天然药物化学成分提取分离鉴定方法与技术色谱法.ppt

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1、第二章,提取分离鉴定的方法与技术色谱法,1,碳酸钙（固定相）,色素混合液,石油醚(流动相）,1906年，Tsweet发现色谱分离现象,色谱柱,2,“像光谱中的光线一样，色素混合物的不同组分有规律地排列在碳酸钙柱上而彼此分离。”Tsweet,德国植物学报,1906.,3,柱色谱,薄层色谱,纸色谱,高效液相色谱,色谱法（Chromatography）,一、色谱法在研究天然药物有效成分中的应用：分离混合物精制化合物鉴定化合物,4,二、原理：利用混合物中各成分在固定相和移动相中吸附、分配及其亲和力的差异而达到分离。,色谱的三要素,5,三者相互关系？,按原理不同可分为：吸附色谱法*分配色谱法*离子交换色

2、谱法 凝胶滤过色谱法（分子筛滤过色谱）大孔吸附树脂法 高效液相色谱法（自学）气相色谱法（自学）,6,三、分类：,吸附色谱法*（Adsorption Chromatography),1）原理：利用吸附剂对混合物中各成分分子吸附能力的差异而达到分离的色谱法。,2）分类：物理吸附 化学吸附 半化学吸附,7,8,物理吸附*：化学吸附：半化学吸附：,“相似者易吸附”,避免,氢键形成能力,分子间力，无选择性，可逆。硅胶、氧化铝、活性炭,化学键，选择性较强，常不可逆。硅胶-生物碱碱性氧化铝-黄酮、蒽醌等,氢键，选择性较弱，多可逆。聚酰胺,3）吸附色谱的三要素,9,溶解能力,吸附作用,在液-固吸附色谱中，溶质

3、的保留和分离选择性决定于下列三个因素：,10,11,硅 胶：适用于中性和酸性成分,氧化铝：适用于中性和碱性成分,活性炭：非极性吸附剂,聚酰胺：高分子聚合物,氢键吸附,a、吸附剂（固定相）,12,硅胶（silica）SiO2 XH2O,酸性、亲水性吸附剂。,结构：内部-硅氧交联结构多孔结构范德华力 表面-有硅醇基氢键吸附,适用于中性或酸性亲脂性成分的分离。,13,特性：1）极性吸附剂，“相似者易吸附”物质极性，吸附能力 2）吸水失活 105110OC烘干30分钟(可逆失水)吸附力最大 500OC烘干(不可逆失水)活性丧失，无吸附力,注意：活化温度不宜高，不宜分离碱性物质。,氧化铝（alumini

4、um oxide）,极性吸附剂，最适于分离植物中的碱性或中性的亲脂性成分。有酸性、碱性和中性三种规格。吸附特性与硅胶类似，但碱性氧化铝不宜分离酸性物质。,14,聚酰胺（polyamide）结构：-CH2-CO-NH-n原理：氢键吸附学说,15,酰氨基与化合物（羟基、羧基及醌基）形成氢键吸附。,16,用途：分离黄酮类、酚类、醌类、有机酸类及鞣质。,影响吸附强弱的因素：1、流动相：水甲醇或乙醇丙酮氯仿稀氨水甲酰胺;2、分子结构：a、形成氢键数目多，吸附能力强。b、形成分子内氢键，吸附力减弱。C、芳香化合物中，共轭双键多，吸附牢。,化合物结构对聚酰胺吸附作用的影响,形成氢键的数目,成键基团位置,双键

5、的数目,分子内氢键,17,课本第33页,活性炭（activated carbon）,非极性吸附剂，对非极性物质具有较强的亲和力，在水中对溶质表现出强的吸附能力。从活性炭上洗脱被吸附的物质时，溶剂的极性越小，洗脱能力越强。,18,特别适合水溶性物质的分离。,b、溶 剂（移动相）,遵循“相似相溶”及“相似者易吸附”原理：极性吸附剂，溶剂的介电常数愈大，洗脱能力愈强；非极性吸附剂，溶剂的介电常数愈大，洗脱能力愈弱。,c、被分离物质,遵循“相似相溶”及“相似者易吸附”原理：对于极性吸附剂而言：被分离成分极性大，吸附牢，难以洗脱；被分离成分极性小，吸附力弱，容易洗脱。,19,四、操作方式,1、薄层色谱法

6、（TLC）*定义：将吸附剂均匀的铺在平板上，把要分离分析的样品点加到薄层色谱板上，然后用适当的溶剂系统展开，在一定的条件下显色或直接在日光或紫外光下观察所获得的斑点，从而达到分离、分析、鉴定的目的。,20,1）薄层色谱的吸附剂和支持剂：,在选用吸附剂或支持剂时，一般是根据被分离物质的化学性质来选用。当不了解被分离物质的化学性质时，可以先选用最常用的硅胶或氧化铝，如果分离效果不好，可再改用其他的吸附剂或支持剂。,21,常用的硅胶吸附剂,粒径：200-300目种类：硅胶G硅胶+粘合剂煅石膏 硅胶GF254含有荧光物质 硅胶H 不含粘合剂煅石膏 硅胶HF254 含有荧光物质,22,常用的展开剂,正己

