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1、赛泰 CytoReact宫颈内皮不典型增生(Dysplasia)的预后标志物美国爱迪旺斯医疗科技责任有限公司,宫颈癌的筛查与防治,世界范围内，宫颈癌是第二大妇女常见肿瘤，每年新发病例接近50万。宫颈癌的致死率在西方国家因为细胞学筛查的发展得以检测出宫颈内皮癌前病变而显著下降。Precursor cervical intraepithelial neoplasia(CIN).,宫颈癌世界范围流行病学和发病率统计,细胞学检测,巴氏涂片是老的宫颈筛查标准，通常要求在21岁后或性活动3年后的每年作一次检查。液基细胞学的开展增加了宫颈癌的筛查的敏感性，另外还能在此片基础上非常方便地进行人乳头瘤病毒(HP

2、V)的检查。,美国的细胞学筛查现状,每年约5千万6千万的妇女进行宫颈细胞学检查。宫颈细胞学检测结果异常的妇女每年约300500万。每年新诊断的宫颈癌病例约12200例。每年有约4100人死于宫颈癌。,宫颈癌与HPV,绝大多数(几乎100%)的宫颈癌均由于人乳头瘤病毒(HPV)的感染，病毒通过性传播感染宫颈细胞而缓慢引起宫颈内皮细胞的不典型增生(dysplasia)，而这种变化可能引发宫颈细胞癌变。绝大多数轻、中度的不典型增生并不发生恶性改变，甚或出现病情完全逆转。大而深的不典型增生(重度不典型增生)则更倾向进展为癌。妇女感染HPV的时间通常在十几岁到三十几岁之间，而宫颈癌的发生则通常发生在HP

3、V感染后的20年。早期的原位宫颈癌是可以治愈的，而随后的侵袭性宫颈癌则通常都是致命性的。,人乳头瘤病毒(HPV),人乳头瘤病毒(HPV)为高特殊种群选择性病毒，人类是目前所知道的唯一病毒宿主，即使在实验室条件下也不感染其他种类。人乳头瘤病毒为不全封闭式病毒。外围由对称的72个小体组成的外壳环绕着由8000个碱基对组成的双链环形DNA。人乳头瘤病毒即便在没有宿主的寒冷的条件下也能独立存活数个月。,HPV病毒的复制,HPV病毒在感染人类细胞后有两种复制方式：第一种为以将HPV病毒DNA整合到宫颈基底细胞DNA的固定复制方式；和第二种的以HPV病毒DNA独立存在于具有快速增生特性的上皮细胞核内的寄生

4、性的流动式的复制方式。尽管病变组织内的所有细胞都含有HPV基因，HPV基因的是否表达却与病毒的成熟程度紧密相关。大多数的HPV病毒基因在侵犯基底细胞之前都处于失活状态。,HPV感染的病毒基因附加和病毒基因整合,在如包括HPV6型和HPV11型等良性和低危HPV感染的病例中，HPV的环形基因组在细胞核内以独立于宿主细胞DNA的形式出现。在如包括HPV16型和HPV18型等高危型HPV感染的病例中，HPV的基因组在细胞核内整合到宿主细胞DNA上。HPV病毒基因与宿主细胞DNA整合，是癌变发生的主要标志。,HPV感染的病毒基因附加和病毒基因整合,From Beutner,KR et al,Human

5、 Papillomavirus and Human Disease.Am J Med 1997;102(5A):9-15.,癌前病变,侵袭性宫颈癌,尖锐湿疣,人乳头瘤病毒的入侵方式,From Lowy&Schiller,J Clin Invest 116:1167-73,2006,From Lowy&Schiller,J Clin Invest,116:1167-73,2006,宫颈癌发生的病变进展过程,不同器官HPV感染致癌机会分布图,全球HPV感染统计,1524岁美国人每年性传播疾病统计(每十万例),HPV-DNA分型,通常有两种HPV DNA检测方法，包括II型杂交捕获(HCII)和PC

6、R(酶联反应)酶免疫吸附分析。两种方法都有类似的高敏感性和相关检测HPV的仪器设备，尤其适用于宫颈内皮瘤变(CIN)后的HPV DNA跟踪。HPV DNA检测通常与细胞学联合或单独应用于不确定性宫颈鳞状上皮非典型改变(ASC-US)的病例，另外也对已确立CIN诊断的病例有所帮助。,foot warts,mucosal,cancer-associated,handwarts,genital warts,由HPV引起的各种不同增生性疾病,EV cutaneous,mostly asymptomatic,HPV16,HPV6,HPV11,HPV18,致癌性HPV分类,高危型:16,18,31,33,

