蛋白质的一级结构.ppt

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1、2.6.1 一个氨基酸的-COOH与另一个氨基酸的-NH2缩合脱去一分子水形成的酰胺键叫作肽键；氨基酸以肽键结合形成的化合物称作肽。,2.6 氨基酸彼此以肽键结合形成链状多肽,肽键,二肽,这种缩合作用可反复进行，形成二肽、三肽、寡肽及多肽；肽链中一个氨基酸单位称为一个氨基酸残基(residue)，一个氨基酸残基较游离氨基酸少一个水分子（末端除外）,平均分子量110；肽链的大小可用所含氨基酸残基的总数表示或相对分子质量表示，大多数天然多肽含50200个氨基酸残基，相对分子质量在5,500220,00之间；,2.6.2 肽链是有方向性的(directional),肽链的一端有游离氨基，称氨基末端（

2、或N末端 N-terminal），另一端有游离羧基，称羧基末端（或C末端 C-terminal)；肽链写法：游离-氨基在左，游离-羧基在右，氨基酸之间用“”表示肽键。,如：H2N丝氨酰亮氨酰苯丙氨酸-COOH写为：,Ser-Leu-Phe,（或 S-L-F）,前述五肽：丝氨酰-甘氨酰-酪氨酰-丙氨酰-亮氨酸,写为：Ser-Gly-Tyr-Ala-Leu,（或 S-G-Y-A-L）,H2N-,-COOH,肽键,缩合,2.6.3 所有肽链的共价主链结构都是相同的,肽链中的骨架结构是由 单位重复连接而成，称共价主链（main chain or backbone)；,不同肽链的区别在于侧链R基的排列顺

3、序不同；,相同的氨基酸组成可形成多种不同的多肽链,问题1：每种肽链都有相同的分子骨架，试分析多肽分子骨架有哪些结构特征？,问题2：写出这一肽链的结构和名称,这四种氨基酸还可以组成几种寡肽？,2.6.4 肽链末端羧基、末端氨基及侧链基团可发生不同程度的解离，表现出重要的理化性质,在pH114范围内，主链上肽键氨基不发生解离，游离末端的-COOH和-NH2以及侧链R上的基团可发生不同程度的解离；各基团解离程度及肽所带的总电荷取决于所处溶液的pH值；对于指定的基团，其pHpKa时，不发生酸式解离，pHpKa时，发生酸式解离，pH=pKa时，解离与不解离各占一半，由此可确定肽链所带净电荷.,问题3：肽

4、链中可解离基团的（-COOH，-NH2 及侧链可解离基团）pKa与游离氨基酸中对应基团的pKa值有何不同？为什么？,问题4：丛肽链的组成与结构分析多肽有哪些主要性质？,肽具有等电点，调节溶液pH值可改变肽的带电状况，使肽不带电荷而处于等电状态时的pH值为肽的等电点肽等电点的差别可不同程度反映其氨基酸组成上的差异；反之亦然。等电状态时，肽在电场中不向任何一方移动不同大小的肽片断可用双向凝胶电泳进行分离肽链中的解离基团可被滴定，但 肽的滴定曲线复杂短肽以离子晶体存在，具有较高的熔点肽键上的基团具有相应的化学反应活性。,2.6.5 许多短肽具有重要的生物活性 天然存在的活性肽,作为神经递质、神经激素

5、或神经调节物；如LHRH-类10肽(蛙的一种神经递质)，促甲状腺素释放因子，脑啡肽，内啡肽，强啡肽等作为抗体：短杆菌肽A，短杆菌肽S等；作为激素：胰岛素、胰高血糖素、促肾上腺皮质激素等；作为防御性毒物：剧毒的鹅膏蕈碱、蛇毒、蛛毒等,体内许多激素属寡肽或多肽,促甲状腺素释放激素TRF,焦谷氨酸 组氨酸 脯氨酰胺,谷胱甘肽（glutathione，GSH）,L-天冬氨酰-L-苯丙氨酰甲酯，称作：aspartame,2.7.1 多肽与蛋白质的概念不完全相同The term protein broadly defines molecules composed of one or more polype

6、ptide chains;The term polypeptide is used to define the chain exceeds several dozen amino acids in length(less than 50 amino acid residues);The terms polypeptide and protein are used interchangeably in discussing single polypeptide chain.问题5：试简述蛋白质的重要生物学功能？,2.7 蛋白质是由一条或几条多肽链组成的具有特定空间结构和功能的生物大分子,2.7.