7、烷、环己烷、四氯化碳、甲苯、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、丙酮、乙醇、甲醇、水,23,理想的溶剂应能使混合物分离后各组分的Rf值相差尽可能大，且尽量在之间。,当单一溶剂不能很好地展开各组分时，常选择用混合溶剂作为展开剂。,2）薄层色谱的一般操作,a、制板b、活化c、点样d、展开e、显色f、计算比移值,24,操作技术手工铺板,取一份吸附剂和三份水（或另加黏合剂），在研钵中向一个方向研磨混合成均匀糊状（无气泡和结块），均匀涂布在薄层板上。,玻璃板,层析专用玻璃板，清洗干净,用量,1020cm，3g硅胶,黏合剂,0.30.8%CMC-Na溶液，,干燥,水平台面，室温下自然完全晾干,检查,表面光滑平整，均匀

8、，无杂质,操作要点,25,涂布后的薄层先在室温下阴干，至完全干透后，在使用前置适当温度烘烤一定时间进行活化，然后置干燥器中备用。硅胶 105-110 30-60min氧化铝 105-110 30min,26,操作技术点样,定量微升毛细管,薄层点样毛细管,配制样品的溶剂具高度挥发性和尽可能非极性，否则易使斑点扩展。采用多次点加法，第二次点加时应待前一次点加的溶剂挥发后再进行。点样量应适中，过载会引起斑点拖尾，分离度变差。,（15ul）,27,点样示意图,样品溶液的配制,点样,28,C、展开,薄层色谱的展开方式有上行、下行、单向、双向、多次、径向等多种方式。多数采用直线形上行展开，薄层板水平角度以

9、75 为最佳。,29,展开剂要接触到吸附剂下沿，但切勿接触到样点（0.5cm左右高度）。盖上盖子，展开。观察展开情况。取出薄层板,30,预防 边缘效应,操作技术显色,显色喷雾瓶,三用紫外灯,观察方法：日光、荧光、显色。,31,本身带有荧光,荧光斑点,32,定义：样品经色谱分离后，某成分从原点至该成分斑点中心的距离与从原点至展开剂前沿的距离的比值称为该成分的比移值（Rf值）。原点至色谱斑点中心的距离 比移值（Rf值）原点至展开剂前沿的距离,33,操作技术测定比移值,Rf值越大，化合物的极性？,34,上样量大，常用于制备分离，是分离天然化学成分最常用的方法。,定义：柱色谱是一种将分离材料装入柱状容

10、器中,以适当的洗脱剂进行洗脱而使不同成分得到分离的色谱方法。,2、柱色谱*,35,其原理、吸附剂及洗脱剂的选择与薄层色谱法相同。操作步骤：注意点：上柱的样品须经过纯化处理（过滤、萃取、脱色、沉淀等）,36,1）装柱,实验室常用的柱内径与柱长之比通常为1:151:20。若柱粗而短，则分离效果较差。若柱过长而细，分离效果虽好，但流速慢，消耗时间太长。,37,a、干法b、湿法：因湿法装柱容易赶走硅胶内的气泡，故一般以湿法装柱较好。,38,2）上样,39,a、样品易溶于洗脱剂：湿法上上样,b、样品难溶于洗脱剂：干法上样,将样品溶解于少量洗脱剂，制成高浓度溶液后慢慢上柱。,将样品溶解于少量甲醇或丙酮后，

11、均匀拌入适量吸附剂（1:2-1:3），水浴挥干溶剂。均匀平铺至柱子顶端。,梯度洗脱：洗脱剂极性从小到大。洗脱剂液面高度始终要高于柱面。控制洗脱剂流速为匀速。有色成分收集各色带洗脱液。无色成分则采用等分收集。浓缩洗脱液，薄层检识后合并相同流分。混合 成分则进一步分离。,3）洗脱,40,植物色素分离图示,41,42,分配色谱法是以液体做固定相，用与其不相混溶的的溶剂做流动相的液-液色谱法。,一、基本原理,利用被分离成分在固定相和流动相中的溶解度不同。易溶于流动相的成分，移动速度快。易溶于固定相的成分，移动速度慢。,分配色谱法*（Distribution Chromatography）,溶解能力,竞

12、争,在液-液分配色谱中，溶质的保留和分离选择性取决于其在固定相和流动相中的溶解度：,43,溶解能力,二、分配色谱中的固定相和流动相固定相：被支持剂固定的溶剂。流动相：与固定相不相混溶的另一相溶剂。,44,-固体-液体-液体,三、支持剂（载体、担体）在分配色谱中起到支持和吸着一定量固定相的作用，本身无吸附作用。要求：不与被分离成分反应。不溶于两相溶剂中。常用支持剂：含水硅胶、硅藻土、纤维素、滤纸,45,适用范围：正相分配色谱：亲水性成分和弱亲脂性成分反相分配色谱：强亲脂性成分,根据固定相和流动相相对极性大小不同：1、正相分配色谱 极性：固定相流动相2、反相分配色谱 极性：流动相固定相,46,四、

