大肠杆菌的乳糖操纵子.ppt

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1、大肠杆菌的乳糖操纵子,一、什么是操纵子模型,操纵子模型认为：一些功能相关的结构基因成簇存在，构成所谓的多顺反子（polycistron)，它们的表达作为一个整体受到控制元件（control element)的调节。控制元件由启动子、操纵基因（operator）和调节基因组成。调节基因编码调节蛋白，与操纵基因结合而调节结构基因的表达。如果调节基因编码的蛋白质与操纵基因的结合是阻遏基因的表达，这样的调控就称为负调控（negative control），相应的调节蛋白被称为阻遏蛋白（repressor);如果调节基因编码的蛋白质与操纵子基因的结合是激活基因的表达，这样的调控被称为正调控（positi

2、ve control），相应的调节蛋白被称为激活蛋白（activator）。,二、乳糖操纵子的负调控,大肠杆菌的乳糖操纵子是第一个被阐明的操纵子。早在20世纪50年代，Jacob和Monod就开始研究大肠杆菌的乳糖代谢，集中研究乳糖对乳糖代谢酶的诱导（introduction）现象：如果供大肠杆菌生在的培养基中没有乳糖，那么细胞内参与乳糖分解代谢的三种酶，即-半乳糖苷酶（-galactosidase）、乳糖透过酶（lactosepermease）和巯基半乳糖苷转乙酰酶很少，如每个细胞的-半乳糖苷酶的平均含量只有0.55个。可是一旦在培养基中加入乳糖或某些乳糖的类似物，则在几分钟内，每个细胞中的

3、-半乳糖苷酶分子数量骤增，可高达5000个，有时甚至可占细菌可溶性蛋白的5%10%。与此同时，其他两种酶的分子数也迅速提高。由此可见，新合成的-半乳糖苷酶、透过酶和乙酰化酶由底物乳糖或其类似物直接诱导产生，乳糖及其相关类似物被称为诱导物。,二、乳糖操纵子的负调控,Franois Jacob,Jacques Monod,二、乳糖操纵子的负调控,如图：加入乳糖以后，1min内出现lac mRNA，稍后即产生-半乳糖苷酶和透过酶。当移去乳糖之后，lac mRNA总量立即下降，两种酶的活性却由于蛋白质半衰期较长而在相当长的时间内维持稳定,二、乳糖操纵子的负调控,二、乳糖操纵子的负调控,-半乳糖苷酶主要

4、催化乳糖分子内-糖苷键的水解，生成半乳糖和葡萄糖，还催化少量乳糖变成别乳糖的异构化反应，它由lacZ基因编码；透过酶是一种跨膜运输蛋白，负责将培养基中的乳糖运输到胞内，由lacY基因编码；乙酰化酶可催化乙酰基从乙酰辅酶A转移到-半乳糖苷上，由lacA基因编码，但其功能尚不知晓，因为缺乏乙酰化酶的突变体仍然可以利用乳糖。还有一种变体对诱导物没有反应。遗传作图表明上述变体的突变位点靠近lacZ、lacY和lacA，被命名为lacI。,二、乳糖操纵子的负调控,为了确定这几种基因的关系，Jacob和Monod使用含有lacI、lacZ、lacY和lacA的F-质粒创建了部分二倍体的大肠杆菌，并进行了一

5、系列互补实验，其中下图的两种突变对于操纵子模型的最终建立起了决定性的作用。,二、乳糖操纵子的负调控,乳糖操纵子的调控模型,二、乳糖操纵子的负调控,乳糖操纵子的调控模型主要内容：,1）乳糖操纵子由调节基因、启动子、操纵基因和三个结构基因组成，其中调节基因、启动子、和操纵基因构成控制元件，共同控制结构基因的表达。操纵基因位于启动子和结构基因之间，其核心结构是一段长位21bp的回文序列。5 ATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAA33 TACAACACACCTTAACACTCGCCTATTGTTAAAGTGTGTCCTT5,二、乳糖操纵子的负调控,2)调