7、2 根据蛋白质的组成、或含多肽链数目或形状可对蛋白质进行不同的分类,单纯蛋白质(simple protein),辅基种类很广，常见的有色素化合物、寡糖、脂类、磷酸、金属离子甚至核酸,根据组成不同蛋白质可分为,根据蛋白质形状可分为球状蛋白与纤维状蛋白：,肌动蛋白,毛发中的角蛋白,蚕丝丝心蛋白,根据含多肽链数目可分为单体蛋白和多体蛋白,寡聚蛋白中的每一个具三级结构的多肽链称亚基(subunit),应用：由于胶体溶液中的蛋白质不能通过半透膜，因此可以应用透析法将非蛋白的小分子杂质除去;,2.8.1 多数球状蛋白质溶于水形成胶体溶液,蛋白质溶胶性质：a.质点大小在胶体范围：1100nm b.丁达尔效应

8、c.布朗运动d.不能透过半透膜,2.8 根据蛋白质的结构和性质特点可对蛋白质进行分离鉴定,蛋白质胶体溶液的稳定性与它的分子量大小、所带的电荷和水化作用有关。,破坏蛋白质胶体的稳定因素，将促使蛋白质沉淀析出,蛋白质处于PI时，净电荷为零。溶解度最低不同蛋白质等电点不同 调节pH值将蛋白质彼此分开,等电点沉淀和pH控制:,随着盐浓度的升高，如饱和或半饱和时，蛋白质溶解度逐渐降低，相互聚集而从水溶液中沉淀析出，这种现象叫盐析。解释：大量中性盐的加入，使水的活度降低，原来的溶液中的大部分自由水转变为盐离子的水化水。降低蛋白质极性基团与水分子间的相互作用，破坏蛋白质分子表面的水化层。常用的中性盐：（NH

9、4)2SO4特点：保持蛋白质的天然构象蛋白质分离、提纯常用方法。,2.8.3 加入大量中性盐可使蛋白质沉淀析出低浓度时，中性盐可增加蛋白质的溶解度，即盐溶原因：蛋白质分子吸附盐类离子后，带电层使蛋白质分子彼此排斥，且与水分子相互作用加强；,2.8.4 有机溶剂分级分离法：,作用原理：有机溶剂的加入改变了介质的介电常数，增加了两个相反电荷之间的吸引力，蛋白质的表面可离解基团的离子化程度减弱，水化程度降低，蛋白质分子聚集沉淀。有机溶剂与蛋白质争夺水化水，致使蛋白质聚集体形成并沉淀。,2.8.5 离子交换层析,原理：样品中各蛋白质组分的净电荷、分子大小不同，与固定相间的作用力不同而被分离洗脱方法：改

10、变洗脱剂的盐浓度、PH值依次洗脱结合力小的蛋白质先由层析柱中洗脱出来分离效果与溶液中的离子强度、pH有关常用固定相：离子化纤维素羧甲基纤维素（CM），二乙基氨基乙基(DEAE)纤维素优点：具有松散的亲水性网状结构，及较大的表面积，大分子可以自由通过交换容量大,洗脱条件温和,回收率高。离子化葡聚糖交联葡聚糖作基质优点：交换容量比离子交换纤维素大34倍。,Cation-exchangecolumn,pH=5.0时，基质带负电荷蛋白组分带不同电荷,逐渐提高洗脱液的pH值，各组分以此被洗脱下来问：洗脱顺序？,即分子排阻层析（也称凝胶过滤层析，分子筛层析）,2.8.6 凝胶过滤：,原理：凝胶颗粒内部为多

11、孔的网状结构。当不同分子大小的蛋白质混合物流经凝胶层析柱时，比凝胶网孔大的分子不能进入珠内网状结构，而被排阻在凝胶珠之外。随着溶剂在凝胶珠之间的孔隙向下移动并最先流出柱外；比网孔小的分子能不同程度的自由出入凝胶珠的内外。不同分子大小路径不同洗脱：大分子-先洗脱出来 小分子-后洗脱出来,2.8.7 亲和层析,基础：基于蛋白质所具有的生物学特异性。（它与另一种称配基的分子能特异而非共价的结合）,蛋白质样品加入到连有配基的基质中（固定相）目标蛋白质与配体结合，吸附在琼质糖颗粒上 其它蛋白质先被洗脱下来 结合在基质上的蛋白 可用由配体溶液洗脱,Affinitychromatography,对某一种蛋白

12、质来说，在某一pH时，它所带的正电荷与负电荷恰好相等，即净电荷为零，这一pH称蛋白质的等电点。pHpI时，蛋白质带净负电荷，电场中移向正极pHpI时，蛋白质带净正电荷，电场中移向负极 pH=pI时，蛋白质不带静电荷，电场中不移动。,2.8.8 利用蛋白质的带电性可对蛋白质进行电泳分离,非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,蛋白质在(PAGE)介质中电泳时，其迁移率,聚丙烯酰胺凝胶系统中加入SDS和少量巯基乙醇,SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法：,则电泳迁移率主要取决于其相对分子质量(q/r），而与电荷和分子形状无关。,SDS为阴离子，多肽链覆盖上相同密度的负电荷超过蛋白质原有的电荷量，因而掩盖了不同种类蛋白质间