13、分配色谱的类型,1、正相分配色谱：支持剂：硅胶等（硅胶吸水超过17，不作 吸附剂，而作为载体）固定相：强极性溶剂，如水、缓冲液等流动相：氯仿、乙酸乙酯等弱极性亲脂有机溶剂洗脱规律：,47,？,极性小成分极性大成分,-先洗下-后洗下,2、反相分配色谱：支持剂：硅胶、纤维素粉、滤纸等 固定相：亲脂性极性小的有机溶剂，可用石蜡油、反相硅胶RP-18、RP-8、RP-2 流动相：水或甲醇等强极性溶剂洗脱规律：,48,？,极性大成分极性小成分,-先洗下-后洗下,表2、分配色谱的类型,49,50,五、操作技术,1、分配柱色谱法先将支持剂和固定相拌匀抽滤，除去多余的固定相将含有固定相的支持剂倒入流动相中饱和

14、湿法装柱洗脱用的流动相在使用前用固定相溶剂饱和,51,2、分配薄层色谱法支持剂：惰性物质固定相：支持剂吸附的溶剂流动相：事先要用固定相饱和装置及操作同吸附薄层色谱，区别在于制板用的是支持剂不是吸附剂。,3、纸色谱法（PC）系以纸为载体，以纸上所含水分为固定相，用展开剂进行展开的分配色谱。支持剂：滤纸（纤维素）固定相：水流动相：水饱和有机溶剂,52,用作微量分析，特别适合于亲水性较强的成分。化合物极性越小，Rf值越大；极性越大，Rf值越小。,53,纸色谱与薄层色谱装置,离子交换色谱法（Ion exchange chromatography）,基本原理：离子交换树脂上有可解离的阳离子或阴离子基团，

15、能可逆性的与被分离成分上的离子基团发生交换，使混合成分中离子型与非离子型物质或具有不同离解度的离子化合物得到分离。操作方式：柱色谱,54,固定相：离子交换树脂（高分子化合物）,球形颗粒，不溶于水，可在水中溶胀,离子交换基团,强酸性阳离子交换树脂结构图,适用范围：分离具有解离能力的酸性、碱性及两性化合物，如生物碱、有机酸、酚酸、氨基酸等。,56,离子交换树脂的种类（功能基团）：,阳离子交换树脂：强酸性（-SO3-H+）弱酸性（-COO-H+）阴离子交换树脂：强碱性（-N+（CH3）3Cl-）弱碱性（-NH2OH，-NH-，-N=）,被分离物质带负电荷,被分离物质带正电荷,水提液中酸性、碱性、两性

16、化合物的分离,凝胶过滤色谱法（Gelpermeation chromatography）,原理：分子筛。固定相：凝胶（具多孔网状结构）葡聚糖凝胶（sephadex G）羟丙基葡聚糖凝胶（sephadex LH-20）流动相：水或有机溶剂,58,59,适用范围：分离分子量大小不同的化学成分，如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、甾体等。,洗脱顺序：分子量大的化合物先流出。,大孔吸附树脂色谱,基本原理：利用大孔树脂具有吸附性和分子筛作用，使天然药物中相对分子量大小及吸附力强弱不同的化学成分得以分离。,60,61,固定相：大孔吸附树脂,高分子聚合物多孔网状结构不含交换基团,吸附能力：分子间作用力 氢键分子筛

17、作用：多孔性质,特点,原理,62,应用：苷类、皂苷、生物碱、萜类、黄酮等大分子化合物的分离。洗脱规律和洗脱过程与普通吸附色谱相似：对极性吸附剂来说，成分极性越大，越难洗脱；洗脱剂的极性越大，越易洗脱。,一、高效液相色谱法 在经典柱色谱法基础上发展起来的一种具有高效、快速、高灵敏特点的色谱分离方法。,63,其他色谱法,高效液相色谱的原理与一般液相色谱十分相似，样品的分离取决于其在流动相和固定相中的分配。特点是使用高压输液泵进行洗脱，并配备有紫外等检测系统，使分离达到高速化和高效化。,二、气相色谱法流动相：气体固定相：液体或固体基本原理：利用化学成分在气体与固定相之间吸附能力不同或分配系数不同的差异而分离的色谱分离方法。适用范围：沸点低、易挥发的挥发油类成分。,64,思考题,1、薄层色谱中，吸附剂、被分离物质及溶剂三者之间的关系如何？2、聚酰胺分离下列黄酮类化合物时（以MeOH为溶剂），最先洗脱下来的是（）,65,3、根据不同性质的化学成分，用连线选择与其相适应的色谱分离方法：氧化铝吸附柱色谱法 分子量大小不同的化合物凝胶滤过柱色谱法 碱性亲脂性化合物聚酰胺吸附柱色谱法 黄酮类化合物离子交换色谱法 酸性亲脂性化合物硅胶吸附柱色谱法 离子性化合物,66,谢谢！,67,