7、35,39,45,51,52,56,58,59,63,78,82可能高危型:26,53,66低危型 6,11,40,42,44,54,61,70,72,81,宫颈癌HPV分型的地理分布特点,Vaccine,Vol 24 Supplement 3,2006.2006 Elsevier Limited.All rights reserved.Chapter 03,Figure 1,世界范围内各类HPV导致宫颈癌的病例百分比,0.2,0.5,0.5,0.7,0.7,0.8,1.1,1.8,2.5,3.4,3.5,3.7,4.4,15.8,54.6,0,10,20,30,40,50,60,HPV-82

8、,HPV-68,HPV-73,HPV-39,HPV-51,HPV-56,HPV-59,HPV-35,X HPV-52,X HPV-58,HPV-31,HPV-45,X HPV-33,HPV-18,HPV-16,94.8,94.6,94.1,93.6,92.9,92.2,90.8,89.7,87.9,85.4,82.0,78.5,74.8,70.4,54.6,META-ANALYSIS OF 14,500 CASES,CUMULATIVE%,Estimates adapted from Smith JS,et al.Br J Cancer,Submitted.,HPV感染的自限性,除非是长期的持

9、续性感染和经深部创伤的HPV感染，绝大多数的HPV感染因为免疫系统的自动清除功能而都是短暂的，但如下妇女免疫功能异常者例外：服用激素类药物器官移植化疗药物艾滋病(HIV)世界范围内，每年有6.3亿的HPV个体感染者，平均感染期限为8个月，80%的感染在一年之内被清除 而呈持续感染达两年以上的病例仅有9%。,HPV-DNA分型存在的问题,在以下情况中并无需进行HPV DNA分型的常规检测-经临床组织学确认为生殖器官尖锐湿疣的病人;-经临床组织学确认为 HSIL/CIN III 的病人;-经临床组织学确认为宫颈癌的病人.因为在这些宫颈侵害的病例中，HPV呈阳性的机率几乎为100%。但真正发生癌变的

10、病例仅低于9%。HPV DNA分型存在着广泛的假阳性型交叉反应，如HPV16与HPV16相关型(31,33,52,58,35);HPV18与HPV18相关型(45,59,39,68)之间的交叉反应。,HPV感染后的自然组织学演变过程,Tumor antigen,Tumor antigen,宫颈内皮不典型增生(Dysplasia)的临床处理,尽管许多 宫颈内皮不典型增生(Dysplasia)的病例毋需治疗也能自行消退，但临床上几乎所有的 宫颈内皮不典型增生(Dysplasia)的妇女都被采取了治疗措施，因为我们无法预见哪一个CIN将发生癌变或自行消退。A.G.Ostol&Koji Matsumo

11、to.这样，如果能够建立一种预测Dysplasia是否将发生癌变或自行消退的标志物，将非常有助于减少非必要的治疗和治疗相关的并发症。,宫颈内皮不典型增生(Dysplasia)的过度诊断与过度治疗,无论细胞学检测或HPV-DNA检测都不能预测HPV感染后是否将趋于自愈或进展为癌，因此检测出的不典型增生造成了包括医生和病人在内的疑惑和忧虑，从而导致了不必要的或/和过度治疗。目前，临床上CIN病例最”过分“的处理标准是对所有可疑病灶立即进行阴道镜检查并活检。这种过分的处理手段不仅增加了经济负担而且还会增加例如死亡等的并发症，关键在于大多数的CIN病例因为其”自限性“的特点并不急需这样的处理。每年，数

12、百万的妇女因为对处理标准的疑惑和焦虑而被实施了包括组织活检、冷冻、电烧、激光、外科手术甚或接受了免疫调节制剂和细胞毒性制剂类药物。全球范围内每年因宫颈细胞学检查异常而实施的阴道镜检查约900万例，其中仅有低于20%的病例被证实为宫颈癌前病变或宫颈癌。而因HPV检查呈阳性所进行的阴道镜检查，仅2%的病例被证实为宫颈癌前病变或宫颈癌。,我们需要更好的筛检系统,一些国家为了能使筛检系统更成功和更有效，他们已经开始重新设计新的筛检系统 这些国家已经制定了目的在于降低因细胞学检查所造成的假阴性率的联合筛检战略。一些国家已经在如何能够找到一些能预测CIN愈后的细胞形态学或分子生物学特性的方法上取得了卓有成