13、原有的电荷差别。因此，所有SDS-蛋白质复合物，电泳时均以同样的电荷/分子质量比向正极移动。改变了蛋白质单体分子的构象。SDS-蛋白质在水溶液中长椭圆棒，短轴直径均为1.8nm,长轴长度则随蛋白质的分子量而成正比例地变化。可用来测量蛋白质的分子量,区带电泳：外加电场时，蛋白质混合物在具有pH梯度的介质中移向并聚焦（停留）在等于其等电点的pH处，形成区带。,测定蛋白质含量的常用方法：凯氏定氮法：紫外吸收法双缩脲法：Folin-酚试剂法（Lowry法）：考马斯亮蓝法（现最常用的方法）：胶体金法：带负电的疏水胶体，洋红色，遇蛋白质变蓝色，灵敏度最高,蛋白质具有多个结构层次：一级结构二级结构、三级结构

14、、四级结构 生物功能蛋白质的一级结构指多肽链中氨基酸的排列顺序也称共价结构。共价肽键是一级结构的唯一连接方式多肽链一级结构决定着蛋白质的高级结构和功能,2.9 蛋白质一级结构的测定即蛋白质多肽链中氨基酸序列的测定,高级结构,测定蛋白质分子中多肽链的数目；拆分蛋白质分子中的多肽链；测定多肽链的氨基酸组成；分析多肽链的N末端和C末端（方法很多）断裂多肽链内的二硫键；多肽链断裂成肽段；测定各个多肽段的氨基酸顺序；确定肽段在多肽链中的次序；确定原多肽链中二硫键的位置。,蛋白质一级结构测定策略,测得相对分子质量Mr 很多方法可用于确定蛋白质的相对分子量，如：渗透压、扩散系数、沉降系数凝胶过滤、凝胶电泳等

15、，测定末端氨基酸数x X(m/Mr)=n(蛋白质分子中肽链数目)（m为样品质量）,变性：8mol/L尿素或6mol/LHCI，或高浓度盐溶液如有二硫键交联：巯基乙醇，或过氧乙酸处理凝胶过滤或电泳分离不同肽链,蛋白质中多肽链的拆分,蛋白质中多肽链数目的确定,多肽链的拆分,氨基酸组成分析,酸水解：碱水解：甲基磺酸水解：优点：不破坏色氨酸，经碱中和后可直接上机自动分析缺点：不能有碳水化合物存在 中和点不易掌握计算出各种氨基酸分子比多肽链分子量,确定氨基酸组成,末端氨基酸分析,N末端氨基酸分析丹黄酰氯法(DNS)：优点：可直接层析或电泳分离，荧光检测定性定量；灵敏度高(较二硝基氟苯 法高100倍)二硝

16、基氟苯(DNFB or FDNB)法 氨肽酶法,+HCI,弱碱性,+DNS-氨基酸,酸水解,游离氨基酸,有机溶剂萃取,溶于水,定量+定性,确定N末端氨基酸,确定肽链数目,DNS-氨基酸,将肽链裂解成小片断,要求：断裂点较少，专一性较强、产率高酶裂解法：常用的酶：胰蛋白酶：仅断裂Lys、Arg羧基形成的肽键（但）糜蛋白酶：位点：Tyr、Phe、Trp羧基肽键 胃蛋白酶：位点：两种疏水性氨基酸形成的肽键 嗜热菌蛋白酶：专一性较差 金黄色葡萄球菌蛋白酶（Glu蛋白酶）：梭状芽孢杆菌蛋白酶（Arg蛋白酶）：化学裂解法：溴化氰法：专一性断裂蛋氨酸羧基形成的肽键,可得到合适大小的肽片断,Cyanogen

17、bromide(溴化氰法）,肽段氨基酸序列的测定,Edman降解法：一次可连续测定6070个氨基酸；程序复杂，工作量大；酶降解法：质谱法：,Edman 降解法测定N-末端氨基酸,Edman reagent,PTC-多肽,少一个N-末端氨基酸的肽链,层析色谱鉴定,重复,与DNS法联合,肽片断在多肽链中排列次序的确定(见p179),多肽链中二硫键位置的确定,多肽链氨基酸系列的直接测定：最初于1954年由英国剑桥大学的Sanger实验室建立；现主要由编码蛋白质的基因的核苷酸顺序推导.蛋白质序列数据库美国生物医学基金会的PIR(Protein Information Resource or Prote

18、in Identification Resource);美国政府的Gen Bank(Gene Sequence Data Bank)欧洲的EMBL(European Molecular Biology Laboratory Data Bank)（欧洲分子生物学实验室数据库）可从“Altas of Protein Sequence and Structure”(蛋白质序列和结构图册）中查找,同源蛋白质：生物体内行使相同或相似功能的蛋白质。如脊椎动物的氧运载蛋白，真核生物线粒体中的电子传递蛋白等均为同源蛋白。系列同源性(sequence homology)：同源蛋白的氨基酸序列具有明显的相似性，即具有系列同源性。具有几乎相同的肽链长度；在许多对应位置具有相同的不变残基；氨基酸残基差异数与物种亲缘关系远近成正比可以同源氨基酸差异数反应物种亲缘关系蛋白质的一结构是其形成特定三级结构和行使特定功能的基础,2.10 同源蛋白具有序列同源性(sequence homology),Ancestral cytochrome c and Human cytochrome c,Cytc系统树,