱导分化的途径,拟胚体的形成 非拟胚体形成途径,拟胚体 Embryoid body,在无饲养层系统中培养的ES细胞在体外可以形成拟胚体，拟胚体包含三个胚层来源的细胞，并能分化出三个胚层的细胞。,目标：定向分化,定向分化进

15、展:胚胎干细胞育出心脏组织 1）以色列工学院科学家首次从胚胎干细胞中培养出人类心脏组织。他们培育出的心脏组织，可以自然跳动，并且有新生心脏组织的电特性和机械性。这项实验证明：以细胞移植治疗心脏病的可能性是巨大的。此项发现，对治疗世界上最主要的一种致命疾病可能具有重大意义。2）法国科学家16日用老鼠胚胎干细胞成功治疗羊心脏病，这是第一次用老鼠干细胞来修复大型动物的心脏损伤,2005年英科学家利用胚胎干细胞成功制造软骨,Embryonic stem cells can differentiate into which types of cell?,A:Only brain stem cells a

16、nd specialized brain cellsB:All types of specialized cells in the bodyC:Only cells that can produce insulin D:Only cells that can produce artificial skin,骗局:胚胎干细胞美容,商品名称：爱丽玺尔胚胎干细胞因子商品编号：1696 香草山美容护肤中心 http:/,视频3,制备嵌合体,7.1.5 ES细胞的应用前景及面临的难题,胚胎干细胞研究是把双刃剑,胚胎干细胞研究的意义（应用前景）,研究哺乳动物个体发生发育规律研究细胞分化研究基因功能生产转基

17、因动物疾病治疗与治疗性克隆研究细胞癌变机理及新药物的筛选,胚胎干细胞+体细胞克隆=治疗性克隆(therapeutic cloning),治疗性克隆,科学家使小鼠、人类的胚胎干细胞发育成为成熟精子,用人类胚胎干细胞培育出卵子,美国生殖专家曾在2003年从小鼠身上的胚胎干细胞分化出卵子与囊胚，但在人类干细胞的研究则面临瓶颈。台大医院研究团队近年可在无血清、无喂养细胞的环境下培养胚胎干细胞，除了成功培育三株人类胚胎干细胞株外，更于最近进一步分化出卵泡（内含有卵子）的构造，且具有生殖细胞基因的表现。,胚胎干细胞研究面临的难题,增殖与分化的矛盾潜在致癌机制器官形成困难重重伦理冲突,伦理冲突,ES研究也引

18、发了当前最为激烈而敏感的伦理之争。主要围绕两个问题而展开：一是如何看待胚胎。ES主要有三个来:（1）（自然和人工）流产的胚胎；（2）辅助生殖剩余的胚胎；（3）通过体细胞核转移术得到的胚胎。不管哪一个来源，提取ES必定会损毁胚胎。于是，胚胎是不是生命，是不是人，研究ES是不是“毁灭生命”、“杀人”，很自然地成为争论的焦点。,如何解决伦理矛盾,不破坏胚胎的情况下获取胚胎干细胞成体干细胞横向分化睾丸细胞：胚胎干细胞的新来源iPS,2006年8月24日，美国学者兰萨领导的研究小组在自然杂志发表文章，宣称已实现在不破坏胚胎的情况下获取胚胎干细胞。这一成果如果得到学界承认，将是这一研究领域的一大进步。不再

19、“杀鸡取卵”的胚胎干细胞研究将赢得充分的发展空间。(视频4),成体干细胞横向分化,已经由多项研究证明，之前被认为发展很有限的特定组织中的成体干细胞在一定的条件下还能够形成其他组织的细胞类型，这些发现为干细胞新资源的探索和更广泛应用奠定了基础。,成体干细胞横向分化,Generation of pluripotent stem cells from neonatal mouse testis.,Cell.2004 Dec 29;119(7):1001-12.,睾丸细胞：胚胎干细胞的新来源,精原干细胞培养成胚胎干细胞,日本科学家分离培养新生小鼠的精原干细胞，体外抑制分化培养，发现这种细胞有分化增殖的

20、现象，并具有多向分化潜能，在体外能诱导分化成各种体细胞，通过囊胚注射获得了具有种系嵌合能力嵌合体后代。精原干细胞制作为又一种“多能细胞”引起了广泛关注。,制备嵌合体,Pluripotency of spermatogonial stem cells from adult mouse testis.,Nature.2006 Mar 24,诱导多能干细胞,2006年，Takahashi等通过巧妙的实验设计，从24 个候基因中筛选出4 个与胚胎干细胞多能性更为密切相关的基因Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4，并将它们导入到小鼠胚胎成纤维细胞和鼠尾成纤维细胞，成功地将其重编程为具有胚胎干细胞多能

21、性的细胞诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cell,iPS cell),十年磨一剑,诱导多能干细胞,2007年11月20日，美国威斯康星大学詹姆斯汤姆森的研究小组在科学杂志发表体细胞转变成“诱导性多能干细胞”（iPS细胞）的成果，而日本京都大学教授山中伸弥领导的研究小组也于同日在细胞杂志发表类似的研究结果。ips细胞的诞生仿佛给沉寂一时的国际干细胞研究打入了一剂强心剂。,视 频 5,Junying YU,James A.Thomson.Induced Pluripotent Stem Cell Lines Derived from Human Somatic C