13、效的进展。,CytoReact赛泰,唯一通过美国FDA注册的最新HPV L1广谱筛检试剂盒;唯一能够快速检测 宫颈内皮不典型增生(Dysplasia)自行消退的预后标志物;唯一能够正确指导临床是否进行阴道镜检查的金标准。,HPV病毒在宿主细胞内的成熟过程,“裸核”HPV病毒在宫颈浅表细胞浆内合成L1、L2壳蛋白后演变为具有“活性”的HPV成熟病毒。L1蛋白为HPV病毒的主要结构蛋白，L2蛋白为次要结构蛋白。每个病毒含72个由L1、L2组成的壳蛋白单位，而每个壳蛋白单位含5个位于外围的L1蛋白和一个位于中心的L2蛋白每个成熟HPV病毒共含360个L1蛋白和72个L2蛋白。,L1,L1,L1,L2

14、,L1,L1,世界范围内的研究热点聚焦：L1蛋白介导的免疫外科(LMI)反应对HPV病毒清除作用,Andrew H.Lichtman et al.Cellular and molecular immunology.5 edition,2005(chapter 17).(USA)Koji Matsumoto et al.Cancer Letter 231(2006)309-313.IgG antibodies to HPV 16,52,58 and 6 L1-capsides and spontaneous regression of cervical intraepithelial neopl

15、asia.(University of Tokyo)Leticia Rocha-Zavaleta et al.Journal of General Virology(2004),85.2643-2650.Detection of antibodies against a human papillomavirus(HPV)type 16 peptide that differentiate high-risk from low-risk HPV-associated low-grade squamous intraepithelial lesions.(Mexico City,Mexico)S.

16、Habedank et al.192 Detection of active human papilloma virus infection by immunohistochemistry.(Berlin,Germany)D.Jenkins et al.J Clin Pathol 1987;40;1212-1216.Routine papillomavirus antigen stainning of cervical punch biopsy specimens.(Whittington Hospital,London)Pierre Lecann et al.Journal of Clini

17、cal Microbiology.May 1995.1380-1382.Detection of antibodies against human papillomavirus(HPV)type 16 virus by enzyme-linked immunosorbent assay using recombinant HPV 16 L1 capsids produced by recombinant baculovirus.(Tours,France)Alves et al.High-risk papilomavirus capsid protein(L1)-immunohistochem

18、istry and potential use in clinical practice.(Germany),世界范围内的研究热点聚焦：L1蛋白介导的免疫外科(LMI)反应对HPV病毒清除作用,Melsheimer et al.;2003;Acta cytologica,47,124-128;Immunocytochemical detection of HPV High risk type L1 capsid proteins in LSIL and HSIL as compared with detection of HPV L1 DNA.(Germany)Griesser et al.;

19、2004;AQCH,Vol.26,No.5;241-245,Correlation of immunochemical detection of HPV L1 capsid protein in Pap smears with regression of High risk positive mild/moderate dysplasia.(Germany)Prmer et al.,J.Fertil Reprod.4/2004,Nachweis produktiver HPV _ Infektionen am zytologischen Routine-Abstrichprparat.(Ger

20、many)Griesser et al.;gynkol.prax.28,58-59(2004),HPV Nachweis bei Verdacht auf zervikale Dysplasie.(Germany),人体对HPV病毒感染不同梯次的免疫防御反应,人体对HPV病毒感染器官的保护呈现不同梯次的免疫防御反应，而且每阶次的免疫反应特异性逐次递增。宫颈复层上皮细胞是防御病原体-HPV病毒侵袭的第一道防线，同时阴道分泌的包含-防御素和酸质在内的粘液性抗微生物蛋白形成了另一道化学防线。而精液所含的防御素和锌也能杀死阴道内的HPV病毒。如果病原体-HPV病毒突破了第一道生理防线,免疫系统即刻开始