6、节基因lacI编码阻遏蛋白，它独立表达，但由于是弱的启动子和终止子，阻遏蛋白在细胞内总是被维持在较低的浓度；3）阻遏蛋白位四聚体蛋白，由四个相同的亚基组成。在无乳糖的情况下，它与操纵基因lacO结合而阻断RNA聚合酶启动结构基因的转录，但这种结合并不完全，因此会有微量的-半乳糖苷酶、乳糖透过酶和巯基半乳糖苷转乙酰酶的合成。,二、乳糖操纵子的负调控,4）一旦高浓度的乳糖进入细胞，在细胞内残留的-半乳糖苷酶催化下，一部分乳糖被异构化，变成别乳糖。而别乳糖作为别构效应物与阻遏蛋白结合，改变阻遏蛋白的构象，使其不能再与操纵基因结合，于是操纵子被打开；5）RNA聚合酶与启动子结合，启动三个结构基因的转录

7、，产生lacZ、lacY和lacA的共转录物，但翻译却是独立地进行，从而产生三种不同的酶；6）由于阻遏蛋白与操纵基因的结合阻断结构基因的表达，因此，乳糖操纵子受到它的负调控；7）发生在控制元件内的突变可影响到结构基因的表达。,二、乳糖操纵子的负调控,他们都是高效诱导物，他们都不是半乳糖苷酶的底物，是一种人工合成的乳糖类似物，能够迅速和持续地刺激乳糖操纵子结构基因的表达，它本身不能被降解，所以称他们为安慰性诱导（gratuitous inducer）.,三、乳糖操纵子的正调控,乳糖操纵子除受到阻遏蛋白的负调控以外，还受到一种被称为分解物激活蛋白（catobolite activator prot

8、ein,CAP)的正调控。正调控是在对大肠杆菌中出现的葡萄糖效应（glucose effect)进行的研究中发现的。葡萄糖的存在能够阻止大肠杆菌对其他糖类的利用，这种现象称为葡萄糖效应。1965年，B.Magasonik等发现在大肠杆菌中也含有cAMP，而且它的浓度与葡萄糖浓度呈负相关。cAMP浓度的变化与腺苷酸环化酶的活性直接相关联，即高浓度的葡萄糖抑制腺苷酸环化酶的活性而导致cAMP浓度的下降。,三、乳糖操纵子的正调控,人们通过大肠杆菌细胞膜的cAMP类似物-双丁酰cAMP加入到含有葡萄糖和乳糖的培养基中，结果发现乳糖操纵子被诱导，乳糖能够被利用了。这就说明cAMP浓度的升高是细胞能够利用

9、乳糖的前提。人们发现两类不能利用其他糖类的大肠杆菌突变体：一类突变体的腺苷酸环化酶基因有缺陷，因此在任何情况下都不能合成cAMP；另一种突变体缺乏一种能够与cAMP结合的蛋白，即cAMP受体蛋白CRP或CAP，这种突变体在加入外源的cAMP后也不能利用乳糖。这说明cAMP是通过CAP起作用的。,三、乳糖操纵子的正调控,通过科学家的不懈努力我们终于知道：CAP由2个相同的亚基组成，每1个亚基含有209个氨基酸残基，有2个结构域，1个在N端，含有结合cAMP位点，另一个在C端，含有螺旋-转角-螺旋，负责与DNA结合。CAP必须与cAMP结合以后才有活性，一般只要结合一个cAMP就完全被激活。当cA

10、MP与CAP结合以后，CAP的构象发生变化，致使其C端的螺旋-转角-螺旋采取合适的取向，从而能够识别DNA上的结合位点。,三、乳糖操纵子的正调控,使用DNA酶-足印法得到了CAP-cAMP与DNA结合的特异性位点，由26bp组成，位于乳糖操纵子的启动子紧靠35区域的上游，其一序列是一段不完善的回文序列TGTGA-N6-TCACA,该位点被称为CAP位点。CAP-cAMP与CAP位点的结合可导致周围的DNA产生小的弯曲，致使自身能够与RNA聚合酶全酶的亚基的羧基端相互作用，从而有利于RNA聚合酶与启动子的结合以及DNA双螺旋的局部解链，最终促进了下游基因的转录。,四、乳糖操纵子双重调控的意义,乳糖操纵子之所以要受到双重调控，有两个原因：一是使细胞能够优先利用葡萄糖，而优先利用葡萄糖对细胞来说是有益的，因为参与葡萄糖分解的基因均是持家基因，这样葡萄糖可以迅速的被分解，为细胞提供能量；第二个原因是lac启动子序列与启动子的一致序列相差较大，是一个弱启动子，而CAP-cAMP的激活就弥补了其启动子活性的先天不足。,