22、ells.Science,2007,318(5858):1917-1920,这项技术可能会诺贝尔奖，这位在美国研究的中国科学家俞君英博士，出生于浙江诸暨，1997年毕业于北京大学，赴美国美国宾夕法尼亚大学留学。2003年进威斯康星大学詹姆斯汤姆森实验室进行研究工作。如果梦想成真，第一位获诺贝尔奖的中国籍的学者是俞氏的一位女性。,诱导性多能干细胞(iPS cells),定义：iPS cells是被重新编程从而进入一个类似胚胎干细胞状态的体细胞。,诱导多能干细胞,人iPS诞生仅一月有余，相关科研成果和技术革新就屡见报端，一些国家及科学界对这种细胞表现出强烈的关注，纷纷制订相关的研究计划。,诱导多能

23、干细胞,“PS细胞”具有和胚胎干细胞类似的功能，却绕开了胚胎干细胞研究一直面临的伦理和法律等诸多障碍，因此在医疗领域的应用前景非常广阔。这一新技术也被权威科学杂志自然、科学分别评为2007年第一大和第二大科学进展，又在2008年荣登Science十大科技进展榜首。,诱导多能干细胞,由于一些国家明确反对胚胎干细胞研究，使国际上许多有关的干细胞研究处于进退两难的境地。在一些国家陆续宣布禁止胚胎干细胞研究后，这一干细胞研究领域最有前途的研究道路被逐渐堵死，这也大大打击了一些国家的科学家对于干细胞研究的积极性。而“细胞”的出现则让大家站在了公平竞争的起跑线上，“海阔凭鱼跃，天高任鸟飞”，国际干细胞研究

24、摆脱了许多顾忌，有关研究的竞争态势日益显现。,诱导多能干细胞,“细胞”研究成果公布不久，一直对胚胎干细胞研究持反对意见的美国白宫迅速发表声明，对这一新成果表示欢迎。似乎是受到了“鼓舞”，美国科学家在这一领域迅速跟进。紧接着美国怀特黑德生物医学研究所的科学家利用“细胞”治疗老鼠的镰状细胞血症获得进展，这是科学界利用“细胞”进行医疗研究的首次尝试。美国哈佛大学科学家又宣布直接从志愿者身上提取皮肤细胞，并将其改造成了“细胞”。,日本是这场竞争的领跑者,日本媒体报道说，围绕干细胞医疗应用的国际竞争必将加剧，因此日本政府对“细胞”表现了极大的热情，希望抓住这样一个能够提高日本科研竞争力的良机。日本文部科

25、学省决心整合全国的干细胞研究力量，在京都大学设立“细胞”研究中心。文部科学省日决定明年投入亿日元（美元约合日元），未来年共计投入亿日元，全力支持“细胞”研究。,竞 争,在“细胞”研究成果正式公布之前，世界第一只体细胞克隆动物多利羊的培育者、英国苏格兰爱丁堡大学教授伊恩威尔莫特就宣布放弃人类胚胎干细胞克隆研究，转而进行“细胞”研究，他认为这种细胞比胚胎干细胞更具潜在优势。其他不少国家的政府和科学家也都认识到了“细胞”的应用前景，并积极地参与到有关的研究竞争中来。这是造福人类的竞争，在这场竞争中没有“失败者”，受益的应该是全人类。,新方向,诱导方法：（1）不转基因而加入蛋白（2）小分子化合物 ip

26、s机制的研究，主要是表观遗传学方面机制的研究ips模型的建立，目前已有的模型为猪、鼠、人的干细胞模型，下一步将扩展为猴子、大熊猫等动物。,iPS 细胞的全能性,中国科学院动物研究所研究员周琪领导的研究组和上海交通大学医学院教授曾凡一领导的研究组共同完成的首次利用iPS细胞（诱导性多能干细胞），通过四倍体囊胚注射得到存活并具有繁殖能力的小鼠，从而在世界上第一次证明了iPS细胞的全能性。,“小小”（Tiny）,小小接过了多利点燃的火炬,研究小组成功培育了27只实验鼠,克隆鼠“小小”三个月大时的照片,1 自我更新的机理，定向分化的机理2 胚胎干细胞建系（尤为人胚胎干细胞）3 治疗性克隆4 胚胎干细胞定向发育成三维器官5 胚胎干细胞移植的安全性问题,胚胎干细胞的重点研究方向,美国胚胎干细胞研究加速,美国解禁干细胞研究 美国首批胚胎干细胞获得“许可证”美联邦政府将继续资助人类胚胎干细胞研究,视 频 6,视 频 7,视 频 8,embryonic stem cells induced pluripotent stem cell,问答1 什么是胚胎干细胞，有何应用价值？2 什么是诱导多能干细胞，有何应用前景？3 如何进行胚胎干细胞的建系？4 请查阅资料，简介胚胎干细胞最新研究进展,翻译并名词解释,下节课：成体干细胞与组织工程,