21、发生作用，尽管这种免疫抵御HPV病毒的作用只是非特异性的和短暂的,但通过免疫-补体系统和免疫-吞噬细胞系统所完成的对HPV病毒能否被快速免疫清除却是至关重要的。,免疫-补体系统,炎症反应是免疫系统用于清除感染病原体的第一反映，而因HPV病毒感染则不出现类似的炎症反应而能得以逃过炎症反应的一击。成功进入人体的HPV病毒尽管没有遭到炎症反应的攻击，但免疫系统会识别进入表层细胞的HPV病毒而激活具有快速杀伤功能的的补体系统。这种识别和激活信号会迅即放大而引起一系列补体蛋白酶参与的HPV病毒体蛋白的裂解。随着补体蛋白酶与HPV病毒体的结合同时还能激活其他一些蛋白酶而形成对HPV病毒的联合式攻击。这种连

22、锁反应式的激活系统是通过接受正反馈信号来完成的，连锁反应的结果是在病原体HPV病毒的周围吸引、聚集了大量的免疫细胞而杀死病原体，同时使周围血管的通透性增加、并在病原体表面贴附调节素来协助杀伤HPV病毒。另外，补体还能通过直接干扰HPV病毒感染细胞的胞浆膜来直接杀死被感染细胞。,免疫-吞噬细胞系统,树突状细胞、吞噬细胞和巨噬细胞能够识别HPV病原体，并通过直接接触或吞噬反应来吞噬并杀死HPV病毒。这些免疫细胞还能激活随后发生的继发性免疫反应。,巨噬细胞已经识别了被HPV感染的细胞(大的、棘状细胞)，在与被感染细胞融合后，巨噬细胞将注射毒素来杀死被感染细胞。,T细胞免疫系统,继发性 T细胞免疫反应

23、不仅具有免疫记忆功能，同时免疫力度也增强了。T细胞免疫反应是具有抗原特异性的免疫反应，在免疫表达过程中 T细胞免疫系统能够识别特异性的外来抗原。,辅助性T细胞(CD4/CD8)与I/II类主要组织相容性复合物(MHC)和抗原(红色)的相关性,杀伤性T细胞直接对其他细胞的杀伤,HPV感染后免疫反应发生的序列时间表,哪里才是HPV感染后免疫反应所攻击的靶位？,宫颈癌相关抗原-HPV L1抗原,以上所有近期的研究结果均证实：宫颈局部的细胞免疫清除反应是在控制HPV病毒感染和逆转不典型增生起着最主要作用，而体液免疫在HPV病毒感染的控制上仅处于次要作用。HPV病毒感染所诱导的具有型特异性的细胞免疫反应

24、主要直接攻击HPV病毒上的主要结构蛋白L1壳蛋白，L1壳蛋白是公认的免疫反应攻击HPV病毒和病毒感染细胞的主要靶位。HPV L1抗原是宫颈癌相关抗原(TAA)，绝大多数的HPV病毒感染细胞在宫颈癌细胞形成之前都将成为HPV L1抗原表达细胞而受到细胞/体液免疫的攻击。细胞毒性T细胞和辅助性T细胞能够识别这些HPV L1抗原表达细胞而直接攻击或激发特异性的辅助T细胞I/II来杀死这些HPV L1抗原表达细胞而完成免疫清除功能(Immuno-surveillance and Immuno-clearance)。,HPV L1抗原细胞的表达,HPV L1抗原为核蛋白抗原，L1蛋白在宿主浅表细胞胞浆内

25、形成后即快速进入基底层细胞的细胞核(恶性HPV感染)或快速增生的浅表细胞的细胞核内(良性HPV感染)。所以当HPV L1 抗原染色时，只有细胞核的染色。单体L1壳蛋白将在宿主细胞核的核膜上形成辅助性T细胞(CD4/CD8)与I/II类主要组织相容性复合物(MHC)。但并不是所有的L1抗原位点都能结合抗体，这种结合情况要依赖于宿主细胞的细胞核核膜的结构破坏程度(如棘状核膜)、被HPV病毒感染细胞的进展程度和宿主本人的免疫能力。辅助性T细胞(CD4/CD8)与I/II类主要组织相容性复合物(MHC)的形成是“开”/“关”式的反应，一个单一的复合物即会激活免疫联锁反应并在局部形成高浓度的免疫细胞。,

26、免疫清除与免疫逃逸,免疫清除(低危型HPV病毒感染和绝大多数高危型HPV病毒感染)的途径为：途径 I:补体、吞噬细胞的直接吞噬、杀伤途径 途径 II:辅助T细胞-CD4-II类主要组织相容性复合物(MHC)-抗原表达细胞 途径 III:细胞毒性T细胞-CD8-I类主要组织相容性复合物(MHC)-HPV感染细胞免疫逃逸(低于20%的高危型HPV病毒感染)发生主要因为：1.慢性或持续性HPV感染引起细胞免疫反应疲惫(immunoresponse fatigue)或 免疫力不足(inadequate);2.宿主细胞的细胞核核膜的结构遭到破坏(如棘状核膜);3.HPV病毒感染细胞出现快速有丝分裂造成L

27、1壳蛋白数量出现快速递减。,Doorbar,J Clin Virol 32:7-15,2005,随着病变的进展HPV L1表达逐渐消失,Virus Producing,Non-productive,Non-productive,Decreasing Epithelial Differentiation,HPV L1抗原表达,FIG.1.Cellular localization of L1 and L2 proteins in CIN II lesions induced by HPV33.,HPV L1抗原表达与宫颈病变程度的反比关系,Reactive changes,x200,ASCUS,

28、favor reactive,x200,LGSIL(mild dysplasia),x200,HGSIL(CIN III),x200,Squamous cell carcinoma,x200,Cervical Cells Progression Pass way,HPV L1 Antigen Expression,HPV L1抗原在细胞核内的表达,CytoReact-TissueTM,CytoReact-CellTM,(DAB 染色),(AEC 染色),HPV感染宫颈细胞的免疫清除与免疫逃逸反应图解,CD8 Cell,细胞毒性T细胞,APC,CD4 Cell,辅助T细胞,B Cell,浆细胞,

29、抗体,IL-2,IL-4,IL-5,IL-2,Class I MHC,Class II MHC+TCR,HPV 病毒,HPV L1 壳蛋白,吞噬细胞系统,MHC=主要组织相容性复合物APC=抗原表达细胞TCR=T-细胞受体,吞噬细胞系统的 L1 抗原表达细胞,免疫逃逸的癌细胞,HPV病毒感染引起宿主细胞核发生棘突状改变，使T细胞免疫系统失去L1结合位点,Ig M,T细胞系统的 L1 抗原表达细胞的免疫清除,HPV感染细胞,Th-2,Th-1,APC,浅表细胞,基底细胞,通过宫颈深层微小创伤引起HPV感染所发生的免疫逃逸图示,通过宫颈深层微小创伤引起HPV病毒将直接感染基底细胞，在同一细胞内完成

30、病毒壳蛋白形成到细胞核内转运的过渡，从而减低了病毒被清除的机会。,由L1肿瘤相关抗原所激发的对HPV病毒的免疫清除效果图,病情自动逆转,赛泰 临床指标,细胞学检测 HPV L1检测,(-)(-),细胞学检测阴性;HPV感染阴性,(-)(+),细胞学检测阴性;HPV感染阳性 预后良好,(+)(+),(+)(-),细胞学检测阳性;HPV感染阳性 预后较好;建议行阴道镜检查,细胞学检测阳性;HPV感染阳性 预后较差;立即行阴道镜检查,细胞学检测 HPV L1检测,细胞学检测 HPV L1检测,细胞学检测 HPV L1检测,赛泰 诊断特异性和敏感性,诊断特异性:赛泰与宫颈细胞学联合筛查其诊断特异性 95%诊断敏感性:-85%的轻、中度不典型增生(dysplasia)病例赛泰检测将呈阳性;-20%的重度不典型增生病例赛泰检测将呈阳性;-低于1%的宫颈癌病例赛泰呈阳性.,赛泰检测1,赛泰 检测2,宫颈细胞学与HPV L1 赛泰 联合筛检,Cytology Test,HPV,宫颈不典型增生,宫颈癌,宫颈癌预防的新战略 宫颈细胞学与HPV L1 赛泰 联合筛检,Currently:,Future:,Thanks to Mark Schiffman and Phil Castle,NCI,赛泰检测 3,HPV DNA Test(option),不再有忧虑和疑惑！不再有过度诊断和过度治疗！,